乳酸脫氫酶同工酶聚丙酰胺凝膠電泳法分離法 完整版

乳酸脫氫酶(LDH)同工酶

聚丙烯酰胺凝膠電泳分離法掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理和流程；驗(yàn)證同工酶理論；了解圓盤凝膠電泳分離乳酸脫氫酶同工酶的方法。

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.聚丙烯酰胺凝膠的制備和作用

二、基本原理(1)凝膠制備（主要試劑）：丙烯酰胺單體：可聚合成長(zhǎng)的直鏈

粉劑有毒，液體無毒甲叉雙丙烯酰胺：為交聯(lián)劑過硫酸銨：催化劑四甲基乙二胺(TEMED)：加速劑

（最后加，并決定凝膠形成的速度）在催化劑作用下，丙烯酰胺單體聚合成長(zhǎng)鏈，并通過甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)構(gòu)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠；網(wǎng)狀孔徑大小主要由丙烯酰胺濃度決定；一般是7.5%

濃度↑→孔徑↑(2)凝膠電泳原理：①電荷效應(yīng)：凝膠網(wǎng)孔對(duì)樣品顆粒移動(dòng)有阻力；阻力大小取決于孔徑與樣品分子量之比分子量越小，阻力越小，移動(dòng)越快。調(diào)pH→偏離蛋白質(zhì)的pI→蛋白質(zhì)帶電荷帶電荷蛋白質(zhì)在均勻電場(chǎng)中移動(dòng)②分子篩效應(yīng)：2.乳酸脫氫酶同工酶的分離一組同工酶之間的分子結(jié)構(gòu)不同

↓pI、分子量不同↓電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)不同分子量越小、帶電荷越多，移動(dòng)越快人體乳酸脫氫酶同工酶移動(dòng)速率：

LDH1>LDH2>LDH3>LDH4>LDH52.顯色原理LDH催化的酶促反應(yīng)；PMS：吩嗪二甲酯硫酸鹽NBT：氯化硝基四氮唑藍(lán)通過電泳后的顯色反應(yīng)，能驗(yàn)證同工酶的概念（為什么？）

三、操作步驟封口：用帶玻璃珠的膠管套在玻璃管的下端；用小燒杯配制凝膠液：P129（TEMED：加1滴，最后加，加后立即混勻灌注，不能出現(xiàn)凝固）灌注：P129。注入距玻璃管上端2cm處。（不能灌滿；一杯可灌2個(gè)柱）待凝固后拔掉下端封口膠管

（水與凝膠界面出現(xiàn)折光分界線，即凝固）1.凝膠柱的制備將凝膠璃管插入上電泳槽底板孔中；上電泳槽底板插滿膠璃管后倒入少量電泳緩沖液，檢查有無滲漏(不能有滲漏)

上電泳槽倒入電泳緩沖液，要淹沒所有玻璃管上端，以及電極絲；下電泳槽倒入電泳緩沖液，要淹沒電極絲；將上電泳槽按放到下電泳槽上，檢查玻璃管下端有無氣泡(若有，要用水吹掉)2.安裝電泳槽血清樣品液含溴酚藍(lán)：電泳指示劑蔗糖：增加樣品液比重取50ul樣品液，加入凝膠玻璃管上端；

3.加樣4.電泳電壓250V，時(shí)間60min；（電泳溫度不能過高，否則酶變性）待溴酚藍(lán)移動(dòng)接近玻璃管下端出口時(shí)，斷電；

P129（要避免凝膠條斷裂）5.剝膠6.顯色電泳結(jié)束前10min配制顯色液：P129（配好后避光，PMS臨染色前再加）酶促反應(yīng)條件：37℃、20min；漂洗：先用水洗再放入7%醋酸浸泡脫色

四、結(jié)果繪畫出電泳結(jié)果標(biāo)注：正負(fù)極LDH同工酶類型溴酚藍(lán)