樹(shù)突狀細(xì)胞介導(dǎo)的抗寄生蟲(chóng)感染免疫反應(yīng)中的不良反應(yīng)

樹(shù)突狀細(xì)胞介導(dǎo)的抗寄生蟲(chóng)感染免疫反應(yīng)中的不良反應(yīng)

***樹(shù)突狀細(xì)胞（cd）是具有最強(qiáng)機(jī)械功能的獨(dú)特抗炎細(xì)胞（apc），可以顯著激活初始t細(xì)胞，并成為身體免疫反應(yīng)的先驅(qū)。大量研究表明,DC在抗腫瘤、抗感染及移植排斥和自身免疫疾病中發(fā)揮重要作用。寄生蟲(chóng)感染后一方面影響DC的成熟,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抵抗寄生蟲(chóng)的免疫反應(yīng),另一方面影響DC的正常功能,有助于寄生蟲(chóng)完成免疫逃避。前期研究發(fā)現(xiàn),細(xì)粒棘球蚴重組抗原Eg.ferritin具有較好的反應(yīng)原性及免疫原性,能夠刺激DC的發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn),阻斷Notch信號(hào)通路會(huì)影響DC的發(fā)育。Notch信號(hào)通路作為一個(gè)進(jìn)化高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),廣泛表達(dá)于多個(gè)物種,可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的發(fā)育和功能來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能,包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DC等免疫細(xì)胞。但Notch信號(hào)通路在Eg.ferritin影響DC發(fā)育過(guò)程中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究利用γ-分泌酶抑制劑DAPT處理DC,阻斷細(xì)胞的Notch信號(hào)通路,探索Notch信號(hào)通路是否參與DC介導(dǎo)的抗寄生蟲(chóng)感染免疫反應(yīng)。材料和方法1材料表面1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1.2試驗(yàn)用產(chǎn)品和試劑RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;胎牛血清購(gòu)于美國(guó)HyClone公司;rmGM-CSF、rmIL-4購(gòu)于美國(guó)R&D公司;PE-antimouseCD11c、PE-Cyanin5-anti-mouseCD40、PE-Cyanin5-anti-mouseMHCⅡ和FITC-anti-mouseCD80、FITC-anti-mouseCD86購(gòu)于美國(guó)eBioscience公司;DAPT和LPS購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于德國(guó)Roche公司;Eg.ferritin為本實(shí)驗(yàn)室制備。1.3熒光定量pcr和藥物培養(yǎng)方法倒置光學(xué)顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司;流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)Millipore公司;掃描式電子顯微鏡購(gòu)于日本Hitachi公司;熒光定量PCR儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司;恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Thermo公司;細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)于美國(guó)Corning公司。2方法2.1骨髓最佳內(nèi)標(biāo)物的制備取兩只4~6周齡C57BL/6雄鼠,頸椎處死,酒精浸泡5~10min,于超凈臺(tái)內(nèi)取股骨,PBS沖洗2遍;用1640將骨髓沖出,以240g離心10min,棄上清;加紅細(xì)胞裂解液,靜止4min,離心,1640洗2遍,計(jì)數(shù),用10%FBS培養(yǎng)液(含1%雙抗、2mmol/L谷氨酰胺、50μmol/Lβ-巰基乙醇、20ng/mlGM-CSF、10ng/mlIL-4)調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml,接種于24孔板,放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.2dapt、lps聯(lián)合多態(tài)性原則抗原刺激DC培養(yǎng)第7d時(shí),收集細(xì)胞,重懸于不含GM-CSF和IL-4的培養(yǎng)基中。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml,接種于24孔板,提前加入DAPT進(jìn)行處理或不進(jìn)行處理,然后分組加入Eg.ferritin(1μg/ml)、LPS(100ng/ml),刺激20h。DMSO組加入DMSO作為對(duì)照組。2.4.1掃描電子顯微鏡2.5統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示,多組間比較采用方差分析(ANOVA檢驗(yàn)),P<0.05有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1dapt處理細(xì)胞的計(jì)數(shù)結(jié)果小鼠骨髓細(xì)胞在含有GM-CSF和IL-4的RP-MI1640完全培養(yǎng)液中培養(yǎng),誘導(dǎo)產(chǎn)生大量未成熟DCs。在誘導(dǎo)過(guò)程中,加入不同濃度的DAPT處理細(xì)胞,用倒置顯微鏡觀察,結(jié)果見(jiàn)圖1。與DMSO組相比,10μmol/LDAPT處理組出現(xiàn)少量的細(xì)胞集落,細(xì)胞數(shù)量減少;50μmol/LDAPT處理組細(xì)胞散在分布,細(xì)胞數(shù)量減少;100μmol/LDAPT處理組未見(jiàn)克隆團(tuán),細(xì)胞數(shù)量減少并出現(xiàn)大量不明結(jié)晶狀物質(zhì),可能是DAPT濃度過(guò)飽和而形成。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1,細(xì)胞數(shù)量隨DAPT濃度的增高而減少。2dapt對(duì)dc細(xì)胞培養(yǎng)中etp的表達(dá)應(yīng)用Q-PCR技術(shù)檢測(cè)經(jīng)不同濃度DAPT在不同時(shí)間段處理的DC細(xì)胞Notch1mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示,DAPT處理后能夠降低DC細(xì)胞Notch1mR-NA的表達(dá)水平,以在第0d時(shí)用DAPT處理的DC細(xì)胞,Notch1mRNA表達(dá)水平降低最顯著,且以50μmol/LDAPT處理組水平最低。在第7d用DAPT處理的DC細(xì)胞Notch1mRNA的表達(dá)水平降低不明顯(圖2)。3樹(shù)突細(xì)胞dc加入抗原刺激20h后,在掃描電鏡下觀察各組DC的形態(tài),并計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞(圖3A)。細(xì)胞表面較光滑,很少或無(wú)樹(shù)突狀突起的為未成熟DC。細(xì)胞表面粗糙,有大量褶皺,并且出現(xiàn)長(zhǎng)短不一的大量樹(shù)突狀突起為成熟DC(圖3B,3C)。Eg.ferritin組與LPS組中出現(xiàn)樹(shù)突的細(xì)胞數(shù)量多于DMSO組;DAPT處理后,Eg.ferritin組與LPS組樹(shù)突狀DC細(xì)胞占總細(xì)胞量的比例顯著降低,樹(shù)突數(shù)量減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34.12,P<0.05)。4結(jié)果圖1收集經(jīng)Eg.ferritin刺激20h的DC細(xì)胞,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子的表達(dá)水平,以LPS作為陽(yáng)性對(duì)照,結(jié)果見(jiàn)圖4。與1640對(duì)照組相比,Eg.ferritin、LPS組均能上調(diào)CD80(F=19.49)、CD86(F=36.21)、MHCII(F=26.73)、CD40(F=29.71)的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且Eg.ferritin組上調(diào)CD80、CD86、MHCII、CD40表達(dá)的能力高于LPS組。5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子表達(dá)水平為明確Notch信號(hào)通路是否影響重組抗原刺激DC的分化成熟,利用DAPT處理DC,阻斷細(xì)胞的Notch信號(hào)通路,第7d時(shí)加入抗原刺激20h,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子的表達(dá)水平,結(jié)果見(jiàn)圖5。Eg.ferritin+DAPT、LPS+DAPT組與Eg.ferritin、LPS組相比,DAPT處理后DC細(xì)胞表面分子的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。etch信號(hào)通路動(dòng)物攻擊感染實(shí)驗(yàn)證明,Eg.ferritin能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生85.6%的免疫保護(hù)力。用Eg.ferritin免疫新西蘭家兔,制備的抗血清對(duì)原頭蚴也具有明顯的殺傷作用。但是Eg.ferritin是如何誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫保護(hù)力的尚不清楚?？乖M(jìn)入機(jī)體后首先被APC捕獲,并進(jìn)行加工和處理,隨后將抗原信息提呈給T細(xì)胞,有效地激活初始T細(xì)胞,產(chǎn)生免疫應(yīng)答。DC作為體內(nèi)激活初始T細(xì)胞的最重要APC,既能提供初始T細(xì)胞活化的抗原刺激信號(hào),也能提供共刺激信號(hào),啟動(dòng)機(jī)體特異性和非特異性免疫應(yīng)答,處于啟動(dòng)、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。因此,當(dāng)機(jī)體受到寄生蟲(chóng)感染時(shí),DC在機(jī)體抵抗感染及啟動(dòng)免疫應(yīng)答過(guò)程中起重要作用。Notch信號(hào)通路由Notch受體蛋白、Notch配體蛋白和CSL(DNA結(jié)合蛋白)三部分組成。Notch受體在各種細(xì)胞表面都有分布,能通過(guò)與配體的相互作用轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號(hào),從而在細(xì)胞增殖、分化、凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。當(dāng)受體與配體結(jié)合后,Notch受體通過(guò)釋放其胞內(nèi)區(qū)(Notchintracellulardomain,NICD)進(jìn)入細(xì)胞核,激活CSL介導(dǎo)的Notch信號(hào)通路。Notch1是該信號(hào)通路的重要受體,其表達(dá)與否可間接反映Notch信號(hào)的強(qiáng)弱及是否激活。研究發(fā)現(xiàn),Notch與腫瘤細(xì)胞的異常調(diào)控相關(guān),能夠調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖和凋亡。Feng等報(bào)道上調(diào)或下調(diào)Notch信號(hào)能夠影響DC的抗腫瘤免疫反應(yīng)。那么Notch信號(hào)通路在DC抗寄生蟲(chóng)感染過(guò)程中發(fā)揮怎樣的作用呢?γ-分泌酶是Notch活化形成NICD過(guò)程中的關(guān)鍵剪切酶,γ-分泌酶抑制劑DAPT能夠特異性抑制γ-分泌酶的活性,阻斷Notch胞內(nèi)段NICD的釋放。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度DAPT在不同時(shí)間段處理DC,結(jié)果顯示加入DAPT后細(xì)胞存活能力降低,細(xì)胞數(shù)目減少,且與DAPT濃度呈負(fù)相關(guān)。另外,在細(xì)胞培養(yǎng)開(kāi)始就用DAPT處理,各個(gè)濃度的DAPT均能有效降低Notch1的表達(dá),以50μmol/LDAPT組降低最顯著,而在第7d時(shí)用DAPT處理的DC細(xì)胞Notch1mR-NA表達(dá)水平降低不明顯。說(shuō)明50μmol/LDAPT能夠有效阻斷DC的Notch信號(hào)通路。為了進(jìn)一步探索Notch信號(hào)如何參與DC介導(dǎo)的抗寄生蟲(chóng)感染免疫反應(yīng),本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Eg.ferritin與Notch信號(hào)缺失的DC進(jìn)行共同培養(yǎng),觀察DC的形態(tài)變化并檢測(cè)DC表面分子的表達(dá)水平。DC先是通過(guò)吞噬作用或受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用攝取抗原,隨后MHCⅡ類(lèi)分子通過(guò)抗原肽與T細(xì)胞表面的TCR相結(jié)合,提供活化T細(xì)胞的第一信號(hào);CD80/CD86是DC活化T細(xì)胞的共刺激信號(hào),與T細(xì)胞表面的CD28結(jié)合,做為T(mén)細(xì)胞活化的第二信號(hào);粘附分子CD40與T細(xì)胞表面的CD40L結(jié)合,也是活化T細(xì)胞的重要信號(hào)。結(jié)果顯示,Eg.ferritin能夠促進(jìn)DC發(fā)育成熟,主要表現(xiàn)為刺激細(xì)胞表面樹(shù)突的生成,上調(diào)DC表面分子的表達(dá)。Eg.ferritin刺激后的DC高表達(dá)MHCII類(lèi)分子、CD80、CD86及CD40,說(shuō)明Eg.ferritin能夠通過(guò)促進(jìn)DC的成熟,繼而大量活化T細(xì)胞,誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用DAPT阻斷DC的Notch信號(hào)通路后,加入Eg.ferritin作用于DC,與DAPT未處理組相比,Notch信號(hào)缺失的DC表達(dá)低水平的表面分子,呈現(xiàn)不成熟的細(xì)胞形態(tài),說(shuō)明Notch信號(hào)通路的阻斷能有效抑制Eg.ferritin促進(jìn)DC向成熟形態(tài)分化的能力,未成熟DC的增多則可能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受。Notch信號(hào)通路不僅能夠影響DC的發(fā)育成熟,而且涉及Eg.ferritin誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)力的過(guò)程。上調(diào)Notch信號(hào),是否能相應(yīng)地增強(qiáng)DC對(duì)重組抗原產(chǎn)生的免疫應(yīng)答,是否能更有效地抵抗寄生蟲(chóng)的感染還有待進(jìn)一步研究。6~8周齡C57BL/6雄鼠,由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將制備的DC分為兩組,一組在DC培養(yǎng)第0d時(shí)每孔依次加入DAPT(終濃度分別為10、50、100μmol/L)及DMSO,分別于第3d和第5d半量換液時(shí),補(bǔ)足DAPT及DMSO,培養(yǎng)至第7d時(shí),收集細(xì)胞;另一組在第3d和第5d進(jìn)行半量換液,培養(yǎng)第7d時(shí)收集細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml,接種于24孔板,每孔依次加入DAPT(終濃度分別為10、50、100μmol/L)及DMSO,處理2h。2.3-actin—Q-PCR檢測(cè)DAPT處理DC細(xì)胞中Notch1mRNA的表達(dá)水平采用Trizol法提取DC細(xì)胞的RNA,然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。Notch1上游引物:5′-CAGCTTGCACAACCAGACAGAC-3′;下游引物:5′-ACGGAGTACGGCCCATGTT-3′。以β-actin為內(nèi)參。β-actin上游引物:5′-CCAGTTGGTAA-CAATGCCATGT-3′;下游引物:5′-TATTTC-CCCAACACGCTCGG-3′。上機(jī)進(jìn)行Q-PCR反應(yīng)。2.4dc構(gòu)建片在24孔板中事先放入玻璃爬片,使DAPT處理后的DC可以附著在玻片上生長(zhǎng),制成DC爬片。加入重組抗原刺激20h后,將爬片取出并于3%新鮮戊二醛中4℃固定過(guò)夜,