人參皂苷rb1對抑郁大鼠海馬5-h及5-h1a受體的影響

人參皂苷rb1對抑郁大鼠海馬5-h及5-h1a受體的影響

抑郁的主要癥狀是抑郁、抑郁、精神疾病和運(yùn)動(dòng)延遲。這是一種慢性和復(fù)發(fā)的精神疾病，在嚴(yán)重的情況下可伴有自殺。隨著人類壓力的增加，患有抑郁的人數(shù)逐年增加。目前的研究熱點(diǎn)之一是對其病機(jī)的研究。然而，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。中醫(yī)認(rèn)為,抑郁癥是由于情志不舒,肝氣郁結(jié),漸致五臟不和,化火、生痰、瘀阻、耗氣、傷陰等而致,屬“郁證”范疇,因此中醫(yī)臨床上多采用疏肝理氣法對其進(jìn)行治療。人參主要成分人參皂苷,具有良好的抗抑郁作用。研究表明,人參皂苷活性成分Rb1具有明顯的抗抑郁作用。本研究建立抑郁癥模型,觀察海馬5-HT及5-HT1A受體的變化,探討人參皂苷抗抑郁癥作用的理論機(jī)制。1材料和試劑1.1動(dòng)物合格號清潔級健康成年雄性Wistar大鼠45只,體質(zhì)量180~210g,河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號:SCXK京2009-0004。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。1.2多克隆5-ht1a抗體和westernbro相關(guān)試劑人參皂苷Rb1購自中國藥品生物制品檢定所。兔多克隆5-HT1A抗體購自SantzCruz公司,Westernblo相關(guān)試劑購自武漢博士德生物工程有限公司。其它試劑為國產(chǎn)分析純。2方法2.1墊料、游泳、放養(yǎng)隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對照組、模型組和治療組,每組15只。模型組和治療組給予慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(CUMS),應(yīng)激共包括11種:鼠籠45℃傾斜24h,潮濕墊料24h,行為限制24h,4℃冰水游泳5min,42℃熱水游泳5min,禁食24h,禁水24h,夾尾1min,鼠籠搖動(dòng)15min,持續(xù)光照36h,天敵聲音30min。將上述11種應(yīng)激隨即分配到21天內(nèi),每日給予1種應(yīng)激,每種應(yīng)激平均出現(xiàn)2次,同種應(yīng)激不連續(xù)出現(xiàn)。對照組除每天抓取1次外,不作其他處理。造模同時(shí),給予治療組人參皂苷Rb1(40mg/kg),每日灌胃1次(每毫升藥液含原生藥1g,劑量1ml/100g體質(zhì)量)。2.2行為測試2.2.1控制血糖偏好配比用糖水和自來水雙瓶給實(shí)驗(yàn)大鼠供飲,通過測量剝奪飲水2.5h后大鼠1h內(nèi)的糖水和自來水消耗量,計(jì)算糖水偏好百分比(糖水消耗量/總液體消耗×100%)。2.2.2活動(dòng)情況分析將大鼠置于高架十字迷宮中央?yún)^(qū),頭朝開臂。通過動(dòng)物行為視頻分析系統(tǒng)記錄分析5min內(nèi)大鼠的活動(dòng)情況。每只大鼠測試完畢后徹底清理迷宮。檢測指標(biāo):開臂進(jìn)入次數(shù)百分比和開臂滯留時(shí)間百分比。2.2.3學(xué)習(xí)記憶能力對各組大鼠分別進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn),檢測其學(xué)習(xí)記憶能力。從同一入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中,記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間,利用Morris水迷宮軟件分析結(jié)果。2.3流動(dòng)相及緩沖劑用量每組取5只大鼠,1%戊巴比妥鈉(35mg/kg)腹腔注射麻醉,斷頭取腦,冰上分離海馬組織。加入高氯酸提取液冰浴勻漿后離心,留取上清。取上清20μl進(jìn)行分析。流動(dòng)相:緩沖液(50mMKH2PO4)/甲醇(95∶5),緩沖液:3mM庚烷磺酸鈉、10mM醋酸鈉、85mM檸檬酸、0.2mMEDTA,pH3.7、柱溫40℃、波長掃描范圍210~370nm、檢測波長275nm、流速1.0ml/min。以標(biāo)準(zhǔn)品峰保留時(shí)間與樣品峰保留時(shí)間對照定性,標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值進(jìn)行定量分析。2.4sds-東南角電泳三組各取5只大鼠,麻醉后斷頭取腦,冰上快速分離海馬,加入RIPA裂解液,提取組織總蛋白,定量后按照30μg蛋白量上樣,進(jìn)行10%SDS電泳,PVDF膜電轉(zhuǎn)印,脫脂奶粉封閉,5-HT1A一抗(1∶500)4℃孵育過夜,二抗IgG(1∶5000)室溫孵育1h,ECL顯色。同上進(jìn)行內(nèi)參照β-actin的Westenblot分析。以目的條帶與內(nèi)參照的光密度比值表示蛋白表達(dá)。2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理測量結(jié)果以ue0af±s表示,應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,兩兩比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1行為實(shí)驗(yàn)的結(jié)果3.1.1c.9.9%是速度性侵權(quán)行為,少對每相線上所做的是表達(dá)義務(wù),造成了4.37%是生長方向?qū)φ战M、模型組和治療組大鼠糖水偏好百分比分別為(92.49±8.19)%、(57.62±4.91)%和(75.49±5.36)%。模型組和治療組明顯小于對照組(P<0.05)。見表1。3.1.2開臂停留時(shí)間配比對照組、模型組和治療組大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比分別為(37.80±2.91)%、(21.30±2.18)%和(28.84±3.23)%,開臂停留時(shí)間百分比分別為(28.71±2.29)%、(17.94±2.11)%和(20.38±2.82)%,模型組和治療組高于對照組,治療組低于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。3.1.3目標(biāo)函數(shù)對照組、模型組和治療組大鼠平均逃避潛伏期分別為(5.63±1.06)、(20.76±3.24)和(12.50±2.10)s。模型組和治療組高于對照組,治療組低于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3.210.0.0.2830.對照組、模型組和治療組海馬5-HT含量分別為(1.93±0.21)、(0.34±0.08)和(1.08±0.15)ng/g。模型組明顯低于對照組,治療組明顯升高,但仍低于對照組(P<0.05)。見表2。3.3兩組不同時(shí)點(diǎn)模型比較對照組、模型組和治療組海馬5-HTIA受體表達(dá)水平分別為(0.74±0.08)、(0.16±0.02)和(0.38±0.05)。模型組明顯低于對照組,治療組明顯升高,但仍低于對照組(P<0.05)。見圖1和表2。4抗抑郁作用機(jī)理及作用抑郁癥是一種常見的情感、精神障礙性疾病,以顯著而持久的心境低落為主要特征。臨床表現(xiàn)除疲勞、失眠等軀體癥狀外,還包括情緒低落、興趣喪失、記憶力減退等精神癥狀。其發(fā)病機(jī)制尚未闡明。對抑郁癥的研究得益于正確動(dòng)物模型的建立。給予大鼠慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(CUMS),能使大鼠較好地表現(xiàn)出抑郁的臨床癥狀,包括情緒低落、興趣喪失、記憶力減退等,是較理想的抑郁動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)利用CUMS應(yīng)激研究人參皂苷Rb1抗抑郁作用機(jī)理。抑郁癥發(fā)病與神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)有關(guān)。下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸為神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)中樞,抑郁癥發(fā)與HPA軸失調(diào)有關(guān)。當(dāng)機(jī)體受到應(yīng)激時(shí),HPA軸可以調(diào)控釋放促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)。研究表明,神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(5-HT)可以興奮性調(diào)節(jié)CRH的釋放,5-HT及其受體在HPA軸反饋調(diào)節(jié)中起重要作用。其中5-羥色胺1A受體在情緒和精神調(diào)節(jié)中具有重要作用。抑郁癥屬中醫(yī)“郁證”范疇,病始在肝,及于心神。因情而郁,氣血失調(diào)是其