乳酸脫氫酶同工酶聚丙酰胺凝膠電泳法分離法 完整版_第1頁
乳酸脫氫酶同工酶聚丙酰胺凝膠電泳法分離法 完整版_第2頁
乳酸脫氫酶同工酶聚丙酰胺凝膠電泳法分離法 完整版_第3頁
乳酸脫氫酶同工酶聚丙酰胺凝膠電泳法分離法 完整版_第4頁
乳酸脫氫酶同工酶聚丙酰胺凝膠電泳法分離法 完整版_第5頁
已閱讀5頁，還剩10頁未讀， 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明：本文檔由用戶提供并上傳，收益歸屬內容提供方，若內容存在侵權，請進行舉報或認領

文檔簡介

乳酸脫氫酶(LDH)同工酶

聚丙烯酰胺凝膠電泳分離法掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理和流程；驗證同工酶理論；了解圓盤凝膠電泳分離乳酸脫氫酶同工酶的方法。

一、實驗目的1.聚丙烯酰胺凝膠的制備和作用

二、基本原理(1)凝膠制備（主要試劑）：丙烯酰胺單體：可聚合成長的直鏈

粉劑有毒，液體無毒甲叉雙丙烯酰胺：為交聯(lián)劑過硫酸銨：催化劑四甲基乙二胺(TEMED)：加速劑

（最后加，并決定凝膠形成的速度）在催化劑作用下，丙烯酰胺單體聚合成長鏈，并通過甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)構成三維網狀結構的凝膠；網狀孔徑大小主要由丙烯酰胺濃度決定；一般是7.5%

濃度↑→孔徑↑(2)凝膠電泳原理：①電荷效應：凝膠網孔對樣品顆粒移動有阻力；阻力大小取決于孔徑與樣品分子量之比分子量越小，阻力越小，移動越快。調pH→偏離蛋白質的pI→蛋白質帶電荷帶電荷蛋白質在均勻電場中移動②分子篩效應：2.乳酸脫氫酶同工酶的分離一組同工酶之間的分子結構不同

↓pI、分子量不同↓電荷效應、分子篩效應不同分子量越小、帶電荷越多，移動越快人體乳酸脫氫酶同工酶移動速率：

LDH1>LDH2>LDH3>LDH4>LDH52.顯色原理LDH催化的酶促反應；PMS：吩嗪二甲酯硫酸鹽NBT：氯化硝基四氮唑藍通過電泳后的顯色反應，能驗證同工酶的概念（為什么？）

三、操作步驟封口：用帶玻璃珠的膠管套在玻璃管的下端；用小燒杯配制凝膠液：P129（TEMED：加1滴，最后加，加后立即混勻灌注，不能出現凝固）灌注：P129。注入距玻璃管上端2cm處。（不能灌滿；一杯可灌2個柱）待凝固后拔掉下端封口膠管

（水與凝膠界面出現折光分界線，即凝固）1.凝膠柱的制備將凝膠璃管插入上電泳槽底板孔中；上電泳槽底板插滿膠璃管后倒入少量電泳緩沖液，檢查有無滲漏(不能有滲漏)

上電泳槽倒入電泳緩沖液，要淹沒所有玻璃管上端，以及電極絲；下電泳槽倒入電泳緩沖液，要淹沒電極絲；將上電泳槽按放到下電泳槽上，檢查玻璃管下端有無氣泡(若有，要用水吹掉)2.安裝電泳槽血清樣品液含溴酚藍：電泳指示劑蔗糖：增加樣品液比重取50ul樣品液，加入凝膠玻璃管上端；

3.加樣4.電泳電壓250V，時間60min；（電泳溫度不能過高，否則酶變性）待溴酚藍移動接近玻璃管下端出口時，斷電；

P129（要避免凝膠條斷裂）5.剝膠6.顯色電泳結束前10min配制顯色液：P129（配好后避光，PMS臨染色前再加）酶促反應條件：37℃、20min；漂洗：先用水洗再放入7%醋酸浸泡脫色

四、結果繪畫出電泳結果標注：正負極LDH同工酶類型溴酚藍

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明，都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等，如果需要附件，請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙，網頁內容里面會有圖紙預覽，若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫網僅提供信息存儲空間，僅對用戶上傳內容的表現方式做保護處理，對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯，并不能對任何下載內容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容，請與我們聯(lián)系，我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論