基于16srdna和wsp基因的中國和韓國和美國的杉木氏果蠅種群感染wolbacha的比較研究

基于16srdna和wsp基因的中國和韓國和美國的杉木氏果蠅種群感染wolbacha的比較研究

wolbacia是一個廣泛存在于四肢體內(nèi)的共生菌，通過母系顆粒遺傳（wrryietal.，2008）。Wolbachia檢測常用的基因有16SrDNA,ftsZ和wsp(Machtelinckxetal.,2012)。根據(jù)不同的基因,在系統(tǒng)進(jìn)化上將Wolbachia分成A～H組,其中侵染昆蟲綱的主要是A組和B組(O’Neilletal.,1992;Zhouetal.,1998)。Wolbachia可調(diào)控宿主生殖方式,直接影響宿主生物學(xué)(Serbusetal.,2008)。Wolbachia的感染還可能影響宿主種群適合度或宿主種群生態(tài)學(xué),如研究發(fā)現(xiàn)外來種入侵種群的Wolbachia感染率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于原產(chǎn)地種群的感染率,入侵種群的成功入侵可能與逃避Wolbachia的負(fù)面影響有關(guān)(Shoemakeretal.,2000;Tsutsuietal.,2003;褚棟等,2005a,2005b)。鈴木氏果蠅DrosophilasuzukiiMatsumura(又稱斑翅果蠅)屬雙翅目(Diptera)果蠅科(Drosophilidae)果蠅屬Drosophila,該蟲最早于1916年在日本發(fā)現(xiàn)(孫鵬等,2011)。在中國的已報道的黑腹果蠅D.melanogaster種組67種果蠅中,鈴木氏果蠅是分布面積最廣泛的種類之一,它分布于中國東部和南部22個省市自治區(qū)(錢遠(yuǎn)槐等,2006)。該蟲主要危害草莓、櫻桃、葡萄等水果,與其他果蠅為害腐熟果實或落果不同,鈴木氏果蠅可取食收獲之前未完熟的果實(Leeetal.,2011)。鈴木氏果蠅雌性成蟲在櫻桃等水果有損傷的部位產(chǎn)卵,孵化后的幼蟲迅速污染整個果實,使果肉變軟松散,還容易導(dǎo)致產(chǎn)卵部位的再次污染,造成爛果,嚴(yán)重影響了櫻桃等水果的產(chǎn)量(Leeetal.,2011)。近年來,鈴木氏果蠅傳入到北美和歐洲等地區(qū)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,成為這些地區(qū)破壞性極大的入侵害蟲(Boldaetal.,2010)。據(jù)報道該蟲對美國經(jīng)濟(jì)水果造成的損失率高達(dá)80%(Drevesetal.,2009),歐洲和地中海植物保護(hù)組織以及美國、澳大利亞、新西蘭等先后對該蟲發(fā)布預(yù)警或?qū)⑵淞腥霗z疫性有害生物名單中(孫鵬等,2011)。在2012年8月韓國大邱召開的第24屆國際昆蟲學(xué)大會上(XXIVInternationalConferenceofEntomology),“鈴木氏果蠅生物學(xué)與控制”(Biologyandcontrolofspottedwingdrosophila,Drosophilasuzukii)被單獨作為一個學(xué)術(shù)專題進(jìn)行討論,可見鈴木氏果蠅的危害已引起了許多昆蟲學(xué)家與植物保護(hù)學(xué)家的廣泛關(guān)注。鑒于Wolbachia對宿主的生物學(xué)與生態(tài)學(xué)影響,我們的初步研究發(fā)現(xiàn)鈴木氏果蠅國內(nèi)種群感染該菌。為了進(jìn)一步揭示鈴木氏果蠅體內(nèi)Wolbachia感染特點,本研究利用Wolbachia的16SrDNA和wsp基因特異引物(分別為16S-F/16S-R和81F/691R)對鈴木氏果蠅7個地理種群(中國的5個種群、韓國的1個種群和美國的1個種群)的Wolbachia進(jìn)行了PCR檢測并對檢測結(jié)果進(jìn)行了比較;對感染個體體內(nèi)Wolbachia的16SrDNA基因片段進(jìn)行測序,確定了我國鈴木氏果蠅體內(nèi)Wolbachia的分類地位。這些結(jié)果為研究Wolbachia感染對鈴木氏果蠅生物學(xué)及生態(tài)學(xué)的影響奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1周延甲、周延甲和日本愛國國家的種群本研究中果蠅成蟲分別采自中國山東泰安、山東威海、浙江溫州、陜西西安、云南紅河的5個種群,韓國首爾的1個種群以及美國加利福尼亞州的1個種群(表1)。樣品采回后,參照Steck等(2009)方法先進(jìn)行室內(nèi)形態(tài)鑒定并在-20℃條件下低溫保存。1.2應(yīng)用組織/細(xì)胞基因組dna快速提取試劑盒單頭果蠅是在1×TE(Tris-EDTA,pH8.0)緩沖液中冰浴勻漿,應(yīng)用組織/細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒(北京博邁德生物技術(shù)有限公司)提取基因組DNA(具體提取過程按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作)。提取的DNA樣品取3～4μL通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳來檢測質(zhì)量,檢測合格后保存于-20℃?zhèn)溆谩?.3pcr擴(kuò)增及測序本研究采用Wolbachia的16SrDNA和wsp基因特異引物(分別是16S-F/16S-R、81F/691R)標(biāo)記來檢測果蠅是否被Wolbachia感染,以超純水代替模板DNA為陰性對照。引物序列(Heddietal.,1999)如下:16S-F:5′-CGGGGGAAAAATTTATTGCT-3′,16S-R:5′-AGCTGTAATACAGAAAGTAAA-3′;wsp-81F:5′-TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC-3′,wsp-691R:5′-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3′;PCR擴(kuò)增總體系是25μL,其中包含2.5μLPCRbuffer,0.5μLdNTPs,上下游引物各0.5μL(10μmol/L),Taq酶0.25μL(北京全式金生物技術(shù)有限公司),DNA模板3μL,ddH2O17.75μL。PCR反應(yīng)程序為:95℃預(yù)變性3min,35個循環(huán)(94℃變性30s,55℃退火1min,72℃延伸1min),72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物每個樣品各取5μL,用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小、純度及亮度,并用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄,2個基因產(chǎn)物的目的片段長度均為600bp左右。如有目的帶,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序。1.4srdna分析感染W(wǎng)olbachia的所有種群中,每個種群挑選3頭被感染個體DNA進(jìn)行PCR產(chǎn)物測序,得到15條16SrDNA序列。將測序結(jié)果拼接后在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST(/Blast.cgi)搜索,以確保獲得的序列片段為16SrDNA基因的序列片段。從GenBank基因數(shù)據(jù)庫中檢索所有果蠅的共生菌Wolbachia的16SrDNA序列并下載。同時,用DNAman軟件對同源基因進(jìn)行比對得到相似性分析,尋找不同的Wolbachia感染品系。使用MEGA5.0(Tamuraetal.,2011)基于Kimura’s-2-parameter模型計算序列間的遺傳距離,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,系統(tǒng)樹各分支的置信度(bootstrap)均進(jìn)行1000次重復(fù)檢驗。2結(jié)果分析2.1srdna基因目的片段的檢測和感染率本研究分別用16SrDNA和wsp兩個基因檢測了我國5個種群以及美國和韓國2個種群的果蠅共計188頭個體(表1)。我們發(fā)現(xiàn)所有個體都沒有檢測到wsp基因,而有78頭個體檢測到16SrDNA基因目的片段,除浙江溫州與山東泰安種群外,其他地區(qū)的雌蟲中Wolbachia的感染率都比雄蟲中的感染率低,平均感染率為41.5%(雌、雄個體感染率分別為38.8%和44.4%)。在我國鈴木氏果蠅種群中個體感染率為54.6%,其中我國山東泰安和浙江溫州果蠅體內(nèi)的Wolbachia感染率超過50%(分別是74.1%和80.0%),但在美國和韓國2個種群中并沒有檢測到Wolbachia感染。2.2wolbachia菌16srdna的聚合酶鏈反應(yīng)將所有16SrDNA序列進(jìn)行BLAST搜索,以確保所測序列是Wolbachia的16SrDNA基因序列。通過DNAman人工校對截取569bp長度的序列,比對分析發(fā)現(xiàn),這15條序列堿基組成是相同的,即沒有發(fā)現(xiàn)變異位點,也就是僅有1種單倍型,將該序列提交GenBank(登錄號為KC287134)。用于系統(tǒng)發(fā)育分析的Wolbachia16SrDNA序列是來自本研究自測序列和從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的相關(guān)物種感染的Wolbachia的16SrDNA基因序列(表2),通過MEGA5.0軟件采用NJ鄰接法對這些序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)(圖1),來自中國的這15條相同的序列(GenBank登錄號:KC287134)被聚類在WolbachiaA組里(bootstrapscore=100%),并且與感染黑腹果蠅Drosophilamelanogaster株系(Greece-Dmel)、果蠅Drosophilasechellia株系(USA-Dsec)、擬果蠅Drosophilasimulans株系(USA-Dsim;Hawaii-Dsim)(GenBank登錄號分別為Z28983,U17059,X64264和X64265),以及感染寄生蜂倉蛾姬蜂Venturiacanescens(France-Vcan)、Redivivasaetigera(Africa-Rsae)和Odontosemaanastrephae(USA-Oana)的Wolbachia菌(GenBank登錄號分別為JX399793,HM111618和JX182384)聚在一個分支上。其中,值得一提的是,本研究所得到的Wolbachia菌的16SrDNA的序列與來自美國洛杉磯的擬果蠅D.simulans感染株系(GenBank登錄號為X64264)和夏威夷擬果蠅D.simulans感染株系(GenBank登錄號為X64265)(Roussetetal.,1992)的16SrDNA序列完全一致。使用最大相似度法(maximum-likelihoodtree,ML)和最小進(jìn)化法(minimum-evolution,ME)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果相似。3wolbachia為基礎(chǔ)的感染傳播資料表明,Wolbachia在許多果蠅如黑腹果蠅D.melanogaster、擬果蠅D.simulans中均有感染(Venetietal.,2012),而鈴木氏果蠅體內(nèi)檢測到Wolbachia則是首次報道。研究中我們發(fā)現(xiàn)Wolbachia在中國5個種群的平均感染率為54.6%,而在美國、韓國的2個種群未檢測到該菌。據(jù)我們分析,造成美國入侵種群Wolbachia感染率低的原因可能有以下幾點:檢測樣本的數(shù)量有限(30個);入侵種群的瓶頸效應(yīng)或奠基者效應(yīng),美國種群可能來自于未感染或感染率低的種群。韓國種群Wolbachia感染率低的原因可能是采集種群有限或者種群確實沒有感染該共生菌所致。如果美國入侵種群沒有(或具有較低)Wolbachia的感染率,那么美國鈴木氏果蠅可能逃避了Wolbachia的感染,這種逃避Wolbachia感染后種群適合度及其生態(tài)學(xué)效應(yīng)如何,是否逃避Wolbachia的負(fù)面影響有利于種群密度的上升或種群的入侵(Shoemakeretal.,2000;Tsutsuietal.,2003;褚棟等,2005a,2005b),這些問題尚需進(jìn)一步的研究。Wolbachia的傳遞方式主要為垂直的母系傳播(Hoffmannetal.,1990),該菌在節(jié)肢動物不同宿主間也能夠借助宿主擬寄生物的寄生作用進(jìn)行水平傳播(Jiggins,2002;Baldoetal.,2006)。目前,已知的水平傳播的途徑有3條,分別是:(1)在同種宿主不同個體間的水平傳播;(2)在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的昆蟲間的水平傳播;(3)昆蟲與其他節(jié)肢動物之間的水平傳播(董鵬和王進(jìn)軍,2006)。Wolbachia在我國5個鈴木氏果蠅種群內(nèi)的感染率比較高,感染種類比較單一(均屬于A組),與來自美國夏威夷和洛杉磯的擬果蠅D.simulans的Wolbachia16SrDNA序列堿基一樣,和感染其他果蠅的Wolbachia菌也有較高的核苷酸相似性。鈴木氏果蠅的Wolbachia菌與其他果蠅的Wolbachia菌的16SrDNA有如此高的相似性,與其他物種Venturiacanescens,Redivivasaetigera和Odontosemaanastrephae在進(jìn)化樹上共享一個支系的現(xiàn)象,推測可能是與該菌的第2種水平傳播方式有關(guān):即Wolbachia在一種宿主體內(nèi)感染之后,可能通過擬寄生物做紐帶,被攜帶到另一種宿主體內(nèi)傳播擴(kuò)散。這就產(chǎn)生了宿主間的譜系與其體內(nèi)共生菌的品系在系統(tǒng)分類上不一致的現(xiàn)象(RigaudandJuchault,1995)。同樣道理,毛里求斯果蠅感染的Wolbachia(Mauritius-Dmau)與其他果蠅感染的該菌不在同一支的現(xiàn)象,可能是由于毛里求斯果蠅感染的Wolbachia(Mauritius-Dmau)與其他物種存