不同品種梨中可溶性酚的測定及其抗氧化活性

不同品種梨中可溶性酚的測定及其抗氧化活性

梨是河北省的主要果種，種植面積大，產(chǎn)量高。目前栽培面積達到18萬hm2,產(chǎn)量700萬t。但高產(chǎn)量并不一定意味著高收益。原因在于:一方面,惡劣天氣等因素使梨果生產(chǎn)過程中不可避免地出現(xiàn)殘次果而降低商品價值,另一方面由于信息不暢使供求關(guān)系不平衡而導(dǎo)致梨果滯銷而積壓,而有限的冷藏能力又限制了梨果的及時入庫,造成了腐爛和損耗。這些方面都影響了梨果產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟收益。加工可以消耗殘次果和滯銷果,提高產(chǎn)品的附加值,增加經(jīng)濟效益。在制取罐頭、果汁等產(chǎn)品過程中,會產(chǎn)生果皮、果心等廢棄物,目前主要是作為飼料或者被丟棄,還沒有更好地被開發(fā)利用。已有的關(guān)于蘋果多酚、茶多酚、葡萄多酚的研究報道認(rèn)為,多酚具有抗氧化、抗衰老等重要的生理功能,但對梨多酚的研究剛剛開始,目前主要集中在酚類物質(zhì)分析和果實褐變的關(guān)系方面,并且僅限于對果肉的研究,對梨酚類物質(zhì)的抗氧化研究則鮮有報道,僅史國安等報道沙梨果汁具有顯著的清除羥自由基能力和較強的抗氧化活性,趙金偉等比較了蘋果梨幼果和成熟果果皮中提取的酚類物質(zhì)抗氧化活性,但并未涉及到常見的梨品種。本實驗以北方主栽品種梨為材料,采用高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)分別對果皮、果心和果肉部分所含的酚類物質(zhì)進行定性和定量分析,同時開展了多酚提取物的抗氧化研究,旨在為梨的深加工和殘渣利用提供理論參考。1材料和方法1.1香、早酥梨的采集2012年8月和9月分別在趙縣范莊、晉州市趙蘭莊等地管理水平一致的果園采摘已達到商品化成熟度的黃冠、綠寶石、雪梨、鴨梨、豐水、南水、圓黃、黃金、華山、五九香、早酥共11個品種梨,每個品種采摘50kg。采摘后立即運回實驗室,除去田間熱后,分別對果皮、果心和果肉取樣,液氮速凍后-80℃冰箱保存,用于測定。熊果苷(純度≥98%)、沒食子酸(純度≥99%)、綠原酸(純度≥95%)、(+)-兒茶素(純度≥98%)、咖啡酸(純度≥98%)、表兒茶素(純度≥90%)、p-香豆酸(純度≥98%)、蘆丁(純度≥94%)、槲皮素(純度≥95%)標(biāo)準(zhǔn)品美國Sigma公司。1.2高效液相色譜儀UV-2100分光光度計美國Unico公司;L-2000高效液相色譜儀(配備L-2400UV檢測器,LachromC18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm))日本Hitachi公司;3K30高速離心機美國Sigma公司。1.3方法1.3.1酚類物質(zhì)的含量測定參照鞠志國的Folin-酚方法測定。以綠原酸為標(biāo)樣建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,于765nm波長處測定OD值計算酚類物質(zhì)的含量。1.3.2酚類物質(zhì)檢測提取物處理:分別稱取適量果皮、果肉、果心,加入一定體積的乙醇溶液高速勻漿提取,離心后取上清液過固相C18萃取小柱,以甲醇淋洗,過0.45μm濾膜,馬上進行HPLC檢測。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時間對酚類物質(zhì)進行定性。各種酚類物質(zhì)的含量采用HPLC法測定。色譜條件:HITACHIL-2000高效液相色譜儀器自帶的反相LachromC18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm),檢測波長280nm,柱溫30℃,流動相為5%冰醋酸水溶液(A)、乙腈(B)。采用梯度洗脫程序,洗脫程序為0~20min,5%~15%B,21~40min,15%~45%B,流速為1.0mL/min,進樣體積為10μL。1.3.3抗氧化性能評價以無水乙醇為溶劑分別對不同品種梨的果皮、果心和果肉進行提取,采用清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基法和鐵氧化鄰二氮菲法測定羥自由基清除能力進行抗氧化性能評價。分別以Trolox和VC為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),做其質(zhì)量濃度和DPPH自由基、羥自由基清除率的標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立方程,由被測溶液的DPPH自由基、羥自由基清除率計算出Trolox當(dāng)量抗氧化能力(troloxequivalentantioxidantcapacity,TEAC)(μg/g,即每克樣品鮮質(zhì)量相當(dāng)于每微克Trolox的抗氧化能力)和VC當(dāng)量的抗氧化能力(ascorbicacidequivalentantioxidantcapacity,AEAC)(mg/g,即每克樣品鮮質(zhì)量相當(dāng)于每毫克VC的抗氧化能力)。TEAC或AEAC值越高則對DPPH自由基、羥自由基的清除能力越強。1.4不同品種間酚含量的變異采用統(tǒng)計分析軟件SPSS18.0對實驗數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗和相關(guān)性分析。由圖1可知,與果皮和果心相比,果肉酚類物質(zhì)的含量最低,平均值僅為果皮的16.3%,果心的10.9%。果肉酚的含量的變異系數(shù)為37.6%,品種間差異較大,其中五九香和早酥果肉中酚的含量最高;果心中酚的含量的變異系數(shù)為41.1%,品種間差異明顯,綠寶石和雪梨果心中酚的含量最高;果皮中酚的含量的變異系數(shù)為16.3%,品種間差異小于果心和果肉,早酥和南水果皮中酚的含量最高。2.2不同品種梨酒發(fā)酵過程中表兒茶素的含量圖2顯示了各種酚類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的出峰時間和峰型圖,峰型銳利,各個樣品可以完全分離,說明色譜條件可以滿足酚類物質(zhì)檢測的需要。由圖3可知此條件可以滿足樣品分析的需要。由表1可知,與果皮和果心相比,果肉所含酚類物質(zhì)種類較少,共檢出熊果苷、綠原酸和表兒茶素、沒食子酸和蘆丁5種物質(zhì),其中熊果苷、綠原酸和表兒茶素在11個品種中都有檢出,且為果肉中主要的酚類物質(zhì)。除圓黃和華山果肉的綠原酸和熊果苷的含量相近外,其余品種綠原酸的含量均高于熊果苷,并以五九香和早酥中綠原酸的含量最高;早酥梨中熊果苷的含量最高;早酥和五九香梨中表兒茶素的含量最高。在果皮中共檢出熊果苷、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、香豆酸、蘆丁和沒食子酸8種酚類物質(zhì),其中熊果苷、兒茶素、綠原酸、表兒茶素和香豆酸在所測品種中都有檢出,并且前三者是果皮的主要酚類物質(zhì),其余則含量較低,且分布在不同品種梨的果皮中。除鴨梨外,其余品種果皮中熊果苷的含量均高于綠原酸,其中熊果苷含量最高的品種是南水,其次是早酥;鴨梨果皮中綠原酸的含量最高;五九香和早酥果皮中表兒茶素的含量最高。果心中共檢出熊果苷、沒食子酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、香豆酸和蘆丁8種酚類物質(zhì),其中熊果苷、綠原酸和表兒茶素在所檢測品種中都有檢出,且前兩者為果心的主要酚類物質(zhì)。除豐水、早酥和黃金的果心中熊果苷和綠原酸的含量相近外,其余品種中綠原酸的含量均高于熊果苷。綠寶石和雪梨的果心中熊果苷和綠原酸的含量最高;五九香果心中表兒茶素的含量最高。沒食子酸、蘆丁、兒茶素、咖啡酸和香豆酸分布在不同品種梨的果心中,且含量很低。2.3dpph自由基清除能力由圖4A可知,圓黃和早酥果皮的乙醇提取液對DPPH自由基清除能力最強,黃冠果皮的清除能力最差;由圖4B可知,雪梨、鴨梨、黃冠、華山、南水、綠寶石和早酥果心對DPPH自由基的清除能力強,而豐水最弱;由圖4C可知,早酥果肉對DPPH自由基的清除能力最強,其次是五九香,鴨梨和雪梨再次之,其余品種的清除能力接近。所試品種的果肉TEAC都明顯低于果皮和果心,說明果肉對DPPH自由基清除能力低于果皮和果心;果皮和果心對DPPH自由基清除能力因品種而異,圓黃、五九香、黃金和豐水的果皮TEAC高于果心,其余品種則果心高于果皮(圖4D)。2.4果心清除羥自由基能力測定由圖5A可知,五九香梨果皮對羥自由基的清除能力最強,鴨梨和早酥次之,黃金再次之,其余品種的清除能力相當(dāng);由圖5B可知,黃冠、雪梨、早酥、鴨梨、華山和綠寶石的果心清除羥自由基能力最強,圓黃次之,南水、五九香和黃金、豐水清除能力較弱;由圖5C可知,早酥果肉清除羥自由基的能力最強,五九香次之,其余品種清除能力接近。所試品種果肉的AEAC都遠(yuǎn)低于果皮和果心,說明果肉清除羥自由基能力不如果皮和果心。除五九香、黃金和豐水外,其他品種的果心AEAC都高于果皮,說明果心清除羥自由基的能力高于果皮。五九香果皮的AEAC高于其他品種,說明清除羥自由基能力較強(圖5D),值得關(guān)注。2.5除率、羥自由基清除率的相關(guān)性分析為研究酚含量與DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力的關(guān)系,分別就酚含量和不同品種梨的果皮、果肉和果心的DPPH自由基清除率、羥自由基清除率之間做了相關(guān)性分析,結(jié)果見表2。由表2可知,果肉酚含量與DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力間,以及果皮酚含量與DPPH自由基清除能力間均分別達到了極顯著正相關(guān);果心酚含量與DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力間,果皮酚含量與羥自由基清除能力間均達到顯著正相關(guān)。這表明酚類物質(zhì)與DPPH自由基和羥自由基的清除能力關(guān)系密切,具有抗氧化性。3清除dpph自由基的能力自由基是由生物體在生命活動過程中的生物化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的中間產(chǎn)物。在某些病理情況下自由基在機體內(nèi)積累,因其具有很高的反應(yīng)活性,會在分子、細(xì)胞乃至器官水平給機體造成損傷,從而加快機體的衰老過程,并可誘導(dǎo)癌癥、心血管疾病等發(fā)生。在眾多的自由基中,羥自由基是最活潑的,也是對機體危害最大的一種自由基。因此天然提取產(chǎn)物具有清除羥自由基能力的特性越來越引起人們的重視,是不可小覷的寶貴資源,等待被開發(fā)利用。而清除DPPH自由基是最為常見的體外檢測抗氧化劑清除自由基的方法,用以篩選抗氧化劑。分別比較果皮、果心、果肉的DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力,發(fā)現(xiàn)不同品種在兩者的排序不一致,可能與實驗中酚類物質(zhì)清除DPPH自由基和羥自由基的原理不同有關(guān)。在本實驗中,分別采用Trolox和VC做為清除DPPH自由基和羥自由基的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),而非統(tǒng)一采用Trolox為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),原因在于測定清除羥自由基實驗時,當(dāng)Trolox質(zhì)量濃度從0.01mg/mL增加到10mg/mL時仍檢測不到清除能力,推測Trolox可能不具備清除羥自由基的能力,盡管其清除DPPH自由基能力很強。說明同一種抗氧化劑對不同自由基清除能力不同。由本實驗結(jié)果可知,果皮、果心中酚類物質(zhì)的含量遠(yuǎn)高于果肉,且同時具有較強的清除DPPH自由基和羥自由基的作用,因此值得開發(fā)利用。為了進一步確定參與自由基清除活動的酚類物質(zhì)種類,以含量較高且每個品種、部位都含有的熊果苷、綠原酸和表兒茶素為例,分別做了與DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力的相關(guān)性分析,結(jié)果顯示僅果皮中含有的表兒茶素與兩種自由基清除能力呈顯著正相關(guān),果肉中的綠原酸和表兒茶素與兩種自由基清除能力呈顯著正相關(guān),其余則沒有達到顯著相關(guān)水平,特別是熊果苷,盡管含量較高,但似乎與自由基清除關(guān)系并不密切。趙金偉等用熊果苷和綠原酸純品對DPPH自由基和羥自由基的清除能力實驗驗證了熊果苷的清除能力明顯低于綠原酸。GalvisSáchez等的研究也表明熊果苷與抗氧化能力關(guān)系不密切,他認(rèn)為抗氧化能力不是由某個酚所決定。說明清除自由基可能是多種酚類物質(zhì)共同作用的結(jié)果,低含量的酚類物質(zhì)對自由基的清除作用也不容忽視。在本實驗中,梨果肉檢測出熊果苷、沒食子酸、綠原酸、表兒茶素和蘆丁5種物質(zhì),其中,綠原酸和表兒茶素是果肉的主要酚類物質(zhì),與Tanrioven等的報道一致;熊果苷也是梨果肉中的主要酚類成分,與趙金偉等的報道一致。果皮中檢出熊果苷、綠原酸、表兒茶素、咖啡酸、兒茶素、香豆酸和蘆丁,其中熊果苷和綠原酸是果皮的主要酚類物質(zhì),與趙金偉等研究的蘋果梨、李磊等研究的黃冠梨的結(jié)果一致。綜上可知,梨果皮、果心由于酚類物質(zhì)的含量遠(yuǎn)高于果肉,且所含的酚類物質(zhì)具有抗氧化性,所以梨的多酚物質(zhì)具有提取利用的價值。通過對梨加工后廢棄的果心、果皮進行多酚的提取,對資源的合理有效開發(fā)利用,減少浪費和保護環(huán)境具有非常重要的意義。4不同品種梨品種所含酚類物質(zhì)的檢測4.1梨果心中酚類物質(zhì)的含量高于果皮,果肉中的含量最低?？梢岳霉ず凸奶崛》宇愇镔|(zhì)。4.2梨果心和果皮均檢測出熊果苷、沒食子酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、香豆酸和蘆丁8種酚類物質(zhì),而果肉只檢測出熊果苷、沒食