通風發(fā)酵過程中啤酒酵母有機酸動態(tài)變化的檢測

通風發(fā)酵過程中啤酒酵母有機酸動態(tài)變化的檢測

由于酸類物質(zhì)的酸和特殊氣味，對酒的口感影響不大于酯，雖然酸類物質(zhì)不構(gòu)成啤酒，但主要以啤酒為原料的酸、醋酸、柑橘、蘋果酸、琥珀酸和酒石酸。它們之間的類型和含量因細菌和工藝而異。因此，許多科學家在微生物、發(fā)酵菌、機和學的基礎(chǔ)上研究了細胞的代謝變化。不同時間間隔內(nèi)測量的檸檬酸、苯甲酸和其他酸，這了解了不同時代間隔內(nèi)發(fā)酵過程的變化，并從代謝工程的角度實現(xiàn)了母乳喂養(yǎng)化血清素的功能，優(yōu)化了母乳喂養(yǎng)化血清素的生理代謝網(wǎng)絡(luò)，并對優(yōu)化和改變代謝流程具有重要的理論和實踐意義。在這種背景下，作者從研究平臺上出發(fā)，研究了六種主要的酸，它們是不同程度的酒和過程。1材料和方法1.1試驗材料和設(shè)備1.1.1病毒啤酒酵母由大連華潤啤酒廠提供.1.1.2u3000g蔗糖100g,蛋白胨10g,NH4H2PO42g,MgSO4·7H2O492mg,Na2HPO4895.4mg,KH2PO413.610g,CaCl2277.4mg,加去離子水1000mL.1.1.3水膜過濾器和水相色譜儀超高速冷凍離心機(B-22M):ThermoIEC;臺式微波爐(National-NN-K580MFS):上海松下微波爐有限公司制造;0.22μm針筒式水膜過濾器,大連依利特公司制造;高效液相色譜儀(Jasco,Japan);μBondapakC18柱(Jasco,Japan):10μm×φ3.9mm×300mm;預(yù)分離柱:C18填料,Sep-PakC18(S-P柱,國產(chǎn));流動相:0.01mol/LKH2PO3水溶液,pH2.65(磷酸調(diào)節(jié)).用0.45μm孔徑的合成纖維素酯濾膜進行真空超濾,超聲波脫氣20min.1.1.4過濾酸、標準有機酸標準有機酸溶液采用超純水配制,經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后備用.標準有機酸:酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、乙酸和乳酸(色譜純或分析純);超純水:娃哈哈純凈水經(jīng)0.45μm孔徑的合成纖維素酯濾膜進行真空超濾.1.2實驗方法1.2.1接種菌種的制備取新鮮酵母泥樣品在4000r/min離心5min,然后用6℃無菌去離子水反復(fù)洗滌3次后,沉淀酵母泥在無菌條件下接種,接種體積分數(shù)0.6%.在恒溫(20±0.5)℃,轉(zhuǎn)速(210±5)r/min下?lián)u床通風培養(yǎng),每12h取樣檢測.1.2.2ph測量先測量樣液溫度,然后直接用PHS-3C型精密pH計在該溫度檔進行測定.1.2.3糖原測試培養(yǎng)基配比時葡萄糖含量較高,定期測還原糖時稀釋100倍用二硝基苯酚(DNS)法進行測定.1.2.4微波破壁測定取20mL發(fā)酵液,快速于5℃,18000r/min超高速冷凍離心10min.上清液留樣以測酵母細胞胞外有機酸備用,酵母沉淀物用去離子水反復(fù)洗滌離心3次后,10mL水轉(zhuǎn)入50mL小三角瓶中進行微波破壁.1.2.5發(fā)酵破碎液的制備把處理過的待破壁樣品放入微波爐中,破壁采用20s×4間歇式進行.間隔時間以小三角瓶降溫到室溫為宜.破壁完畢后用去離子水恢復(fù)定容到與原發(fā)酵液等體積.然后充分攪拌后靜置30min,以使胞內(nèi)物充分溶出,胞液溶解均勻.破碎液再超高速離心(18000r/min)10min后,上清液存樣以便進行有機酸的HPLC定性定量分析.1.2.6柱溫pa色譜條件:流速為0.7mL/min;監(jiān)測器波長:215nm;柱壓:100kPa;柱溫:室溫;靈敏度:0.04;進樣量:20μL/次.經(jīng)上述18000r/min離心10min后的發(fā)酵液,用一次性無菌注射器(2mL)配合0.22μm的針筒式水膜過濾器直接進樣檢測.2結(jié)果與分析2.1平板腦癱培養(yǎng)期間發(fā)泡液中的ph值和糖質(zhì)濃度的變化2.2乳酸發(fā)酵過程中動態(tài)變化在整個通風發(fā)酵過程中,用HPLC法對酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、乙酸和乳酸等6種有機酸質(zhì)量濃度變化進行8次的定性定量跟蹤監(jiān)測.6種有機酸的動態(tài)變化見圖1和表2.由圖1和表2可以看出,在通風培養(yǎng)條件下,有機酸代謝產(chǎn)生了階段性動態(tài)變化.乳酸幾乎自始至終質(zhì)量濃度最高,發(fā)酵結(jié)束時仍為3.2mg/mL;乙酸一直含量比較少,到發(fā)酵結(jié)束時幾乎檢測不到,這表明通風溶氧效果不錯,酵母進行了正常的有氧代謝.而檸檬酸和琥珀酸的動態(tài)變化比較大,表明酵母對二者的代謝比較活躍,細胞在分泌檸檬酸和琥珀酸時存在經(jīng)濟效能性和精確保守性.結(jié)合孫付保等以及趙長新等人研究的啤酒酵母發(fā)酵過程離子含量動態(tài)變化結(jié)果,離子與啤酒酵母的生理代謝具有相關(guān)性,有機酸動態(tài)變化很可能是離子代謝的綜合性響應(yīng)結(jié)果.發(fā)酵終點時,乳酸質(zhì)量濃度最高,蘋果酸次之,其次為酒石酸、琥珀酸.其中檸檬酸到發(fā)酵終點時幾乎檢測不出.2.3不同酸液中各物質(zhì)量的變化通風發(fā)酵培養(yǎng)過程中,酵母胞內(nèi)有機酸含量變化見圖2.圖2表明:酒石酸、蘋果酸、乳酸和乙酸有著非常相似的動態(tài)走勢,表明酵母細胞內(nèi)4種有機酸的代謝機理基本上是相同的;在發(fā)酵的最后階段,4種有機酸質(zhì)量濃度都表現(xiàn)出不同程度的下降趨勢;酒石酸質(zhì)量濃度下降最多;在發(fā)酵終點時,乳酸和蘋果酸質(zhì)量濃度最高.在整個通風發(fā)酵的過程中,酵母細胞內(nèi)檸檬酸和琥珀酸質(zhì)量濃度變化見表3.表3表明,胞內(nèi)檸檬酸和琥珀酸質(zhì)量濃度很低,幾乎不存在,偶爾存在但很快被代謝.表明在酵母細胞內(nèi),檸檬酸和琥珀酸代謝變化迅速,這2種有機酸的代謝有著嚴格的準確性和經(jīng)濟性.3a循環(huán)途徑—討論在好氧培養(yǎng)條件下,有機酸在胞內(nèi)有著非常相似的動態(tài)變化趨勢,推斷這幾種有機酸可能有著非常親緣性的代謝途徑和生理機制.但胞外有機酸動態(tài)變化有顯著的差異性,這種胞內(nèi)外有機酸的不同走勢很可能與有機酸跨膜運輸能力的差異性有關(guān).從有機酸代謝的終點看,乳酸質(zhì)量濃度最高,其次是蘋果酸,它們大量積累的原因可能是:在胞內(nèi)TCA循環(huán)途徑中它們下游受阻或上游酶活高,而且它們作為碳底物利用效能差,不像檸檬酸、琥珀酸、乙酸等被優(yōu)先再循環(huán)利用;而琥珀酸、酒石酸和檸檬酸似乎是酵母優(yōu)先利用效能最高的有機酸,它代謝變化迅速,酵母代謝的多個階段幾乎檢測不出這些有機酸.可見,酵母細胞對這些有機酸的代謝已達到很精確、很經(jīng)濟的程度.從胞內(nèi)外的研究結(jié)果來看,酵母代謝時同一階段檢測到的胞內(nèi)、胞外有機酸含量差別很大,除了破壁及提取方法的局限性致使有機酸有一定損失外,酵母細胞為了維持胞內(nèi)環(huán)境代謝流的穩(wěn)定性,很可能把產(chǎn)生的有機酸大量分泌到胞外,致使胞外有機酸含量高于胞內(nèi)含量.通風發(fā)酵后期階段,酵母細胞日趨衰老凋亡,以及胞內(nèi)pH值,滲透壓,電化學梯度等因素的改變,導致大量有機酸作為經(jīng)濟性碳底物重新攝入胞內(nèi),從而引起后期階段有機酸含量逐步降低,尤其是檸檬酸、乙酸、琥珀酸等表現(xiàn)得最為明顯.總之,啤酒酵母對某種有機酸的積累,造成不同生理階段、不同種類有機酸含量差異的原因十分復(fù)雜,不僅與代謝途徑的相關(guān)酶系和代謝網(wǎng)絡(luò)有關(guān),還與有機酸跨膜運輸和發(fā)酵后期階段有機酸的分解有關(guān).4發(fā)酵過程酸代謝變化1)通風培養(yǎng)的釀酒酵母代謝產(chǎn)酸時,細胞胞外、胞內(nèi)有機酸的動態(tài)變化存在差異性.2)酵