羊泰勒蟲(chóng)裂殖子蛋白的sdspag和easenbcarloing試驗(yàn)研究

羊泰勒蟲(chóng)裂殖子蛋白的sdspag和easenbcarloing試驗(yàn)研究

綿羊疾病是由羊茅昆蟲(chóng)引起的綿羊和山羊的寄生蟲(chóng)引起的。此病最早于1914年由Jittlwood發(fā)現(xiàn)于埃及的綿羊;Dschunkovsky等1924年報(bào)道南斯拉夫Serbia的山羊流行此病。我國(guó)最早是在1958年由楊輔國(guó)等在四川確診此病,隨后在青海、甘肅、遼寧、內(nèi)蒙古、陜西和寧夏等地也確診有此病流行。本病主要呈地方性流行,可引起綿羊和山羊大批發(fā)病死亡。發(fā)病率可高達(dá)36.0%～100%,病死率可高達(dá)17.8%～75.4%。羅建勛等對(duì)4株不同地區(qū)羊泰勒蟲(chóng)的致病性進(jìn)行了比較研究,發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)羊泰勒蟲(chóng)蟲(chóng)株的致病性存在差異,而不同地區(qū)羊泰勒蟲(chóng)的形態(tài)極其相似,很難用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法來(lái)區(qū)別。目前尚未見(jiàn)關(guān)于羊泰勒蟲(chóng)蛋白分析的報(bào)道,也未見(jiàn)有關(guān)羊泰勒蟲(chóng)蟲(chóng)體蛋白多肽及抗原特性方面的研究。我國(guó)不同地區(qū)羊泰勒蟲(chóng)蟲(chóng)株的致病力存在差異,是否在蛋白多肽及抗原特性方面也存在差異尚不十分清楚。鑒于以上情況,筆者用SDS和Westernblotting方法對(duì)羊泰勒蟲(chóng)的4個(gè)不同地區(qū)蟲(chóng)株——臨潭株(甘肅省)、張家川株(甘肅省)、夏河株(甘肅省)和隆德株(寧夏回族自治區(qū))的蛋白多肽及抗原特性進(jìn)行了初步分析。1材料和方法1.1臨床檢查及準(zhǔn)備試驗(yàn)動(dòng)物系選購(gòu)自甘肅省景泰縣無(wú)泰勒蟲(chóng)病地區(qū)的4只4～6月齡綿羊,按試驗(yàn)要求對(duì)試驗(yàn)羊進(jìn)行臨床檢查,體溫、呼吸、精神、食欲及行動(dòng)均正常;血涂片染色鏡檢,無(wú)任何種血孢子蟲(chóng)寄生。分別從甘肅省臨潭縣、張家川縣、夏河縣和寧夏回族自治區(qū)隆德縣的羊體上或草尖上采集沒(méi)有吸過(guò)血的青海血蜱饑餓成蜱。1.2表面活性劑和膜丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺為Fluka公司產(chǎn)品;四甲基乙二胺鹽(TEMED)、魚(yú)明膠、Tween-20為Sigma公司產(chǎn)品;聚偏二氯乙烯膜(PVDF膜)為Millipore公司產(chǎn)品;SDS蛋白Marker為Promega公司產(chǎn)品;Western-blotting蛋白Marker為Bio-Rad公司產(chǎn)品。1.3試驗(yàn)羊的分離剪去4只試驗(yàn)羊背部被毛,粘上布袋,分別用以上從4個(gè)縣采集的青海血蜱饑餓成蜱感染,每只羊用青海血蜱200只,讓其自由叮咬。被感染的4株羊泰勒蟲(chóng)分別命名為臨潭株、張家川株、夏河株和隆德株。從感染之日起,每日早晨測(cè)量試驗(yàn)羊的體溫,從體溫開(kāi)始上升之日起,每日取耳緣靜脈血涂制血片,甲醇固定2次,姬姆薩染色后,用顯微鏡檢查紅細(xì)胞的染蟲(chóng)率。當(dāng)紅細(xì)胞的染蟲(chóng)率達(dá)到30%時(shí),對(duì)試驗(yàn)羊頸動(dòng)脈放血,用200g/L枸櫞酸鈉抗凝。蟲(chóng)體分離按文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行。純化后的蟲(chóng)體保存于-20℃冰箱備用。1.4血螟感染從從2次感染的方法分離所有血清分別用從臨潭縣和隆德縣采集的各60只青海血蜱饑餓成蜱感染無(wú)泰勒蟲(chóng)病的健康羊,在被蜱叮咬后的1個(gè)月,再用200只同樣的青海血蜱饑餓成蜱進(jìn)行2次感染。于第2次被蜱叮咬后的10～30d,每隔10d采血20mL,分離血清,置-20℃冰箱備用。另從張家川縣和夏河縣發(fā)病羊采集分離自然感染羊血清。對(duì)以上陽(yáng)性血清用ELISA檢測(cè),選效價(jià)高的陽(yáng)性血清供試驗(yàn)用。1.5考馬斯亮藍(lán)g-200凝膠的制備按文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行。首先將4株羊泰勒蟲(chóng)裂殖子蛋白在80V恒壓下電泳,待樣品進(jìn)入分離膠以后,以120V恒壓繼續(xù)電泳,直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至距分離膠底部0.5cm處時(shí)停止電泳,取下凝膠用考馬斯亮藍(lán)G-250染色。另對(duì)SDS電泳結(jié)束后的凝膠不進(jìn)行固定和染色,直接用半干轉(zhuǎn)移儀轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,進(jìn)行Western-blotting試驗(yàn)。2結(jié)果2.14裂殖子蛋白分子質(zhì)量特征4株羊泰勒蟲(chóng)裂殖子蛋白經(jīng)SDS電泳、考馬斯亮藍(lán)G-250染色后用Syngene公司的凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。結(jié)果,羊泰勒蟲(chóng)臨潭株出現(xiàn)16條帶,張家川株出現(xiàn)14條帶,隆德株和夏河株各出現(xiàn)12條帶(見(jiàn)圖1)。4個(gè)蟲(chóng)株裂殖子蛋白分子質(zhì)量相同的帶有6條,其分子質(zhì)量分別是102、58、41、33、27和14ku。其中臨潭株的主要條帶有102、71、41、38、33、29和14ku;隆德株的主要條帶有102、71、41、31、29和14ku;張家川株的主要條帶有102、38、33、22、17、16和14ku;夏河株的主要條帶有102、38、37、27、17、16和14ku。2.2反應(yīng)帶及特點(diǎn)將蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和羊泰勒蟲(chóng)裂殖子蛋白樣品在同一條件、同一凝膠板上電泳后取出凝膠,將標(biāo)準(zhǔn)蛋白帶切下,直接進(jìn)行染色,將羊泰勒蟲(chóng)裂殖子蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,分別與4株羊泰勒蟲(chóng)陽(yáng)性血清進(jìn)行反應(yīng)。將羊泰勒蟲(chóng)臨潭株陽(yáng)性血清1∶100稀釋后與羊泰勒蟲(chóng)臨潭株、隆德株、張家川株和夏河株裂殖子蛋白進(jìn)行反應(yīng)時(shí),臨潭株、張家川株和夏河株各出現(xiàn)3條反應(yīng)帶,隆德株僅有2條反應(yīng)帶(見(jiàn)圖2),其特點(diǎn)如下:臨潭株、隆德株和張家川株在38ku處均有反應(yīng)帶,臨潭株和張家川株在33ku處也均有反應(yīng)帶,臨潭株和隆德株在19ku處有較弱的反應(yīng)帶,夏河株在41、35和20ku處有反應(yīng)帶。將羊泰勒蟲(chóng)張家川株陽(yáng)性血清1∶100稀釋后與4株羊泰勒蟲(chóng)裂殖子蛋白反應(yīng)時(shí),4個(gè)蟲(chóng)株均出現(xiàn)3條反應(yīng)帶(見(jiàn)圖3)。其特點(diǎn)如下:臨潭株和隆德株在71ku處均有較弱的反應(yīng)帶,臨潭株和張家川株在38ku處均有反應(yīng)帶,其中張家川株在此處的反應(yīng)最強(qiáng)烈,隆德株在35和27ku處有較弱的反應(yīng)帶,張家川株在22和17ku處有反應(yīng)帶,夏河株在90、41和31ku處有反應(yīng)帶。將羊泰勒蟲(chóng)夏河株陽(yáng)性血清1∶100稀釋后與4株羊泰勒蟲(chóng)裂殖子蛋白反應(yīng)時(shí),夏河株出現(xiàn)4條反應(yīng)帶,張家川株出現(xiàn)3條反應(yīng)帶,臨潭株有2條反應(yīng)帶,隆德株只有1條反應(yīng)帶(見(jiàn)圖4)。其特點(diǎn)如下:4個(gè)蟲(chóng)株在38ku處均有反應(yīng)帶出現(xiàn),張家川株在22和14ku處有反應(yīng)帶,夏河株在43、27和14ku處均有反應(yīng)帶。將羊泰勒蟲(chóng)隆德株陽(yáng)性血清1∶100稀釋后與4株羊泰勒蟲(chóng)裂殖子蛋白反應(yīng)時(shí),臨潭株出現(xiàn)3條反應(yīng)帶,隆德株和夏河株各有2條反應(yīng)帶,張家川株只有1條反應(yīng)帶(見(jiàn)圖5)。其特點(diǎn)如下:隆德株和臨潭株在33和24ku處均有較明顯的反應(yīng)帶,臨潭株和張家川株在38ku處有反應(yīng)帶,夏河株在58和27ku處有反應(yīng)帶。3單次給藥對(duì)羊光等5個(gè)蟲(chóng)株的分子質(zhì)量和致病力的影響羊泰勒蟲(chóng)中國(guó)分離株是新發(fā)現(xiàn)的泰勒屬的一個(gè)種。本試驗(yàn)用SDS試驗(yàn)對(duì)4個(gè)不同地區(qū)羊泰勒蟲(chóng)裂殖子蛋白的分析結(jié)果表明,4個(gè)蟲(chóng)株蛋白多肽在數(shù)量、含量和分子質(zhì)量等方面有一定的差異。比較各蟲(chóng)株裂殖子的蛋白電泳譜,臨潭株有7條主要條帶,隆德株有6條,二者有5條帶的分子質(zhì)量相同;張家川株和夏河株各有7條主要條帶,二者有5條帶的分子質(zhì)量相同,其他蟲(chóng)株之間有較大的差異。由此可見(jiàn),羊泰勒蟲(chóng)臨潭株與隆德株的親緣關(guān)系比較近,夏河株和張家川株的親緣關(guān)系比較近。Figueroa對(duì)幾個(gè)不同地理分布的雙芽巴貝蟲(chóng)株研究發(fā)現(xiàn),同種異株間有一定的差異。周金林等用SDS試驗(yàn)對(duì)8個(gè)不同地區(qū)的錐蟲(chóng)分析時(shí),也發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)錐蟲(chóng)株多肽的分子質(zhì)量存在差異。羅建勛等在以前的研究中發(fā)現(xiàn)4個(gè)不同地區(qū)羊泰勒蟲(chóng)分離株的致病性有差異,其中隆德株的致病力最強(qiáng),張家川株的致病力最弱,但是不能用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法來(lái)區(qū)別這4個(gè)蟲(chóng)株。本試驗(yàn)利用SDS方法,可直觀地反映4個(gè)蟲(chóng)株之間的異同。至于羊泰勒蟲(chóng)蛋白多肽與致病性之間的關(guān)系,還需對(duì)各蛋白多肽的分子特性進(jìn)行深入研究。據(jù)資料報(bào)道,瑟氏泰勒蟲(chóng)在33～34ku處的蛋白多肽是其主要免疫原蛋白,水牛泰勒蟲(chóng)和東方泰勒蟲(chóng)的主要免疫原蛋白的分子質(zhì)量略比瑟氏泰勒蟲(chóng)的高。而類(lèi)似分子質(zhì)量的蛋白也是其他泰勒蟲(chóng)的主要蛋白,如環(huán)形泰勒蟲(chóng)在30ku、突變泰勒蟲(chóng)在32ku處的蛋白。Schnittger等研究發(fā)現(xiàn),羊泰勒蟲(chóng)(中國(guó)分離株和T.lestoquardi)35ku的蛋白多肽可在羊體內(nèi)引起免疫反應(yīng),產(chǎn)生抗體。本研究中Western-blotting試驗(yàn)結(jié)果表明,羊泰勒蟲(chóng)臨潭株、隆德株、張家川株和夏河株的陽(yáng)性血清均與臨潭株和張家川株裂殖子蛋白在38ku處有明顯的反應(yīng),這說(shuō)明38