犬急性心肌損傷血清肌酸激酶mbmass的測定

犬急性心肌損傷血清肌酸激酶mbmass的測定

肌酸激酶pmmas（k-mmmas）是心肌酶的生物學(xué)指標。臨床測定發(fā)現(xiàn),血清CK-MBmass較血清CK-MB活性及CK活性優(yōu)越。國外新修訂的AMI診斷標準中已將血清CK-MBmass列為主要生化指標之一。復(fù)習文獻未見血清CK-MBmass早期診斷急性心肌損傷的報道。本文制做急性心肌損傷犬動物模型,連續(xù)采血測定CK-MBmass、CK-MB活性、CK活性,觀察CK-MBmass動態(tài)變化及損傷心肌的組織學(xué)改變,并與CK-MB活性、CK活性對比,探討CK-MBmass早期診斷急性心肌損傷的價值。1材料與實驗方法1.1儀器1.1.1影像及心電記錄設(shè)備美國記憶公司生產(chǎn)的C型臂數(shù)字減影X光機,日本東芝公司生產(chǎn)的32號心電生理記錄儀。1.1.2導(dǎo)管設(shè)備18G穿刺針,6-7F動脈鞘管,6F豬尾導(dǎo)管,6-7FLauncherJudkins左、右冠狀動脈指引造影導(dǎo)管(需手工塑形),0.035×45cm,0.035×180cm肝素涂層導(dǎo)引導(dǎo)絲,0.014×190cmBALANCEMIDDLEWEIGHTUNIVERSALTM冠脈指引導(dǎo)絲,2.5×20mmSprinter球囊擴張導(dǎo)管(美國美敦力公司生產(chǎn))。1.1.3犬急性心肌損傷動物模型導(dǎo)管的制作將0.035×180cm導(dǎo)絲插入指引導(dǎo)管,其前端浸泡于90~100℃熱水中,使其前端角度消失而變直,然后將其前端塑成為直徑約為2.5cm的圓形,迅速浸泡于0~5℃水中約3min后即可成功。1.2急性心肌損傷動物模型制作1.2.1術(shù)前準備犬8只,體重(7~16)kg,雌雄不拘。戊巴比妥鈉30mg/kg進行靜脈淺麻醉,并視犬狀態(tài)隨時靜脈追加戊巴比妥鈉,保持淺麻醉狀態(tài)。手術(shù)過程中監(jiān)測犬呼吸、心率及心律等生命體征,保持呼吸道通暢,建立靜脈通道。1.2.2實驗方法將犬仰臥位固定,股動脈部位常規(guī)碘伏消毒,18G穿刺針以Seldinger法穿刺右側(cè)股動脈成功后,置入6F或7F動脈鞘管,應(yīng)用肝素2000單位鞘管內(nèi)彈丸式注入,以后每隔1h追加1000單位。將6Fjudkins左冠狀動脈指引導(dǎo)管或重新塑型的6~7Fjudkins右冠狀動脈指引導(dǎo)管,送至左冠狀動脈開口,首先進行冠狀動脈造影,觀察犬冠狀動脈的分布情況,特別是左前降支(LeftAnteriorDecendingArteries,LAD)。置入指引導(dǎo)絲至LAD中遠端,然后沿導(dǎo)絲置入2.5×20mm球囊至LAD中遠端1/3處,先以4個大氣壓(atm)使球囊完全充盈阻閉LAD約1min~3min,然后排空球囊,重復(fù)上述操作(2~3)次,進行缺血預(yù)適應(yīng),10min后以8atm充盈球囊持續(xù)阻閉LAD,造影證實球囊遠端血流完全中斷,并以心電圖有無損傷缺血性ST抬高及動態(tài)演變證實急性心肌損傷模型制備是否成功。血流完全中斷90min后中止手術(shù)。術(shù)中連續(xù)監(jiān)測12導(dǎo)聯(lián)心電圖,隨時記錄其變化。1.3采血方法動物實驗開始前靜脈采血1次,作為個體正常值。缺血預(yù)適應(yīng)后冠狀動脈球囊持續(xù)阻閉后每隔10min采血1次直至90min,每次采血2ml,3000r/min離心10min取血清立即測定或貯存于-40℃待測。1.4心肌標志物的測定CK-MBmass血清CK-MBmass采用微粒子酶聯(lián)免疫分析法,儀器及試劑均由美國Abbott公司提供,其中儀器為化學(xué)發(fā)光免疫分析儀AXSYMue617SYSTEM,其參考值(0~49.4)ng/ml。血清CK-MB活性采用免疫抑制法,儀器及試劑均由羅氏公司提供,其中儀器為MODULAR模塊式生化分析系統(tǒng),其參考值(0.2~24)IU/L。血清CK活性采用速率法,其參考值(24~200)IU/L。1.5損傷心肌的組織學(xué)改變實驗結(jié)束后,處死動物。對缺血損傷區(qū)心肌病理切片,進行HE染色。觀察損傷心肌糖原及琥珀酸脫氫酶的變化。1.6統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗,P<0.05具有顯著性差異。2結(jié)果2.1心電圖監(jiān)測8只犬皆成功制作了急性心肌損傷的動物模型。心電圖監(jiān)測示ST段明顯上抬,且動態(tài)變化。充盈球囊,ST段上抬明顯,排空球囊,ST段回降至正常。2.2血清ck-mbmass、ck-mb活性的變化犬實驗前測定的血清CK-MBmass、CK-MB活性、CK活性值為個體正常值。以個體正常值為基礎(chǔ)值計算實驗后血清CK-MBmass、CK-MB活性、CK活性升高的程度,其中大于個體正常值2倍以上者為異常值。本文急性心肌損傷后血清CK-MBmass、CK-MB、CK活性均為異常值,其中有4只犬(4/8,50%)血清CK-MBmass、CK-MB活性的峰值大于實驗室參考值2倍以上;而CK活性值均小于實驗室參考值2倍,見表1。2.3mb活性、內(nèi)壓活性阻閉犬冠狀動脈后血清CK-MBmass、CK-MB活性、CK活性超過個體正常值2倍以上即出現(xiàn)異常值時間分別為30min~45min、30min~60min、45min~90min,見表2。2.4心肌細胞內(nèi)糖原顆粒及肉的脫氫酶變化損傷區(qū)心肌組織切片,HE染色,顯微鏡下觀察,缺血區(qū)心肌細胞內(nèi)糖原顆粒輕度減少,琥珀酸脫氫酶無明顯變化;損傷區(qū)心肌細胞內(nèi)糖原顆粒明顯減少,琥珀酸脫氫酶輕度減少。缺血區(qū)或損傷區(qū)的心肌細胞內(nèi)糖原顆粒及琥珀酸脫氫酶減少可呈島狀、篩狀或片狀分布,見圖1。未見壞死心肌細胞。3對急性心肌損傷大鼠血清刷血活性的初步解釋血清中CK-MB活性測定雖然是診斷缺血性心臟病最重要的指標之一,但由于干擾因素較多,測定結(jié)果有時不能真正反映體內(nèi)血清CK-MB的活性,甚至還會出現(xiàn)CK-MB活性大于總CK活性的情況。采用微粒子酶聯(lián)免疫分析法測定CK-MBmass,因其采用的是單克隆抗體,除具有抗原抗體反應(yīng)的特異性外,與其同工酶CK-BB及CK-MM無交叉反應(yīng),而且不受血清中其他酶類、蛋白物質(zhì)的干擾,靈敏度高,特異性強。在急性心肌損傷后30min~45min即可檢出,而且增高的幅度大,試劑穩(wěn)定性好。微粒子酶聯(lián)免疫分析法測定血清CK-MBmass在血清異常值出現(xiàn)時間、特異度、靈敏度及抗干擾等方面均優(yōu)于免疫抑制法測定的血清CK-MB活性,有助于臨床早期診斷應(yīng)用。病理組織學(xué)檢查顯示,急性心肌缺血20min心肌即出現(xiàn)改變,表現(xiàn)為糖原顆粒數(shù)量減少、體積變小,細胞內(nèi)跨小管系統(tǒng)、肌質(zhì)肌漿網(wǎng)水腫、變形等,這些早期改變是可逆的。若急性心肌缺血90min以上則出現(xiàn)細胞腫脹、細胞膜破壞、線粒體水腫及內(nèi)部斷裂等變化,細胞核染色質(zhì)中出現(xiàn)無定形的絮狀物聚集、邊緣加深及肌原纖維松馳等,為不可逆性心肌損傷。本文阻閉犬冠狀動脈左前降支中遠端后造成急性心肌損傷動物模型,病理組織學(xué)檢查顯示,心肌細胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶及糖原顆粒含量改變,表現(xiàn)為損傷區(qū)的心肌細胞糖原顆粒明顯減少,琥珀酸脫氫酶輕度減少,且損傷區(qū)的心肌細胞內(nèi)糖原顆粒及琥珀酸脫氫酶減少呈島狀、篩狀或片狀分布?；A(chǔ)及臨床研究證實,心肌缺血后細胞膜即受到不同程度的損傷,心肌細胞胞漿內(nèi)心肌標志物首先自細胞內(nèi)逸出,致使血中心肌標志物濃度呈現(xiàn)不同程度地升高。本文阻閉犬冠狀動脈90min后,以個體正常值為診斷標準,血清CK-MBmass、CK-MB活性、CK活性均明顯超過個體正常值上限,其中有50%實驗犬血清CK-MBmass、CK-MB活性超過正常值上限2倍以上,但全部實驗犬血清CK-MBmass、CK-MB活性及CK活性均未超過實驗參考值上限2倍以上。本文結(jié)果提示,CK-MBmass出現(xiàn)異常時間早于CK-MB活性,提示CK-MBmass較CK-MB活性可更早地診斷急性心肌損傷。本文初步提示,急性心肌損傷可引起心肌細胞胞漿內(nèi)CK-MBmass、CK-MB活