抗體純化簡(jiǎn)明操作手冊(cè)

1抗體純化方法簡(jiǎn)明手冊(cè)本手冊(cè)為大家簡(jiǎn)明扼要的介紹了鹽析法、冷酒精沉淀法、Deae-sephadexa-50柱層析法、SPA-sepharosecl-4b親和層析法及高效和液相色譜純化單克隆抗體的原理、材料、器材和具體操作步驟，簡(jiǎn)單明晰，可操作性和實(shí)用性較強(qiáng)。由于時(shí)間倉促，水平局限，書中難免存在一些錯(cuò)誤和缺陷，也請(qǐng)大家多多批評(píng)指正。完全佐劑，質(zhì)量在進(jìn)口試劑水平，價(jià)格低廉，大量現(xiàn)貨銷售，供應(yīng)多家科研和生產(chǎn)用戶。質(zhì)量超一流，可為您節(jié)省大量實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)，生產(chǎn)用戶可大大降低生產(chǎn)成本歡迎聯(lián)系QQ:1632285428電話：187014518742精制抗體的方法很多。一般采用綜合技術(shù)，避免蛋白變性。例如分離IgG時(shí)，多結(jié)合使用鹽析法與離子交換法，以求純化。提取IgM的方法也很多，如應(yīng)用凝膠過濾與制備電泳法，或離子交換與凝膠過濾等。蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)周圍親水基團(tuán)與水形成水化膜的程度，以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。當(dāng)用中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液，中性鹽對(duì)水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失。同時(shí)，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白溶解度降低，使蛋白分子之間聚集而沉淀。主要材料（1）正常人混合血清；滅菌生理鹽水。（2）飽和硫酸銨溶液的配制配制好的飽和硫酸銨，瓶底應(yīng)有結(jié)晶析出。（3）奈氏試劑配制3稱HgI11.5克，KI8克，加蒸餾水至50ml溶解，攪拌溶解后，再加入20%NaOH50ml。（4）0.02M，PH7.4磷酸鹽緩沖鹽液（PBS）配制：B液：0.2MNaH2PO4：NaH2PO4·2H2O3.12克，加蒸餾水至倍稀釋即成（6）20%磺基水楊酸2.器材普通冰箱、離心機(jī)、電磁攪拌器，751紫外分光光度計(jì)、扭力天平、粗天平。透析袋、尼龍繩、細(xì)竹棒、精密PH試紙（PH5.5-9.0）、眼科鑷子、小剪刀。燒杯、量筒、吸管、滴管、滅菌小瓶、試管等。實(shí)驗(yàn)操作取1Xml血清加1Xml生理鹽水，于攪拌下逐滴加入2Xml上，使其充分沉淀解沉淀，再逐滴加飽和硫酸銨X/2ml。置于4℃3小時(shí)以上此時(shí)，硫酸銨的飽和度為4-球蛋白，以0.02mol/lPH7.2PBS溶解至xml裝入透析袋。對(duì)PBS充分透析、換液3次，至奈氏試劑測(cè)透析色，即無銨離子為止。取透析袋內(nèi)樣品少許作適當(dāng)倍數(shù)稀釋后，以752型紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白含量。影響鹽析的因素影響鹽析的因素很多，如蛋白質(zhì)的濃度，鹽的濃度，飽和度和PH，溫度等都可影響鹽析的結(jié)果，操作時(shí)要充分注意。1.蛋白質(zhì)的濃度：鹽析時(shí)，溶液中蛋白質(zhì)的濃度對(duì)沉淀有雙重影響，既可影響蛋白質(zhì)沉淀極限，又可影響蛋白質(zhì)的共沉淀作用。蛋白質(zhì)濃度愈高，所需鹽的飽和度極限愈低，但雜蛋白的共沉作用也隨之增加，從而影響蛋白質(zhì)的純化。故常將血清以生理鹽水作對(duì)倍稀釋后再鹽析。2.離子強(qiáng)度：各種蛋白質(zhì)的沉淀要求不同的離子強(qiáng)度。例如當(dāng)硫酸銨飽和度不同，析出的成分不同，飽和度為50%時(shí)，少量白蛋白及大多數(shù)擬球蛋白析出；飽和度為33%時(shí)γ球蛋3.鹽的性質(zhì)：最有效的鹽是多電荷陰離子1、PH值：一般來說，蛋白質(zhì)所帶靜電荷越多，它的溶解度越大。改變PH改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)，也就改變了蛋白質(zhì)52、溫度：鹽析時(shí)溫度要求并不嚴(yán)格一般可在室溫下操作。血清蛋白于25度時(shí)較0度更易析出。但對(duì)溫度敏感的蛋白質(zhì)，則應(yīng)于低溫下鹽析。大沉淀而易于分離。二、冷酒精沉淀法分離過程如下：（）度。在激烈攪拌的條件下，加預(yù)冷的酒精（-20度）到最終濃度為20%，保持在-5度。產(chǎn)生的沉淀（a含有大多數(shù)種類的免疫球蛋白。2、沉淀A懸浮于25倍體積的0.15-20mol/lNaCL溶液（冷）中，加有0.05mol/l醋酸調(diào)節(jié)PH到5.1，產(chǎn)生的沉淀（B）,包括大部分的IgA和IgM,IgG留在上清液內(nèi)。3、調(diào)節(jié)上清液的PH到7.4，加冷酒精（-20—30度）到最終濃度為25%，維持在-5度。所得到的的沉淀（C）含有90%-98%IgG。不同動(dòng)物，IgG分離的條件和產(chǎn)量略有不同。4、從沉淀（b）可按照下述方法進(jìn)一步分離出IgA和IgM的混合物：將沉淀（b）懸浮在0度水中，調(diào)節(jié)PH到5.1，離心去除不溶的蛋白。調(diào)節(jié)上清液離子強(qiáng)度到0.01-0.0075，6PH5.5.然后加冷酒精到最終濃度為10%，保持在-2度或-3度低溫，所得到的沉淀（b-b）主要含IgA和IgM。表：從幾種動(dòng)物和人血清和沉淀a分離IgM的條件沉淀?xiàng)l件酒精濃度離子強(qiáng)度人0家兔豚鼠三、Deae-sephadexa-50柱層析法Deae-sephadexa-50（二乙胺基-乙基-葡萄糖凝膠a-50）為弱堿性陽離子交換劑。用NaoH將氯離子轉(zhuǎn)變?yōu)閴A離子型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白屬于中性蛋白（等電點(diǎn)為PH6.85-7.5）,其余均屬酸性蛋白。PH7.2-7.4的環(huán)境中，酸性蛋白均被Deae-sephadexa-50吸附，只有γ球蛋白不而其他蛋白則被吸附在柱上，從而便可分離獲得純化的IgG。試劑和器材7（1）鹽析提取的人γ球蛋白（2）0.5MNaoH,0.5M鹽酸2MNaCL,10%疊氮鈉（3）Deae-sephadexa-50，聚乙二醇（PEG）（4）0.1M，PH7.4PBS2、器材括抽氣機(jī)、干燥瓶、布氏漏斗、橡皮墊圈、抽濾瓶PH計(jì)（3）透析袋、坐標(biāo)紙、濾紙、PH精密試紙（4）量筒、燒杯、試管、吸管、滴管、滅菌小瓶等。操作步驟：1.Deae-sephadexa-50預(yù)處理稱Deae-sephadexa-50(下稱a-50)5克，懸于500ml蒸餾水內(nèi)，1h后傾去上層細(xì)粒。按每克a-50加0.5MNaoH15ml的比例，將a-50浸泡于0.5MNaoH溶液中，攪勻，靜置30分鐘，裝入布氏漏斗（墊有2層濾紙）中抽濾，并反復(fù)用蒸餾水洗至PH呈中性；再以0.5MNaoH再處理一次。處理完2.裝柱（1）將層析垂直固定于滴定架上，柱底墊一圓形尼龍紗，8出水口接一乳膠或塑料管并關(guān)閉開關(guān)。再倒入經(jīng)預(yù)處理并以同上緩沖液調(diào)成稀糊狀的a-50。等a-50凝膠沉降2-3cm高時(shí)，開啟出水口螺旋夾，控制流速1ml每分鐘，同時(shí)連續(xù)倒入糊狀a-50凝膠至所需高度。（3）關(guān)閉出水口，待a-50凝膠完全沉降后，柱面放一圓形濾紙片，以橡皮塞塞緊柱上口。通過插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。啟開上口橡皮塞入下口螺旋夾，使柱中液體緩慢滴出，當(dāng)柱面液體與柱面相切時(shí)，立即關(guān)閉出水口，以毛細(xì)滴管沿為宜）。松開出水口螺旋夾使面樣品緩慢進(jìn)入柱內(nèi)，至與柱面相切時(shí)，立即關(guān)閉下口，以少量洗脫液洗柱壁2-3次；再放開出水口，使洗液進(jìn)入床柱，隨后立即于柱面上加入數(shù)毫升洗脫液，緊塞柱上口，使整個(gè)洗脫過程成一密閉系統(tǒng)。并控制流速12-14滴每分鐘。2、收集開始洗脫的同時(shí)就以試管進(jìn)行收集。每管收集3-5ml。共3、測(cè)蛋白以751型紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定每管OD9OD值260nm，按公式計(jì)算各管蛋白含量。并以O(shè)D280nm為縱坐標(biāo)，以試管編號(hào)為橫坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。4、合并濃縮將洗脫峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進(jìn)行合并，以PEG（mw6000）濃縮至所需體積，加入0.02%疊氮鈉防腐，于4℃保存時(shí)應(yīng)貯于-40℃冰箱中。5、a-50凝膠的再生在柱上先以2M氯化鈉洗脫蛋白至流出液的OD值280小于0.02，再以蒸餾水洗去柱中鹽。然后按預(yù)處理過程將a-50再處理一遍既達(dá)到再生。近期用時(shí)泡于洗脫緩沖液中4℃保存；近期不用時(shí)，以無水乙醇洗2次，再置50度溫箱烘干，裝瓶內(nèi)保存。注意事項(xiàng)（1）柱的選擇：從理論上說，只要柱足夠長，就能獲得理想的分辨率，但由于層析柱流速同壓力梯度有關(guān)，柱長增加使流速減慢，峰變寬，分辨率降低。柱的直徑增加，使流體流動(dòng)的不均勻性增加，分辨率明顯下降。（2）純化過程必須嚴(yán)格控制緩沖液的PH及離子強(qiáng)度。樣品與a-50凝膠必須用洗脫液徹底平衡后，才能進(jìn)行柱層析。（3）所裝的柱床必須表面平整，無溝流及氣泡，否則應(yīng)重（4）洗脫過程應(yīng)嚴(yán)格控制流速，切勿過快。（5）上樣的體積要小，濃度不易過高。（6）加樣及整個(gè)洗脫過程中嚴(yán)防柱面變干。四、SPA-sepharosecl-4b親和層析法葡萄球菌a蛋白（SPA）具有多種哺乳動(dòng)物IgG分子fc段結(jié)合的能力，并與不同IgG亞類的結(jié)合力有所差別。改變PH及離子強(qiáng)度可洗脫結(jié)合于SPA-sepharosecl-4b柱上的IgG或不同的IgG亞類，可直接純化血清或小鼠腹水中的IgG抗體。試劑器材（1）SPA-sepharosecl-4b（2）磷酸緩沖液0.1MPH8.6加0.02%疊氮鈉0.1摩爾每升PH5.50.1摩爾每升PH4.00.1摩爾每升PH3.0分別加入0.02%疊氮鈉①0.1摩爾每升tris含0.5摩爾每升NaCL調(diào)整至PH8.6加加入0.02%疊氮鈉②0.1摩爾每升醋酸鈉含0.5摩爾每升NaCL調(diào)整至PH2.2加加入0.02%疊氮鈉操作步驟用0.1MPH8.6磷酸緩沖液浸泡SPA-sepharosecl-4b凝膠，13分鐘。按1克干膠200ml上述緩沖液充分洗滌凝膠用裝柱后用0.1MPH8.6磷酸緩沖液平衡標(biāo)本可用硫酸銨粗提物，先10000g離心除去雜質(zhì)，必要時(shí)液調(diào)整標(biāo)本液PH至8.6或?qū)ζ胶庖和肝鲞^夜。加樣，一般按25-30mgIgG/g濕膠比例加樣，室溫作用15分鐘，用0.1摩爾每升PH8.6磷酸緩沖液充分淋洗，到淋洗用不同PH的枸櫞酸洗脫液洗脫，流速20ml每小時(shí)。如純化PH3.0用②再生緩沖液洗脫剩余蛋白，洗脫后用①再生緩沖液平衡完成再生收集洗脫液測(cè)OD值，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要透析除鹽后進(jìn)行濃度、純度和活性測(cè)定。注意事項(xiàng)（1）SPA-sepharosecl-4b凝膠價(jià)格昂貴，可再生后反復(fù)使方法：先用10倍柱體積0.1mol/LPH8.6tris含0.5mol/LNaCL溶液洗脫柱上的殘存雜蛋白；再用10倍柱體積0.1mol/LPH4.5醋酸鈉緩沖液含0.5mol/LNaCL溶液洗脫柱上的殘存雜蛋白；0.1mol/LPH8.0磷酸緩沖液平衡，4℃貯存。（1）SPA-sepharosecl-4b親和層析法還可用于；①除去抗體液中IgG，檢測(cè)非IgG抗體（如IgM）的生物學(xué)活性；②除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段；③吸收或純化免疫復(fù)合物。具有與SPA結(jié)合的能力。五、高效和液相色譜純化小鼠腹水中單克隆抗體從小鼠腹水中純化mcab的方法有鹽析、離子交換層析、凝膠過濾和親和層析等。應(yīng)用tskdeae-spw離子交換層析柱從小鼠腹水中純化mcab不僅純化速度快，回收率和得率高，而且保持良好的生物學(xué)活性。根據(jù)離子交換原理，將經(jīng)硫酸銨粗提的含mcabγ球蛋白上樣結(jié)合于層析柱上，通過增加洗脫液中的離子強(qiáng)度，洗脫并收集蛋白峰。試劑和器材（1）tskdeaespw離子交換層析柱（2）高效液相色譜（包括控制系統(tǒng)、溶劑傳遞系統(tǒng)、高壓加壓活門和紫外280nm監(jiān)測(cè)系統(tǒng)）操作步驟腹水離心10000g，10分鐘，除去細(xì)胞和雜質(zhì)，在4℃下逐滴加入飽和硫酸銨溶液，使終濃度為40%飽和硫酸銨；攪拌20-30分鐘；離心，沉淀用40%飽和硫酸銨洗滌2次后溶于PBS，對(duì)緩沖液a（PH8.5，20毫摩爾每升tris緩沖液）透析除鹽；用帶有1000微升樣品環(huán)的高壓加樣活門將透析后粗提物加樣與經(jīng)緩沖液a液平衡的tskdeaespw離子交換層析柱；洗脫液流速1毫升每分鐘；摩爾每升醋酸鈉1-2分鐘（線性梯度洗脫5-20%緩沖液b；20-22分：20-0%緩沖液b；洗脫液用紫外280納米進(jìn)行監(jiān)測(cè)；收集蛋白峰，進(jìn)行含量、純度和活性測(cè)定。注意事項(xiàng)（1）所用緩沖液和加樣粗提物均需0.2微米濾膜過濾（2）在本實(shí)驗(yàn)條件下，IgG1峰一般在線性梯度洗脫開始11-12分鐘。但不同類和亞類抗體以及不同特異性mcab的存下面是收錄的TMB可溶性底物、HRP酶穩(wěn)定劑、弗氏佐劑和不完全佐劑的說明書，有用的朋友可以看一下作參考用。TMB可溶性底物(TMBSolubleSubstrate)Cat#1001TMB可溶性底物（SolubleTMBSubstrate）TMB底物液的主要成分是3,3’,5,5’–四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-te·注意事項(xiàng):1.本產(chǎn)品對(duì)各種氧化劑敏感，應(yīng)在使用過程中避免污染，切忌將槍頭直作過程中避免陽光的直射，分裝的容器建議用塑料容器，避免使用金屬容器以及細(xì)菌和氧化還原劑污染的容器。3.分裝時(shí)最好使用稱重的方法或蠕動(dòng)泵。4.QQ:1632285428業(yè)務(wù)電話根過氧化物酶穩(wěn)定劑（HRPSTABILIZER）QQ:1632285428業(yè)務(wù)電話氏完全