20r-人參皂苷rg3對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

20r-人參皂苷rg3對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

動(dòng)脈硬化是腦梗死、心臟病發(fā)作、壞疽和肢體功能喪失的主要原因之一。開(kāi)始事件是由內(nèi)皮細(xì)胞損傷引起的。內(nèi)皮細(xì)胞被誘導(dǎo)分泌多種細(xì)胞因子,吸引炎性細(xì)胞的趨化和黏附,致使動(dòng)脈粥樣斑塊形成。動(dòng)脈粥樣硬化是對(duì)血管損傷的過(guò)度炎癥反應(yīng),其斑塊中有大量的炎癥介導(dǎo)物。腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)是一種主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白,是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一,可從多種不同的炎癥細(xì)胞中釋放,在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞表面存在著TNF-α受體,為TNF-α主要的靶細(xì)胞之一,與正常細(xì)胞相比,其在動(dòng)脈粥樣硬化病變中的表達(dá)明顯增加。TNF-α作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,一方面增加黏附分子的表達(dá)水平,促進(jìn)對(duì)中性粒細(xì)胞的黏附作用;另一方面使血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生其他炎性介質(zhì),如白細(xì)胞介素-6和白細(xì)胞介素-8等,共同介導(dǎo)病變血管的炎癥反應(yīng)。TNF-α損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞后,產(chǎn)生明顯的病理和生理學(xué)變化,從而啟動(dòng)局部的炎癥反應(yīng)和粥樣斑塊的形成。因此,研究保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的藥物將有利于動(dòng)脈粥樣硬化的早期防治。20(R)-人參皂苷Rg3是從傳統(tǒng)中藥三七葉中提取分離得到的四環(huán)三萜類二醇型皂苷單體化合物,而五加科植物三七主要分布于我國(guó)西南部,是云南省盛產(chǎn)的名貴中藥材,它具有散淤止血,消腫定痛之功效。本研究通過(guò)觀察20(R)-人參皂苷Rg3對(duì)TNF-α誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC)損傷的保護(hù)作用,探討其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的可能機(jī)制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1細(xì)胞植物1.1.2培養(yǎng)基和指示劑20(R)-人參皂苷Rg3,純度98.5%,由昆明醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室詹爾益教授提供。尼莫地平注射液購(gòu)自山東方明藥業(yè)股份有限公司;注射用尿激酶購(gòu)自麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠;RPMI1640培養(yǎng)基干粉購(gòu)自Gibco公司;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料研究所;胰蛋白酶、十二烷基硫酸鈉(SDS)、TNF-a均購(gòu)自Sigma公司;噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Bebco公司;熒光指示劑Fura-2/AM購(gòu)自ANASPEC公司;組織型纖溶酶原激活物(tissueplasminogenactivator,t-PA)、1型纖溶酶原激活物抑制物(type-1plasminogenactivatorinhibitor,PAI-1)濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司。1.1.3差顯微試驗(yàn)二氧化碳培養(yǎng)箱(德國(guó)Hereaus);倒置相差顯微鏡(日本Olympus);酶標(biāo)儀(Bio-radModel680,日本);雙波長(zhǎng)熒光分光光度計(jì)(RF-5000,日本島津公司)。1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組按參考文獻(xiàn)方法,將HUVEC按1×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于96孔板上,置37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育,培養(yǎng)24h后,換無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)孵育24h,將細(xì)胞分為正常對(duì)照組和TNF-α損傷組。正常對(duì)照組:加入無(wú)血清1640培養(yǎng)基;TNF-α損傷組:加入含TNF-α終質(zhì)量濃度為40、20、10、5、2.5μg/L的無(wú)血清1640培養(yǎng)基,每一濃度設(shè)5個(gè)平行孔,作用時(shí)間為12、24、48h,實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。噻唑藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞存活率,以確定最佳實(shí)驗(yàn)條件。1.3復(fù)孔制備個(gè)人信息將HUVEC按1×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于96孔板上,分為空白對(duì)照組、模型組(TNF-α20μg/L)、20(R)-人參皂苷Rg380、40、20、10、5μmol/L濃度組,每個(gè)濃度均設(shè)5個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。在含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h,然后用含無(wú)血清的RPMI1640繼續(xù)培養(yǎng)24h。預(yù)先加入上述終濃度的20(R)-人參皂苷Rg3培養(yǎng)細(xì)胞24h后,將TNF-α加入模型組和20(R)-人參皂苷Rg3各組,TNF-α刺激細(xì)胞24h,用噻唑藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞活性。1.4細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的測(cè)定Fura-2/AM熒光探針負(fù)載細(xì)胞成功后,用Tyrode-HEPES緩沖液調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106個(gè)/mL,將細(xì)胞懸液吸入有攪拌裝置的石英杯中,用雙波長(zhǎng)熒光光度法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度。細(xì)胞懸液分為正常對(duì)照組、模型組(TNF-α20μg/L)、20(R)-人參皂苷Rg380、40、20、10、5μmol/L濃度組、50μmol/L尼莫地平組,每個(gè)濃度均設(shè)5個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。用直線回歸方法計(jì)算藥物影響鈣濃度的半數(shù)抑制濃度(halfmaximalinhibitoryconcentration,IC50)。1.5細(xì)胞培養(yǎng)和tnf-活性將HUVEC按1×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于96孔板上,分為空白對(duì)照組、模型組(TNF-α20μg/L)、20(R)-人參皂苷Rg380、40、20、10、5μmol/L濃度組、20000IU/mL尿激酶組,每個(gè)濃度均設(shè)5個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。在含10﹪胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h,然后用含無(wú)血清的RPMI1640繼續(xù)培養(yǎng)24h。預(yù)先加入上述不同濃度的20(R)-人參皂苷Rg3培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞24h后,將TNF-α加入模型組和20(R)-人參皂苷Rg3各組,TNF-α刺激細(xì)胞24h后,吸取每孔上清液-20℃保存,采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定細(xì)胞上清液t-PA和PAI-1濃度。用直線回歸方法計(jì)算藥物影響PAI-1濃度的IC50。1.6方差分析和q檢驗(yàn)采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,所有數(shù)據(jù)用(x±s)表示,組間比較采用方差分析,兩兩比較采用q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1不同存活率率比較不同濃度TNF-α作用12、24、48h細(xì)胞存活率比較,詳見(jiàn)表1。通過(guò)實(shí)驗(yàn)選定TNF-α損傷HUVEC的條件:TNF-α的濃度為20μg/L,損傷時(shí)間為24h,在此條件下細(xì)胞損傷適中。2.2對(duì)照組、模型組和不同濃度為20r的人參糖苷rg3組的huvec活性對(duì)照組、模型組及不同濃度20(R)-人參皂苷Rg3組HUVEC活性(吸光度A值)比較,詳見(jiàn)表2。2.3不同處理對(duì)huvdc內(nèi)鈣離子濃度的比較對(duì)照組、模型組、不同濃度20(R)-人參皂苷Rg3組及尼莫地平組HUVEC內(nèi)鈣離子濃度比較,詳見(jiàn)表3。直線回歸方法計(jì)算20(R)-人參皂苷Rg3影響鈣濃度的IC50為67.2μmol/L。2.4尿激酶對(duì)t-pa及pai-1濃度的影響對(duì)照組、模型組、不同濃度20(R)-人參皂苷Rg3組及尿激酶組t-PA及PAI-1濃度比較,詳見(jiàn)表4。直線回歸方法計(jì)算20(R)-人參皂苷Rg3抑制PAI-1濃度的IC50為36.9μmol/L。3tnf-調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞凋亡血管內(nèi)皮細(xì)胞是機(jī)體一類重要的細(xì)胞群體,在血管通透性屏障、免疫防御及炎癥反應(yīng)中起著重要的作用。TNF-α是一種主要由活化的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)分泌的炎癥介質(zhì),對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有多方面的作用,其損傷作用表現(xiàn)為對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的直接作用或通過(guò)其他細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用,造成血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)改變,細(xì)胞膜及細(xì)胞器損害等。有報(bào)道,TNF-α對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有直接細(xì)胞毒作用,增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性,使內(nèi)皮細(xì)胞間隙增大,可促進(jìn)單核細(xì)胞、白細(xì)胞等跨內(nèi)皮遷移。本研究采用TNF-α作為誘導(dǎo)HUVEC損傷的因素,通過(guò)噻唑藍(lán)法測(cè)定HUVEC存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在觀察的濃度范圍內(nèi),TNF-α使HUVEC的活性降低,而預(yù)先加入20(R)-人參皂苷Rg3干預(yù)可提高HUVEC的活性,提示20(R)-人參皂苷Rg3具有抗TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用。內(nèi)皮細(xì)胞的許多功能活動(dòng)與細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員有關(guān),而且內(nèi)皮細(xì)胞活化后產(chǎn)生和分泌的許多血管活性物質(zhì)又具有鈣離子敏感性和鈣離子依賴性。鈣離子本身可作為一種凋亡信號(hào),調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。TNF-α與細(xì)胞膜上的TNF-α受體結(jié)合后,通過(guò)IP3-鈣離子-鈣調(diào)蛋白激酶途徑導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣釋放和細(xì)胞外鈣內(nèi)流,使細(xì)胞內(nèi)的游離鈣離子濃度升高。細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高嚴(yán)重干擾線粒體的功能,導(dǎo)致氧化磷酸化過(guò)程受損,甚至導(dǎo)致線粒體的結(jié)構(gòu)破壞;激活磷脂酶促進(jìn)膜磷脂水解,造成細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜受損,同時(shí)膜磷脂降解產(chǎn)物花生四烯酸、溶血磷脂等增多亦可導(dǎo)致細(xì)胞的功能紊亂;激活蛋白水解酶使自由基生成增加,或通過(guò)影響細(xì)胞基因的表達(dá),誘發(fā)細(xì)胞的凋亡或壞死。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,TNF-α能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞游離鈣離子濃度顯著增高,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載,說(shuō)明TNF-α損傷內(nèi)皮細(xì)胞的作用可能是以鈣離子為信使進(jìn)行細(xì)胞間信息傳遞的,這可能是TNF-α介導(dǎo)細(xì)胞損傷的重要機(jī)制之一。在本研究中,預(yù)先加入20(R)-人參皂苷Rg3能顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高,防止細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載,提示20(R)-人參皂苷Rg3保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與其緩解細(xì)胞鈣超載有關(guān)。t-PA和PAI-1是纖溶系統(tǒng)的重要組成部分,t-PA使纖溶酶原激活為有活性的纖溶酶,啟動(dòng)機(jī)體的纖溶系統(tǒng),促使局部血栓溶解;PAI-1是血漿中t-PA的重要生理快速抑制劑,以阻止t-PA啟動(dòng)纖溶系統(tǒng),而促進(jìn)血栓的形成和延展。近年研究表明,PAI-1對(duì)纖溶系統(tǒng)起著從頭抑制的作用,正常情況下,t-PA和PAI-1能夠在體內(nèi)以1∶1的比例形成穩(wěn)定的復(fù)合物,從而維持纖溶系統(tǒng)平衡。目前認(rèn)為,血管內(nèi)皮損傷、血漿PAI-1增多是動(dòng)脈粥樣硬化等血管、血栓性疾病發(fā)生的主要原因之一。PAI-1表達(dá)增高是動(dòng)脈硬化或原發(fā)性高血壓疾病出現(xiàn)血液高凝現(xiàn)象的主要原因之一。研究表明,TNF-α能明顯增加HUVECPAI-1mRNA表達(dá),說(shuō)明在TNF-α作用下,PAI-1活性增加是由于HUVEC轉(zhuǎn)錄PAI-1基因增強(qiáng),致使PAI-1蛋白合成增多所致;TNF-α增強(qiáng)HUVECPAI-1活性與mRNA表達(dá),PAI-1活性提高與其mRNA表達(dá)增加呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,TNF-α20μg/L刺激內(nèi)皮細(xì)胞24h后,t-PA的濃度明顯下降,PAI-l濃度則出現(xiàn)顯著增高,增多的PAI與t-PA結(jié)合,導(dǎo)致局部纖溶系統(tǒng)傾向于血栓形成。這表明TNF-α影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能主要是增強(qiáng)PAI-1濃度。本研究在預(yù)先用20(R)-人參皂苷Rg3干預(yù)后,發(fā)現(xiàn)20~80μmol/L的20(