血必凈注射液對(duì)膿毒癥大鼠免疫功能的影響

血必凈注射液對(duì)膿毒癥大鼠免疫功能的影響

目前，膿毒癥（pi）是重癥監(jiān)護(hù)病房（icu）患者死亡的主要原因。隨著對(duì)膿毒癥致病機(jī)制和宿主對(duì)膿毒癥反應(yīng)基因?qū)W基礎(chǔ)的研究,人們逐漸認(rèn)識(shí)到機(jī)體免疫狀態(tài)紊亂在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。血必凈注射液在臨床應(yīng)用中已取得了良好的效果,本實(shí)驗(yàn)主要觀察血必凈注射液對(duì)膿毒癥大鼠特異性免疫功能的影響。1大鼠血常規(guī)及局部反應(yīng)實(shí)驗(yàn)1.1實(shí)驗(yàn)材料:雄性SD大鼠72只,購(gòu)自北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)中心,體重270～290g;血必凈注射液(天津紅日藥業(yè)生產(chǎn)),左氧氟沙星(北京雙鶴藥業(yè)生產(chǎn));內(nèi)毒素試劑盒(上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司),大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-10(IL-10)試劑盒(均為RapidBioLabCalabassasCalifornia,USA);熒光染料-藻紅蛋白(R-PE)標(biāo)記的小鼠免疫γ球蛋白G1(IgG1)-PE同型對(duì)照,異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD3,PercP標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD8,R-PE標(biāo)記的小鼠抗大鼠γ-干擾素(IFN-γ),R-PE標(biāo)記的小鼠抗大鼠IL-4。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1動(dòng)物模型制備及分組:動(dòng)物在24～26℃室溫的實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)3d以上,按隨機(jī)數(shù)字表法將其分為假手術(shù)組、模型組、左氧氟沙星組和血必凈組,每組18只。每只大鼠于晨8時(shí)給予食物20g,自由飲水。術(shù)前稱重,采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)制備膿毒癥大鼠模型。先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的戊巴比妥鈉4ml/kg腹腔注射麻醉,沿腹正中線作長(zhǎng)1.5cm的切口,在血管弓內(nèi)結(jié)扎末端1/2盲腸;用7號(hào)頭皮針在盲腸上穿通2次,形成盲腸漏,然后將盲腸還納腹腔;10-0絲線逐層縫合腹壁切口,術(shù)畢立即皮下注射林格平衡液50ml/kg抗休克。假手術(shù)組動(dòng)物只行開腹、關(guān)腹與復(fù)蘇,不結(jié)扎與穿孔盲腸。于術(shù)后3、24和72h從腹腔靜脈取血后活殺大鼠,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只,分別留取血液與組織標(biāo)本待測(cè)。1.2.2給藥方法:術(shù)前0.5h給藥1次,以后每日同時(shí)間點(diǎn)給藥1次,劑量為10ml/kg;假手術(shù)組、模型組給等量生理鹽水。1.2.3檢測(cè)指標(biāo)及方法1.2.3.1內(nèi)毒素:動(dòng)物處死前取血清,采用改良的基質(zhì)顯色法檢測(cè)血中內(nèi)毒素水平。1.2.3.2脾淋巴細(xì)胞表面人白細(xì)胞DR抗原(HLA-DR):處死動(dòng)物后無菌取脾臟,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HLA-DR水平。脾細(xì)胞制備及增殖測(cè)定用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)。用完全RPMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整為2×109/L,于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入脾細(xì)胞懸浮液;除陰性對(duì)照孔外,其余各孔均加入終濃度為5mg/L的刀豆素A(ConA),作為陽(yáng)性對(duì)照孔;實(shí)驗(yàn)孔在此基礎(chǔ)上再加入10μl已稀釋的酪蛋白酶解產(chǎn)物;混勻后,將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng);每孔均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。72h后每孔加20μl甲基甲苯基硫-吩嗪硫酸甲酯(MTS-PMS)混合液,37℃顯色4h,用酶標(biāo)儀于520nm處測(cè)定吸光度(A)值。1.2.3.3脾淋巴細(xì)胞天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3):用免疫組化方法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞caspase-3的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá),使用Image-pro軟件分析系統(tǒng)測(cè)定免疫組化的陽(yáng)性面積與陽(yáng)性指數(shù)。caspase-3陽(yáng)性指數(shù)=陽(yáng)性面積×平均A值1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示;方差齊、數(shù)據(jù)成正態(tài)分布者采用方差分析,組間比較采用q檢驗(yàn);數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布或方差不齊者,采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2各組不同時(shí)間點(diǎn)脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的比較2.1各組不同時(shí)間點(diǎn)血中內(nèi)毒素含量比較(表1):3h時(shí),各組血中內(nèi)毒素含量均較假手術(shù)組明顯升高(P均<0.01);與模型組比較,左氧氟沙星組和血必凈組內(nèi)毒素含量均明顯下降(P均<0.01),但左氧氟沙星組與血必凈組比較差異無顯著性(P>0.05)。24h時(shí),模型組仍明顯升高;血必凈組明顯下降,與假手術(shù)組比較差異無顯著性(P>0.05)。72h時(shí),模型組仍保持高水平,較其他組明顯升高(P均<0.01);與模型組比較,左氧氟沙星組和血必凈組均明顯下降(P均<0.01),且血必凈組降低明顯(P<0.01);假手術(shù)組與血必凈組比較差異無顯著性(P>0.05)。2.2各組不同時(shí)間點(diǎn)脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的比較(表2):3h時(shí),模型組脾淋巴細(xì)胞增殖明顯高于其他各組(P均<0.01);血必凈組較左氧氟沙星組明顯升高(P均<0.01),而左氧氟沙星組與假手術(shù)組比較差異無顯著性。24h時(shí),模型組與血必凈組明顯升高(P均<0.01),且血必凈組明顯高于模型組(P<0.01);左氧氟沙星組則無明顯變化(P>0.05)。72h時(shí),左氧氟沙星組逐漸升高,接近于正常,模型組則明顯下降;而血必凈組仍處于高水平狀態(tài),與其他各組比較差異均有顯著性(P均<0.01)。P<0.01;與左氧氟沙星組比較:▲P<0.012.3各組不同時(shí)間點(diǎn)脾淋巴細(xì)胞HLA-DR含量的比較(表3):3h時(shí),與模型組比較,各組均明顯升高(P均<0.01);與假手術(shù)組比較,左氧氟沙星組明顯升高(P<0.05),血必凈組有所下降,但差異無顯著性(P>0.05)。24h時(shí),與模型組比較,假手術(shù)組明顯升高(P<0.01),左氧氟沙星組明顯下降(P<0.01),血必凈組則無明顯變化(P>0.05)。72h時(shí),模型組較其他組明顯下降(P均<0.01),與假手術(shù)組比較,左氧氟沙星組則明顯升高(P<0.01);血必凈組明顯下降(P<0.01)。P<0.01;與左氧氟沙星組比較:▲P<0.012.4各組不同時(shí)間點(diǎn)脾淋巴細(xì)胞caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的比較(表4,彩色插頁(yè)圖1):各組不同時(shí)間點(diǎn)caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均較假手術(shù)組明顯升高(P均<0.01);與模型組比較,左氧氟沙星組和血必凈組均明顯下降(P<0.05或P<0.01)。24h各組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)達(dá)到一個(gè)高峰;與左氧氟沙星組比較,3h和24h時(shí)血必凈組caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均明顯下降(P<0.05)。P<0.01;與左氧氟沙星組比較:△P<0.053血必凈注射液治療細(xì)胞凋亡和降低免疫指標(biāo)的作用內(nèi)毒素引起炎癥反應(yīng)的病理作用可以分為系統(tǒng)和細(xì)胞兩個(gè)方面。在整體水平上,內(nèi)毒素可激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致凝血系統(tǒng)活化,纖維蛋白形成增加、降解減少,凝血系統(tǒng)出現(xiàn)的這些改變可致使患者發(fā)生彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)。在細(xì)胞水平上,內(nèi)毒素可刺激某些效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生活性因子,如B細(xì)胞分泌多克隆抗體;肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞產(chǎn)生化學(xué)趨化分子、組胺等;血小板分泌生長(zhǎng)因子和凝集分子;中性粒細(xì)胞釋放活性氧分子;尤其是內(nèi)毒素刺激單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生多種促炎細(xì)胞因子,如TNF-α、IL-1β和IL-6。機(jī)體細(xì)胞受內(nèi)毒素刺激時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞因子,可迅速活化不同組織器官的細(xì)胞,導(dǎo)致機(jī)體代謝、激素水平和神經(jīng)內(nèi)分泌改變,進(jìn)而造成細(xì)胞功能異常和不同器官功能衰竭。本研究結(jié)果顯示,膿毒癥大鼠血中內(nèi)毒素水平明顯升高,而血必凈注射液可明顯降低內(nèi)毒素水平,在級(jí)聯(lián)反應(yīng)的源頭切斷膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。在早期炎癥因子刺激下,脾臟淋巴細(xì)胞被活化,細(xì)胞增殖增加;但是中晚期,由于嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞大量凋亡,雖然單個(gè)細(xì)胞的增殖增加,但從整體來看其增殖是降低的。血必凈注射液能減少淋巴細(xì)胞凋亡,同時(shí)又能降低內(nèi)毒素水平,必然使淋巴細(xì)胞增殖逐漸增長(zhǎng),在高水平上維持新的免疫平衡。HLA-DR是參與外來抗原加工、處理和呈遞的關(guān)鍵分子,淋巴細(xì)胞通常只識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞呈遞的抗原肽——主要組織相容性復(fù)合物(MHC),它可制約免疫細(xì)胞間的相互作用,在多個(gè)方面參與免疫調(diào)節(jié),控制機(jī)體免疫應(yīng)答的發(fā)生及其強(qiáng)度,通過調(diào)控單核細(xì)胞HLA-DR的表達(dá)水平,可有效發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。單核細(xì)胞HLA-DR的表達(dá)水平受多種因素調(diào)節(jié)。如果調(diào)節(jié)機(jī)制失控或異常,即有可能導(dǎo)致感染等免疫炎癥反應(yīng)性疾病的發(fā)生發(fā)展。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),單核細(xì)胞表面HLA-DR低表達(dá)與其抗原加工呈遞能力低下和TNF/IL-1產(chǎn)生分泌水平下降密切相關(guān),足夠的HLA-DR表達(dá)對(duì)于特異性免疫和非特異性免疫系統(tǒng)功能都十分重要。當(dāng)前檢測(cè)免疫功能的方法很多,但提出能定量診斷免疫抑制,且以此進(jìn)行干預(yù)并能確切改善預(yù)后的檢查,目前可能首推CD14+單核細(xì)胞HLA-DR。在探討CD14+單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)低下對(duì)于膿毒癥的意義方面,Volk等發(fā)現(xiàn),器官移植合并膿毒癥患者CD14+單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)>30%時(shí)的生存率為100%,<30%但能夠被免疫刺激治療并迅速逆轉(zhuǎn)時(shí)的生存率為90%,<30%且不能被免疫刺激治療逆轉(zhuǎn)時(shí)的生存率僅為8%,因此可將CD14+單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)<30%作為診斷免疫功能的閾值。張畔等觀察了多器官功能障礙綜合征(MODS)患者的HLA-DR水平,也顯示發(fā)生MODS時(shí)其表達(dá)即顯著降低,說明機(jī)體的免疫應(yīng)答受到明顯的抑制。在我們的研究中證實(shí),膿毒癥大鼠脾臟中大量T細(xì)胞被激活,但同時(shí)膿毒癥又誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡,雖然單個(gè)T細(xì)胞功能增強(qiáng),但從整體上來看免疫功能卻下降,表現(xiàn)為模型組HLA-DR表達(dá)明顯下降,脾臟中HLA-DR表達(dá)比血中單核細(xì)胞高出10個(gè)百分點(diǎn)。而血必凈注射液能夠提高HLA-DR的表達(dá)。Caspase是一類天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶,可激活特定信號(hào)系統(tǒng),產(chǎn)生核皺縮、DNA片段形成等凋亡現(xiàn)象,最終控制著凋亡的發(fā)生發(fā)展。激活誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(AICD)是機(jī)體清除成熟淋巴細(xì)胞的重要方式。生理?xiàng)l件下,如存在強(qiáng)烈的抗原刺激,T細(xì)胞會(huì)通過AICD機(jī)制減少活化的淋巴細(xì)胞數(shù),以避免由于過強(qiáng)抗原刺激導(dǎo)致的淋巴細(xì)胞過度活化;如無持續(xù)抗原刺激,由于T細(xì)胞生存所必需的細(xì)胞因子不足,活化的T細(xì)胞就會(huì)以被動(dòng)凋亡的方式被清除。研究表明,膿毒癥狀態(tài)下FasL介導(dǎo)的AICD異常與淋巴細(xì)胞的過度凋亡有關(guān)。Tannahill等發(fā)現(xiàn),膿毒癥模型動(dòng)物的FasL表達(dá)明顯增加;Ertel和Matute-Bello等發(fā)現(xiàn),危重患者腦脊液和支氣管引流液中可溶性FasL表達(dá)也明顯增高;Ayala等證實(shí),膿毒癥模型鼠脾CD4T細(xì)胞凋亡增加與其細(xì)胞表面Fas和FasL表達(dá)明顯增加密切相關(guān),FasL缺陷鼠不出現(xiàn)CD4T細(xì)