低分子有機無機鹽水兩相體系的建立其對羅丹明b的分離富集研究

第一章緒論1.1蒲公英介紹蒲公英的味道比較甘苦，屬性寒植物，其功能較多，不僅可以清熱解毒，利尿健胃，同時還具有保肝、消炎、利膽等作用。在現(xiàn)代科學中，通過試驗發(fā)現(xiàn)蒲公英的成分中還有大量的生物活性物質，比如說多糖、生物堿、糖蛋白、黃酮類等。這些物質對人體的益處頗多，比如可以起到抗菌、抗腫瘤等作用，同時還具有調節(jié)激素、抗氧化、降血脂等作用，因此很多保健品會選擇蒲公英來作為原料。蒲公英作為一種植物，已經有近千年的研究歷史。唐代著作《新秀本草》中曾經提到，蒲公英的葉子比較苦，花是黃色的，掐斷以后會流出白汁，宋代的《本草衍義》中也提到蒲公英一年四季時常開花，花就如同飛絮一般，絮中包含著種子，一旦落地就會生根發(fā)芽。1.1.1蒲公英國內外研究現(xiàn)狀臨床方面到今天為止，蒲公英在許多疾病中表現(xiàn)出很大的功效。蒲公英化合物可治療急性化膿性扁桃體炎，治愈率為82％。蒲公英治療牙周炎，膀胱炎和口腔炎療效良好，治愈率達90％左右。并且，蒲公英還常常用于治療各種炎癥，如靜脈炎、中耳炎、慢性胃炎、潰瘍、角膜炎以及咽炎等，其功效在臨床實驗中得到了證實。食品應用蒲公英，一種藥食同源的植物，經常出現(xiàn)在餐桌上。例如，東北地區(qū)經常使用蒲公英作為涼菜，同時也在泡菜和功能性的飲料中，如蒲公英蛋糕。抗氧化劑是健康飲食發(fā)展的重要方向。蒲公英具有抗氧化特性，因此可以改變某些食物或飲料的儲存時間。蒲公英黃酮類化合物具有很強的抗氧化活性，因此我們希望開發(fā)出蒲公英黃酮類膠囊，用于抗氧化衰老等，從而提高人們的健康水平。1.2總黃酮介紹目前，在臨床醫(yī)學中指出黃酮類的化合物可以提高人體的免疫力，強化人的心血管功能，同時還可以減緩衰老，降低血液中的脂肪含量和糖類含量，近年來也受到了各界的關注，被廣泛研究。很多學者對從植物中提取黃酮類化合物進行了廣泛的研究。發(fā)現(xiàn)了蒲公英中含有的總黃酮類物質抑菌效果良好，這也為開發(fā)抑菌劑提供一定的基礎。1.2.1黃酮類結構黃酮類化合物是一種色原烷的衍生物，其在蔬菜、藥材、水果中大量存在。這是一種天然的化合物，其結構如圖1-1所示。該類化合物的結構是三環(huán)，其在自然界中的組成方式是C6-C3-C6，其中會在C3部分中構建脂鏈，與C6部分相結合，最終變?yōu)橐粋€五元環(huán)或者六元環(huán)。根據(jù)化合物中央的碳原子氧化程度的不同可以判斷其是否構建為環(huán)狀，并且可以將黃酮類的化合物進行細分，分別為黃酮醇類、黃酮類、查爾酮、二氫黃酮醇類等，一共有15類。圖1-11.2.2黃酮類性質在通常情況下，黃酮類化合物多是一些沒有固定形狀的粉末，具有較高的熔點。并且由于該類化合物中會含有一些酚類的化合物，所以也含有一部分酚性質。類黃酮由于羰基的數(shù)量、結構的位置的不同，呈現(xiàn)出不一樣的顏色。通常，類黃酮和黃酮醇及其糖苷主要是灰色或黃色，并且分子中經常包含的吡啶酮環(huán)或羰基基團構成發(fā)色團的基本結構。由于類黃酮的結構和存在性不同，它們的溶解度有很大的差距。一般來說，黃酮類和糖類可以形成黃酮類糖苷，因此它們易溶于極性溶劑，如水，甲醇和乙醇;而游離黃酮類糖苷配基不溶于水，可溶于甲醇，乙醇和乙酸。董雙雙等[20]提出打空吸附樹脂可以純化總黃酮，方便總黃酮等提取。黃酮類化合物具有強烈的熒光，在紫外線照射下具有亮黃色，黃綠色，亮藍色，深棕色等。如果黃酮類的化合物和鎂粉等混合會呈現(xiàn)亮紅色，并且反應過程中會出現(xiàn)紫色。如果化合物中含有鄰羥基、5-OH等，那么它與煤鹽、鋁鹽等物質反應時，會產生一種絡合物，這種物質的顏色較暗。1.3蒲公英主要成分1.3.1黃酮類如下表1-1所示，為蒲公英含有的一些黃酮類的成分，其苷元主要有:槲皮素、木犀草素、橙皮素、香葉木素等表1-1蒲公英中黃酮類成分化合物名稱來源文獻槲皮素T.mongolicum[2]木犀草素T.borealisinense[3]橙皮素T.mongolicum[4]芫花素T.mongolicum[4]香葉木素T.borealisinense[4]槲皮素-3,7-O-B-D-二吡喃葡萄糖苷T.mongolicum[4]橙皮苷T.mongolicum[4]1.3.2有機酸在蒲公英中，其含有了一部分的有機酸，主要是咖啡酸和綠原酸，其次是香豆酸、棕櫚酸等。表1-1蒲公英中有機酸類成分化合物名稱來源文獻綠原酸T.mongolicum[2]咖啡酸T.mongolicum[2]阿魏酸T.borealisinense[3]對羥基舉甲酸T.mongolicum[4]對香豆酸T.mongolicum[4]3,4-二羥基苯甲酸T.mongolicum[4]沒食子酸T.mongolicum[4]沒食子酸甲酯T.mongolicum[4]丁香酸T.mongolicum[4]咖啡酸乙酯T.mongolicum[5]1.3.3萜類根據(jù)現(xiàn)有的資料顯示，蒲公英中具有的萜類物質為倍半萜類、三萜。其中三萜物質主要有偽蒲公英醋酸酯、偽蒲公英棕櫚酸酯。不同地區(qū)的蒲公英中也分離出了假蒲公英乙酸醇。表1-3蒲公英中萜類成分化合物名稱類型來源文獻偽蒲公英甾醇棕櫚酸酯三萜T.borealisinense[6]偽蒲公英甾醇乙酸酯三萜T.borealisinense[6]3-乙酰偽蒲公英甾醇三萜T.asiaticum[7]taraxacin倍半萜類T.mongolicum[4]蒙古蒲公英素B倍半萜類T.mongolicum[4]1.3.4香豆素類姚巍等[4]在蒙古蒲公英中分離得到七葉內酯。許丹等人以東北地區(qū)的蒲公英作為試驗的樣本，提取出兩種香豆素類的化合物，即莨菪內酯、瑞香內酯。1.3.5木脂素類施樹云等[5]等人以蒙古地區(qū)的蒲公英作為試驗的樣本進行物質分離，最終得到了2個木脂類的化合物，分別是蒙古蒲公英素A、rufescidride。1.3.6其它成分在蒲公英的組成中，還存在著其他成分，比如香草醛、β-谷甾醇、豆甾醇、胡蘿卜苷、多糖等。1.4黃酮的生理活性通過研究可以發(fā)現(xiàn)黃酮類的化合物其生物活性往往較高，可以起到抗菌、保護肝臟、提高免疫力、降低血壓血脂等功效。黃酮類化合物是許多中草藥的主要功能成分之一，所以它也成為了藥質量控制的重要指標之一。1.4.1抗氧化作用在黃酮類化合物中，其含有的酚羥基結構穩(wěn)定性低，經常會同自由基進行反應，從而使其喪失了生物活性，具有一定的抗氧化作用。李文娜等[8]人以杜仲葉作為樣本，提出了其中的黃酮類物質，通過試驗可以發(fā)現(xiàn)其可以消除羥基自由基、超氧陰離子自由基、烷基自由基等。其Ic如值依次是61.1g·mL、38.3g·mL、68.7g?mL，同VC消除的自由基有關指標相比，上述三類的指標都較低。在研究中發(fā)現(xiàn)，植物中含有的黃酮類化合物通過消除自由基，來起到一定的抗氧化作用，同時還可以提高其他高抗氧化物質的活性，比如說提高元素的還原能力[9,10]。同時還可以對金屬能力進行螯合，對脂質體的過氧化能力起到一定的抑制作用。對于類黃酮而言，抗氧化活性是其具有的主要功能之一，也是實現(xiàn)抗衰老、抑制惡性能力的基礎。Li等[11]通過試驗發(fā)現(xiàn)，黃酮具有的抗氧化能力可以對骨髓干細胞起到一定的保護作用，從而避免其被活性氧損壞。其基礎的工作原理是利用黃酮來使Akt實現(xiàn)磷酸化，最終使FOXO家族的基因起到一定的增強作用，利用抗凋亡蛋白Bcl-2來對活性氧起到印制作用，從而避免細胞額度損傷。Sato等[12]在研究中發(fā)現(xiàn)黃酮類的化合物的抗氧化能力能夠保護缺血的損傷細胞。蜂膠黃酮既能明顯提高腦組織抗氧化酶的活性，又同時顯著降低腦組織NO含量，提示蜂膠黃酮可以抑制NO的細胞毒作用，達到延緩衰老之目的[13]。目前，國內外對黃酮類化合物抗氧化活性的研究較多，但深度不夠。對抗氧化活性的應用也沒有提供足夠的理論支持。1.4.2抗菌作用在關于黃酮的抗菌作用中，劉利本等[14]使用了藥敏紙片法對蒲公英的全草進行了測定，同時結合二倍稀釋法對蒲公英抑制金葡菌、大腸桿菌等細菌的抑制作用展開了試驗，通過研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英可以在一定程度上抑制螺旋體、革蘭氏陰性菌和陽性菌、各類真菌等[15]。同時還有實驗指出黃酮類物質對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用分別是綠原酸的4倍和2倍[16]1.4.3抗炎作用炎癥的引發(fā)機理是由體內炎性細胞因子的損傷引起的。主要病理過程是防御反應，損傷和抗損傷。嚴重的炎癥反應可能危及生命。使用化學藥品抗炎，效果雖較好，但不良反應往往較大。通過植物的天然化合物抗炎就沒有這些副作用，且使用中藥具有顯著的優(yōu)點，比如可以減少不良反應、維持較久的藥效、起到雙向調節(jié)的作用等。Hye-JinJeon等[17]以不同的動物作為試驗品，建立了炎癥模型，通過研究發(fā)現(xiàn)通過濃度為70%的乙醇提取液得到的蒲公英黃酮具有明顯的抗炎作用，根據(jù)這個調查結果可以得知該提取物的主要功效不僅可以抑制NO，同時還可以降低COX-2、iNOSs進行表達。Yoon-JeoungKoh等[18]選擇濃度為70%的甲醇液體來對蒲公英葉子進行提取，通過研究可以發(fā)現(xiàn)醋酸乙酯、三氯甲烷等部分具有較高的抗炎作用。并且，LibenLiu等[19]以小老鼠作為試驗品，通過測試蒲公英湯劑發(fā)現(xiàn)可其可以治療有多糖引起的肺損傷。平家奇等人的研究發(fā)現(xiàn)如果使用高劑量的水煎液，可以抑制棉球肉芽腫，從而減少小鼠的耳部腫脹等。1.4.4利膽保肝作用肝臟損傷可以誘發(fā)多種非常嚴重的肝臟疾病，嚴重的甚至可能最終導致肝衰竭。通過建立良好的實驗性肝損傷動物研究模型，研究肝臟疾病的發(fā)病機理，精挑細選出有效的保肝利膽藥物，對預防肝臟疾病的發(fā)生具有非常重要的意義。1.5黃酮化合物的提取方法在自然界中，存在著大量的天然黃酮類化合物，它們通常具有較高的生活活性。通過提取黃酮類化合物，提高其純度，可以促進進一步的研究。其中，蒲公英中具有豐富的黃酮類化合物，目前主要是使用水提取法、超聲波輔助提取、超臨界CO2提取、微波輔助提取等方式來獲得黃酮類化合物。我國學者袁河[20]利用超聲波輔助法對蒲公英中的總黃酮進行提取，最終的提取率達到了7.55%，效率較高。1.5.1有機溶劑提取法目前，提取黃酮類化合物比較普遍的方式是有機溶劑提取法。使用最多的有機試劑是乙醇。乙醇具有價格低廉、回收方便等優(yōu)點，可大量用于該實驗生產。此外，乙醇溶液具有良好的穿透性和溶解性，可以溶解除蛋白質以外的細胞中的大部分物質。不過，乙醇提取方法也有一些不足，比如：提取總黃酮的效果并不是特別好;在加熱下，溶劑中的水溶解物質會溶解在水中，如糖和蛋白質，并產生一夜額外的雜質。大大增強了分離純化的難度。1.5.2微波提取法通過微波萃取法的主要原則是利用化學物質波長的不同，利用其差值來進行提取。其中，通過微波可以使不同化學物質進行選擇性加熱，從而得到與目標物質分離的目的。與以往的提取方法相比，微波提取方法操作簡單，方便，提取時間相對短，提取率得到提高。而且微波萃取法的應用試劑較其他提取方法試劑少很多，極大的體現(xiàn)了綠色化學的發(fā)展。微波萃取對于提取熱不穩(wěn)定的化合物有更大的優(yōu)勢。楊兵等[21]人利用單因素試驗的方式來提取黃酮類物質，其中在該學者的研究中，當微波的溫度達到70攝氏度、微波加熱的時間為5分鐘，乙醇的濃度為70%時，其工藝效果最優(yōu)。1.5.3超聲波提取法所謂超聲波提取法，其主要的原理是利用超聲波產生的振動，傳遞強能量，從而破壞植物細胞的細胞壁，加速有效成分的在提取溶劑中的釋放、溶解，最終提高提取的效率。相對于其他方式，超聲波提取法的操作比較簡單、工作時間短、提取效率高，在提取黃酮類化合物領域中，這種方式被廣泛使用。吳杰等[22]人就選擇使用超聲波提取的方式來對蒲公英中的總黃酮進行提取，當乙醇的濃度達到36%，其超聲操作的時間達到42分鐘，料液比為1：130時，優(yōu)化的效果最好，最終可以得到3.10%的總黃酮。李華峰等[23]也使用了超聲波提取的方式來獲得總黃酮。在該學者的研究中發(fā)現(xiàn)當超聲波的功率為100瓦，提取液中乙醇的濃度為75%，試驗溫度為55攝氏度，提取時間為30分鐘時，可以獲得最高含量的總黃酮，其濃度可以達到3.42%。1.5.4酶解法生物酶具有高效性和專一性，是一種環(huán)保的生物催化劑。使用纖維素酶可以快速的破壞掉細胞壁中的纖維素，最終破壞了植物細胞的細胞壁，從而使黃酮類化合物的提取更加簡單，提高了提取的效率[24]。并且特殊的酶還可以將提取液中的蛋白質、果膠等雜質溶解除去而不對目標物造成破壞，可以使分離純化的難度降低。酶解法的操作容易，準確度高，在中藥成分提取中占據(jù)很大優(yōu)勢。劉曉光等[25]人以山楂作為研究的對象，使用了纖維素酶的酶解法來進行總黃酮的提取，在試驗中可以發(fā)現(xiàn)當酶解的溫度為55攝氏度、酶含量是0.15mg/mL，試驗pH值為5.9時，其具有最佳的提取效果，最終可以得到90%的提取率。1.6體外抗氧化能力的檢測1.6.1還原能力在對黃酮類化合物還原能力進行檢測的過程中，通常是使用鐵離子還原的方式進行檢測。通過顏色的比較來測定。目前，經常使用氯化鐵-鐵氰化鉀著色方法來測定還原能力。該方法的原理是：當有抗氧化劑產生作用時，鐵離子會從三價鐵離子還原成二價的鐵離子并且會與K3[Fe(CN)6]反應。顏色發(fā)生明顯變化，而且顯色材料在分光度為700nm處有一個較為明顯的吸收峰，吸光度值的大小可以反映還原能力的大小。1.6.2DPPH自由基清除能力在對植物中化學物質抗氧化能力進行檢測的過程中，通常是使用二苯代苦味?；杂苫?，即DPPH法來展開檢測，該方法是將氮原子作為中心，相對于其他自由基其穩(wěn)定較高，它在517nm處有特征吸收峰，溶于乙醇呈現(xiàn)出深紫色，如果加入抗氧化劑，其原本存在的特征吸收峰，即517nm將不再存在，并且還會導致吸光值降低，顏色變淺。DPPH方法操作簡便，靈敏度高，重復性好，無需復雜的儀器。這種方法的缺點是自由基的產生并不單獨存在。一般來說，當許多自由基一起產生時，會影響實驗結果。當自由基的清除能力和抗氧化劑的濃度超過一定范圍時，則不存在線性關系。1.6.3羥基自由基的清除能力羥基自由基是對細胞內有殺傷力的一種自由基，易引起脂質過氧化，對各種生物大分子有一定的攻擊和破壞作用。這種方法主要是測定抗氧化抑制產生的自由基的能力，或是測定羥基自由基引起的反應速率。該方法的優(yōu)點是操作簡單，不需要復雜的設備，只需要模擬抗氧化劑清除試管中羥自由基的能力;我們經常在計算間隙率時使用比色法，如：結晶紫法，亞硝基鹽鉆孔離子褪色法，這些方法的缺點是去除一些不穩(wěn)定，長壽，有毒的羥基自由基將無法進行了量化處理。1.6.4清除超氧陰離子自由基的方法相對而言，O2-·自由基的活性較低，對于生物大分子而言，這類自由基的誘導氧化損傷的能力幾乎不存在，但當它們與金屬離子存在時，會發(fā)生芬頓反應，導致羥基自由基生成[26]。確定其抗氧化能力的常用方法是利用連苯三酚進行自氧化處理。但是這種方式具有一定的缺點，如時間要求短，容易忽略身體本身發(fā)生的長期變化，生物學結果可能不正確。也有一種方法可以還原硝托拉唑的藍色氯化物，但這種方法與溫度的關系很大，不常用。1.7本論文的研究內容及意義通過單因素和正交試驗的實驗結果，得到最佳的提取工藝，為蒲公英提取的黃酮類化合物的工業(yè)化提供了參考。研究了蒲公英體外提取的黃酮類化合物的抗氧化作用。首先制作蘆丁標準曲線，然后進行了單因素試驗。從進料比、時間比、乙醇濃度比、溫度比四個方面得到了最佳配比。然后進行了正交試驗的優(yōu)化比。

第二章實驗部分2.1材料與設備2.1.1實驗原料表2-1實驗材料原料名稱采購地點/原料出處蒲公英長白山表2-2實驗試劑藥品名稱采購地點/原料出處鹽酸天津化學試劑有限公司NaOH天津化學試劑有限公司鎂粉西隴化工股份有限公司溴甲酚綠北京化工廠碘化鉍鉀北京化工廠硫酸天津化學實驗有限公司三銹化鐵天津天泰細化學品有限公司醋酸西隴化工股份有限公司硫酸銅天津化學實驗有限公司氨水天津天泰細化學品有限公司無水乙醇陜西森弗天然制品有限公司蘆丁標準品益海嘉里（秦皇島）蛋白工業(yè)有限公司2.1.3實驗儀器與設備表2-3實驗儀器儀器名稱型號生產廠家電子分析天平JA2003N型上海精密科學儀器有限公司紫外風光光度計SKD—08S上海沛歐分析儀器有限公司電熱恒溫水浴鍋SKD—200上海沛歐分析儀器有限公司電冰箱NR—B25WS1無錫松下冷機有限公司水浴鍋DFD-700天津市泰斯特儀器有限公司在本試驗中，還用到了玻璃棒、250mL燒杯、量筒(50mL、10mL)、容量瓶(250mL)、試管、移液槍、移液管、錐形瓶、吸耳球、硫酸紙等。2.2蒲公英成分檢測2.2.1原料的預處理首先烘干試驗所用的蒲公英，然后將其粉碎，直至通過80目篩，留作備用。2.2.2溶液的制備利用天平稱取三份沒有經過處理的蒲公英粉末，分別為2克，然后將這三份分別放置在容積為100mL的三角牌中，并對其進行A、B、C的編號。其中，制取乙醇提取液的方式是：現(xiàn)在A瓶中加入40毫升含量為40%的乙醇溶液，然后將水浴鍋的溫度調至80攝氏度，進行1小時的水浴加熱，截止進行回流提取，并且進行過濾，將獲得的濾渣丟棄。此時，過濾后獲得的溶液就可以對黃酮、有機酸等物質的存在進行測驗。制取乙醇提取液的方式是：在B瓶中加入40毫升的石油醚，然后將水浴鍋的溫度設定為60攝氏度，接著進行1小時的水浴加熱，之前進行回流、過濾，此時獲得的溶液可以對一些揮發(fā)油、甾體化合物等物質的存在進行測驗。制取乙醇提取液的方式是：在C瓶中加入40毫升的蒸餾水，然后將水浴鍋的溫度調至80攝氏度，進行1小時的水浴加熱，然后回流、過濾，此時得到的溶液可以檢測多糖類、蛋白質、氨基酸等物質的存在。2.2.3活性成分的檢測通過檢測黃酮類化合物、生物堿、酚類和單寧類化合物、檢測蛋白質、檢測糖類和糖苷、檢測類固醇和萜類化合物、檢測揮發(fā)油和油類化合物、鑒定有機酸和皂苷。2.3試驗方法2.3.1蒲公英總黃酮提取工藝流程原料烘干→粉碎→乙醇提取→抽濾→真空濃縮→冷凍干燥→總黃酮將蒲公英粉碎，稱量20g粉末，置于500mL容量瓶中，以一定比例的材料與液體，提取時間，提取溫度和乙醇濃度進行提取。一段時間后，過濾上清液，儲存濾液，回收濾渣，再次將濾渣補足至體積。進行第二次提取，在一段時間后，過濾上清液，儲存濾液，回收濾渣，并將濾渣再次加至體積。對于第三次提取，過濾并儲存濾液。將濾液混合，通過旋轉蒸發(fā)儀進行濃縮，將濃縮液防至冰箱冷藏一晚，第二天進行冷凍干燥得到黃酮粉末。2.3.2蘆丁標準曲線的繪制[27]首先，使用天平稱取2.5毫克的105℃烘干至恒重的蘆丁，然后進行蘆丁標準液的配置，將其濃度調制設定為0.1mg/mL。然后分別取不同含量的標準液加入到比色管中，分別加入30%乙醇至5mL，再用1毫升移液槍調至0.3mL加入5%NaNO2的水溶液最終達到0.3mL，然后使其進行均勻混合。5分鐘后，更換槍頭，加入混合0.3毫升的10%AlCl3溶液，放置6min以后，加入4毫升的濃度為4%的NaCl水溶液，最終加入乙醇進行定容。在波長達到510納米的基礎上，將蘆丁濃度作為自變量，吸光值A作為因變量，對實驗結果進行繪制。圖2-1蘆丁標準曲線2.4蒲公英總黃酮單因素實驗2.4.1乙醇體積分數(shù)對蒲公英總黃酮提取率的影響通過天平，稱取2g蒲公英粉末各五份，然后依次放置在編號為1、2、3、4、5的100毫升三角瓶中。其中，設定料液比為1:20，然后加入體積分數(shù)依次是60%、70%、80%、90%和100%的無水乙醇。將提取液的溫度設定為80攝氏度，時間設定為2小30分鐘，然后分別提取三次。將溶液冷卻、抽濾、棄去濾渣，混勻濾液，將該濾液在分光光度計波長510nm處對濾液的吸光度值進行測定，并且按照3.1.5的計算公司可以得知總黃酮的提取率。2.4.2液料比對蒲公英總黃酮提取率的影響分別稱量5份2克蒲公英粉末，然后將它們分別放置在編號為1、2、3、4、5的100毫升三角瓶中，并且全部加入含量為80%的乙醇，并將5份的液料比控制為1：15、1:20、1:25、1:30、1:35（g/mL），將提取的時間設定為2小時30分鐘，分別提取3次。將溶液冷卻、抽濾、棄去濾渣，混勻濾液，將該濾液在分光光度計在波長510nm處對其吸光度進行測驗，然后利用相關公式計算提取率。2.4.3提取溫度對蒲公英總黃酮提取率的影響分別稱取5份2克的蒲公英粉末，然后將其放置在編號依次為1、2、3、4、5的100毫升三角瓶中，提取的溫度分別設定為100、90、80、70、60攝氏度，將5份的液料比統(tǒng)一設定為1：30。并且確定酒精的體積分數(shù)是80%，將5份提取的時間統(tǒng)一為2小時30分鐘，然后共進行三次提取。將溶液冷卻、抽濾、棄去濾渣，混勻濾液，將該濾液在分光光度計在波長510nm處對其吸光度值進行測量，并根據(jù)公式計算提取率。2.4.4提取時間對蒲公英總黃酮提取率的影響分別稱取5份2克的蒲公英粉末，然后將其分別放置在5個規(guī)格相同的三角瓶中，將提取的時間以此選擇為2小時、2小時30分鐘、3小時、3小時30分鐘、4小時，保證其他變量一致。將溶液冷卻、抽濾、棄去濾渣，混勻濾液，將該濾液在分光光度計在波長510nm處測量吸光度值，并進行計算。2.4.5公式計算其總黃酮提取率。在對提取率進行計算的過程中，與2.3.2一節(jié)中繪制蘆丁標準曲線的方式一致，只是對照品溶液用1mL的蒲公英總黃酮提取溶液替代，其他的步驟均按上述操作，通過標準曲線，換算提取率[28]。公式如下：總黃酮提取率%=m1v1×100/mv×10-6（2-1）其中，m表示質量；m1表示總黃酮含量；v1和v2分別表示分取體積和總體積。2.5正交法優(yōu)化提取工藝在單因素試驗的基礎上，對提取液進行正交試驗，共選擇了4個因素。其中，使用L9（34）正交表來展開試驗，可以起到一定的優(yōu)化作用。具體如表2-4所示。表2-4因素與水平因素水平A料液比/（g/mL）B提取溫度/℃C乙醇體積分數(shù)/%D提取時間/h11:207070221:258080331:30909042.6蒲公英黃酮體外抗氧化活性研究2.6.1蒲公英總黃酮還原力的測定參考Ardestani，提取不同濃度的蒲公英黃酮，然后放置在1毫升的試管中，然后加入2.5毫升0.2mol/L的磷酸緩沖液以及2.5毫升質量分數(shù)1%的鐵氰化鉀，在50攝氏度的水浴環(huán)境中進行加熱，保持在20分鐘。結束以后立刻進行冷卻，然后加入2.5毫升的TCA溶液，選擇的濃度是10%。接著同2.5毫升的蒸餾水以及0.5毫升0.1%的三氯化鐵溶液進行混合，10分鐘以后測定吸光度。反應物的吸光鋒體積越大，還原力就越強。同時還將一定量的Vc制備成相應的濃度。操作方法與以上相同。相同的實驗重復3次，相對還原力強與弱。2.6.2蒲公英總黃酮清除DPPH自由基能力測定[29]在試管中放置1毫升的樣品，然后加入1毫升10μmol/L的DPPH溶液，進行充分混合。然后在5攝氏度的環(huán)境下進行避光處理，25分鐘以后測量其在517納米處的吸光度，設為Ai；然后將1毫升乙醇與1毫升樣品溶液搖勻，并放置30分鐘，然后對吸光度進行測定，設為Aj；接著將1毫升的乙醇和DPPH溶液進行混合，放置半小時以后對其吸光度進行測量，設為Ac。取一定量的Vc也配制成相應濃度。操作方法同上，對其清除自由基的能力進行比較。其中，計算公式如下：DPPH自由基的清除率=［1-（Ai-Aj）/Ac］×100%（2-2）2.6.3蒲公英總黃酮清除·OH自由基能力測定使用移液槍，然后將不同濃度的2毫升樣本放置在試管中，分別加入2毫升7.5mmol/L的鄰二氮菲溶液和4毫升0.2mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，然后進行充分混合。接著加入2mL7.5mmol/L的硫酸亞鐵進行混合，最后加入2毫升1%的過氧化氫溶液。進行1小時的37攝氏度的水浴，然后進行快速冷卻，在536納米處測量其吸光度，用As表示。然后使用1毫升的蒸餾水來取代上述的過氧化氫，用Ab表示其吸光度。最后使用蒸餾水來替代，作為空白參照，用Ap表示吸光度。則羥基自由基的清除率%＝(As-Ap)/(Ab-Ap)×100%（2-3）2.6.4蒲公英總黃酮清除O2-·自由基能力測定[30]在pH值保持在8.2的環(huán)境下，混合4.5毫升0.005摩爾沒升的Tris鹽酸緩沖液和4.2毫升的蒸餾水，然后進行水浴，水浴的溫度為25攝氏度，水浴時間為20分鐘。接著加入0.3毫升3毫摩爾每升的鄰苯三酚溶液，每間隔10秒鐘就對其在325納米處的吸光度進行測量，用Ao表示，然后用As表示吸光度的增加值。則超氧陰離子的清除率%=（Ao-As)/Ao×l00%（2-4）

結果與討論3.1蒲公英活性檢測表3-1蒲公英活性成分檢測結果檢測成分試驗方法試驗結果黃酮類鹽酸-鎂粉反應產生紫紅色有機酸溴甲酚綠顯色有黃色斑點生物堿碘化鉍鉀試劑紅色沉淀蒽醌伯恩泰戈爾反應無紅色沉淀酚性成分三氯化鐵反應未顯示藍深綠色酸堿度PH試紙PH=6氨基酸雙縮脲試劑未顯示枚紅色多糖類莫利石反應有玫紅色環(huán)產生皂苷泡沫反應泡沫持續(xù)時間<10min3.2單因素實驗結果3.2.1乙醇體積分數(shù)對蒲公英總黃酮提取率的影響對下圖3-1進行分析，可以發(fā)現(xiàn)隨著乙醇體積的增加，提取率也會隨之提高。當其體積分數(shù)為80%時，提取率達到最高值，為2.92%。在此之后，提取率會隨著乙醇濃度的增加而下降。所以，選擇乙醇體積分數(shù)80%。圖3-13.2.2液料比對蒲公英總黃酮提取率的影響通過對下圖3-2進行分析，可以發(fā)現(xiàn)隨著料液比的增加，提取率會逐漸上升。當比值為1：25時，其提取率最高，數(shù)值為3.12%。在此以后，提取率會隨著料液比的增加而減小。這可能是由于在1：25（g/mL）時，目標物溶液達到飽和，繼續(xù)增加液料比，過量的溶劑反而會使提取率降低，造成浪費，使工作量變大，因此選定提取的液料比為1:25（mL/g）。圖3-23.2.3提取溫度對蒲公英總黃酮提取率的影響對下圖2-4進行分析，可以發(fā)現(xiàn)隨著溫度的提高，提取率會出現(xiàn)上升。當溫度達到80攝氏度時，提取率最高，數(shù)值達到3.13%。接下來溫度提高會使蒲公英總黃酮的提取率下降。原因可能是：隨著溫度的增加，使一些在其他物質開始溶解，導致提取率降低；還有可能是黃酮類化合物含有大量羥基，達到一定溫度時發(fā)生氧化還原反應，從而導致提取率降低，因此確定溫度為80攝氏度。圖3-33.2.4提取時間對蒲公英總黃酮提取率的影響通過對下圖2-5進行分析，可以發(fā)現(xiàn)隨著時間的增加，提取率液會逐漸提高。但是在3小時時，可以達到最高的提取率，數(shù)值為3.19%。超過該時間后，提取率并沒有太大變化?？紤]到實際操作，提取時間過長，會導致實驗成本增加，黃酮類化合物的穩(wěn)定性也會隨著時間的推移而降低，并會隨著提取溶劑的不斷蒸發(fā)而造成損失或分解，降低提取率，因此選擇3.0h作為最佳萃取時間。圖3-43.3正交實驗結果在單因素試驗的基礎上，選擇提取溫度、時間、料液比以及乙醇體積分數(shù)作為因變量，然后進行正交試驗，具體結果如表3-2所示。根據(jù)表3-1中的中級差R可以得知，這四種影響因素的程度大小由高到低，分別是時間、料液比、溫度、乙醇體積。實驗結果如下表3-2所示。表3-2正交實驗結果因素料液比/（g/mL）溫度/℃乙醇體積/%時間/h實驗結果實驗111112.89實驗212222.64實驗313332.93實驗421233.21實驗522313.07實驗623122.81實驗731322.74實驗832132.67實驗933212.96均值12.8202.9472.7902.973均值23.0302.7932.9372.730均值32.7902.9002.9132.937極差0.2400.1540.1470.243表3-2驗證實驗平均組數(shù)含量13.1123.1333.11平均3.12以該條件做三次實驗與第五組第結果相比較得出第五組提取率大于優(yōu)化后條件所以最終條件是：時間為2h，溫度是80攝氏度，料液比1:25，乙醇體積90%。3.4蒲公英黃酮體外抗氧化活性研究結果3.4.1蒲公英總黃酮還原力的測定結果從圖3-5中可以看出，質量濃度繪制在橫坐標上，吸光度繪制在縱坐標上。隨著蒲公英中總黃酮濃度的增加，還原能力增加，還原能力與蒲公英總黃酮濃度呈線性關系。隨著濃度的增加和抗壞血酸之間的差距增大，蒲公英的總黃酮提取物在較高濃度下高于VC。圖3-5蒲公英黃酮還原力的對比3.4.2蒲公英總黃酮清除DPPH自由基能力測定結果首先需要利用蒲公英總黃酮和vc的溶液制成不同濃度。以質量濃度為橫坐標，以間隙率為縱坐標。結果見圖3-6。由圖3-6可知，蒲公英總黃酮提取物對DPPH自由基清除率體現(xiàn)出正相關性，隨著濃度增加，清除率也會隨之提高。從整體上看，其清除率比VC高。圖3-6蒲公英黃酮對DPPH自由基清除能力對比3.4.3蒲公英總黃酮清除·OH自由基能力測定結果將蒲公英總黃酮水溶液和VC配制成不同濃度的溶液，在橫坐標上繪制質量濃度，在縱坐標上繪制清除率。結果如圖3-7所示。由圖3-7可知，蒲公英總黃酮提取物對·OH-自由基清除率隨著濃度增加逐漸增加，并且高于VC的清除能力。圖3-7蒲公英黃酮對·OH自由基清除能力對比3.4.4蒲公英總黃酮清除O2-·自由基能力測定結果將蒲公英總黃酮和vc的溶液制備成不同濃度。以質量濃度為橫坐標，以凈率為縱坐標繪制曲線。結果見圖3-8。由圖3-8可知，蒲公英總黃酮提取物對O2-·自由基清除率隨著濃度增加而增加，并且其清除能力高于VC。圖3-8蒲公英黃酮對O2-·自由基清除能力對比

第四章結論實驗通過變量控制的方式，測量了不同因素對蒲公英總黃酮產率的影響。其中，最主要的影響因素是乙醇的濃度，其次是料液比。而提取時間的影響程度較低。通過試驗發(fā)現(xiàn)，時間為2h，溫度是80攝氏度，料液比1:25，乙醇體積90%。，可以得到最好的提取效果。并且在抗氧化試驗中，也可以得蒲公英黃酮的還原能力強于VC。而且對O2-、DPPH、·OH自由基的清除能力也強于VC。

致謝此次論文是由張海悅導師指導完成的，老師淵博的知識及崇高的風度，對我產生了深遠的影響。我不僅設定了一個偉大的學習目標，掌握了基本的研究方法，也讓我了解了很多做人的道理。在這里，我要向我的導師表示我的崇高敬意和衷心的感謝!在撰寫論文的過程中，我遇到了很多問題。在老師的耐心指導下，問題得到了解決。于是在這里，又對老師說：老師，謝謝你！時間過得像一股水流，眨眼之間就到了大學畢業(yè)的時候，以后很難聚在一起。我要對長春工業(yè)大學食品科學與工程專業(yè)的全體教師表示衷心的感謝。謝謝你們四年的辛勤工作和培養(yǎng)。謝謝你們教會我們做人的原則。謝謝你們四年來不知疲倦的教導！我很高興在過去的四年里，在我的學習、生活和工作中，我遇到了許多熱心的朋友。是他們讓我在溫暖的環(huán)境中度過四年的大學生活。感恩不能用言語來衡量，不過我還是想用最簡單的詞表達我最崇高的敬意。最后，感謝父母，助我在漫長的一生中找回了自己的方向。在未來的日子里，我會加倍努力工作，不辜負父母對我的高度期望！我會尊敬他們，回報他們！爸爸媽媽，我愛你們！“風和海浪將有時間，云將直接駛向大海。"這是我十幾歲的時候最喜歡的詩，用這作為本文的結尾，也是人生的終點。我希望我能繼續(xù)我的童年夢想，永不放棄。

參考文獻[1]董雙雙,袁悅,楊志偉.大孔吸附樹脂在黃酮類化合物分離純化中的應用[J].精細與專用化學品,2016,24(11):29-32.[2]凌云,鮑燕燕,朱莉莉,鄭俊華,蔡少青,肖越.蒲公英化學成分的研究[J].中國藥學雜志,1997(10):10-12.[3]凌云,張永林,蔡申,徐揚,蔡少青,鄭俊華.

堿地蒲公英的化學成分研究[J].

中國中藥雜志,1998,40-41,64.[4]YaoW,LinW-Y,ZhouC-X,etal.StudiesonconstitutesfromTaraxacummongolicum[J].ChinaJChinMaterMed,2007,32(10):926-929.[5]ShiS-Y,ZhouC-X,XuY,etal.StudiesonchemicalconstituentsfromherbsofTaraxacummongolicum[J].ChinaJChinMaterMed,2008,33(10):1147-1157.[6]LingY,XuY,ZhangJ-H,etal.TriterpenoidsconstituentsofTaraxacumsinicum[J].ChinTraditHerbDrug,1998,29(04):224-227.[7]XuD,HouF-F,WuL-J,etal.ChemicalConstituentsStudyofTaraxacumohwanum[J].ChinaJChinMaterMed,2004,29(03):278-280.[8]李文娜,肖苑,陳陽,etal.杜仲葉綠原酸提取物與綠原酸、維生素C體外抗氧化比較[J].食品工業(yè)科技,2012,33(11).[9]SinghR,JainSC,andJainR.AntioxidantActivityofSomeMedicinallyImportantAridZonePlants[J].AsianJournalofExprimentScience,2009,1(23):215.[10]BarreiraJCM,FerreiraICFR,OliveiraMPP,etal.Antioxidantactivitiesoftheextractsfromchestnutflower,leaf,skinsandfruit[J].FoodChemistry,2008,107:1106.[11]LiS,BianH,LiuZ,WangY,DaiJ,HeW,LiaoX,LiuR,LuoJ.ChlorogenicacidprotectsMSCsagainstoxidativestressbyalteringFOXOfamilygenesandactivatingintrinsicpathway[J].EuropeanJournalofPharmacology,2012674(2),6572[12]呂澤田，姜德勇，田惠爭，等.蜂膠中黃酮類化合物抑制腫瘤作用的試驗與應用[J]。蜜蜂雜志，1999,12(3):8～10[13]SatoY,ItagakiS,KurokawaT,OguraJ,KobayashiM,HiranoT,SugawaraM,IsekiK.I