兩種土壤處理劑對生姜莖腐病菌的體外抑菌試驗

兩種土壤處理劑對生姜莖腐病菌的體外抑菌試驗

目前，植物土壤傳播病害的主要包括真菌性疾病、細菌疾病和由線蟲感染的疾病。生姜莖腐病、姜瘟病和生姜癩皮病(病原為南方根結(jié)線蟲)是生姜生產(chǎn)上重要的土傳病害,近年來在山東省生姜主產(chǎn)區(qū)呈逐年蔓延擴大的趨勢,嚴重影響了生姜的產(chǎn)量和品質(zhì)。土壤處理是防治土傳病害的重要途徑,化學熏蒸是土壤處理的重要措施之一,也是目前主要的防治方法。由于常用熏蒸劑溴甲烷對臭氧層的消耗極為嚴重,目前其主要替代品氯化苦、棉隆、1,3-二氯丙烯等在田間均對土傳病害表現(xiàn)出了一定的防治效果。其中氯化苦和棉隆在山東省生姜主產(chǎn)區(qū)均有應(yīng)用,但兩者對3種病害的控制能力是否存在差異尚未見報道。目前國內(nèi)關(guān)于熏蒸劑毒力測定方法的報道多針對儲糧及衛(wèi)生害蟲,用于病菌測定易導(dǎo)致雜菌污染。Fernando等曾利用密封盤(sealedplates)法測定過苯并噻唑、環(huán)己醇等揮發(fā)性化合物對真菌的抑制活性?？紤]到藥劑對真菌、細菌和線蟲的活性存在較大差異,本研究對Fernando等的方法進行了改進,采用合適的熏蒸容器分別測定了棉隆和氯化苦對莖腐病菌(真菌)、姜瘟病菌(細菌)和南方根結(jié)線蟲的毒力,旨在為快速有效地篩選和評價土壤熏蒸劑的活性提供參考。1材料和方法1.1水電空氣/空氣溫度分布99.5%的氯化苦(chloropicrin)液劑(遼寧大連綠峰化學股份有限公司)、98%的棉隆(dazomet)微粒劑(MG,江蘇省南通施壯化工有限公司)。GA110萬分之一電子天平(德國);LDZX-40BI自動電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);SW-CJ-LD超凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);WD700微波爐(順德格蘭仕電器廠);THZ-82空氣浴搖床(江蘇太倉公司);UV-2201紫外分光光度計(日本島津公司);GXZ型智能光照培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)。1.2培養(yǎng)了姜疫病原菌生姜莖腐病菌PythiummyriotylumDrechsler由山東省萊蕪市農(nóng)業(yè)科學院提供,于18℃生化培養(yǎng)箱中PDA斜面上保存;姜瘟病菌Ralstoniasolanacearum由山東農(nóng)業(yè)大學植物病理系提供,室溫下于無菌水中保存;南方根結(jié)線蟲Meloidogyneincognita采自山東農(nóng)業(yè)大學蔬菜標本園,參照劉維志報道的根結(jié)線蟲分離方法分離培養(yǎng),每24h收集2齡幼蟲,置于4℃冰箱中備用。1.3培養(yǎng)基a培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基;NA培養(yǎng)基(牛肉浸膏3g,酵母浸膏1g,蛋白胨5g,葡萄糖10g,瓊膠15g,蒸餾水1000mL)。1.4測試方法1.4.1不同覆蓋厚度的玻璃鐘罩對菌落生長的影響采用玻璃鐘罩作為密閉熏蒸容器,測定藥劑對生姜莖腐病菌的毒力。經(jīng)轉(zhuǎn)接活化后的菌株于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng),待菌落長至培養(yǎng)皿3/4大小時,于邊緣打取直徑約8mm的菌絲塊。無菌條件下,向培養(yǎng)皿中倒入2mm高、冷卻至45℃的PDA培養(yǎng)基,待培養(yǎng)基凝固后將菌絲塊菌絲面向下接種于平板中央,將接種后的平板開蓋放置在厚度為0.04mm、面積為50cm×50cm的塑料膜上,設(shè)4次重復(fù)。同時放置1個盛有無菌水的培養(yǎng)皿蓋,在預(yù)備試驗基礎(chǔ)上向其中加入相應(yīng)劑量的處理藥劑(玻璃鐘罩容積用水標定為21.07L。棉隆的熏蒸質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、1.0、2.5、5.0mg/L,氯化苦分別為0.04、0.08、0.12、0.16、0.24mg/L)。迅速蓋上玻璃鐘罩,用皮筋將塑料膜沿玻璃鐘罩外壁密封嚴實,將玻璃鐘罩放入25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3d。以只添加無菌水組為對照,試驗重復(fù)3次。用十字交叉法測量菌落直徑,按式(1)、(2)計算各處理凈生長量和菌絲生長抑制率的平均值。凈生長量/mm=測量菌落直徑-8(1)菌絲生長抑制率/%=對照組凈生長量?處理組凈生長量對照組凈生長量×100(2)菌絲生長抑制率/%=對照組凈生長量-處理組凈生長量對照組凈生長量×100(2)采用DPS軟件分別計算出兩種藥劑的EC50、EC90、95%置信限和相應(yīng)的b值及標準差(SD)。1.4.2土壤熏蒸劑對致病性細菌的毒性影響1.4.2.培養(yǎng)姜坯病原菌菌落將保存的姜瘟病菌菌株取出,在NA固體培養(yǎng)基上活化,挑取單菌落置于NA液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,于25℃、190r/min下振蕩培養(yǎng)24h,制得菌懸液。菌懸液用滅菌水稀釋1×107倍,取0.05mL稀釋后的菌懸液均勻涂抹在PDA固體培養(yǎng)基上,于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1d。記錄姜瘟病菌的菌落數(shù)量,根據(jù)式(3)計算每1mL菌懸液中的細菌數(shù)(N)。N=平板上菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)平板上加菌液的量/mLΝ=平板上菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)平板上加菌液的量/mL(3)1.4.2.測定波長的確定用無菌水將菌懸液分別稀釋9、13、17、33、49、65倍,通過預(yù)試驗確定吸光度在0.1～0.9之間的吸收波長。以不加菌懸液組為對照。在選定的波長下測定不同稀釋倍數(shù)菌懸液的吸光值,試驗重復(fù)3次。依據(jù)平板活菌計數(shù)結(jié)果,以菌懸液濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標繪制標準曲線。1.4.2.添加對藥劑的篩選和各處理的菌懸液的抑制率及生長量的測定參照Fernando等報道的密封盤法進行,采用密封盤作為熏蒸容器。無菌條件下,在直徑15cm的大培養(yǎng)皿蓋中放一張濾紙,加入20mL無菌水保濕。取5mL菌懸液加入直徑7cm的小培養(yǎng)皿中,再加入NA液體培養(yǎng)基5mL。將小培養(yǎng)皿去蓋后放入大培養(yǎng)皿蓋中。在預(yù)試驗基礎(chǔ)上,于濕濾紙上添加各處理藥劑(密封盤容積用水標定為1.88L。棉隆的質(zhì)量濃度分別為1063.8、1595.7、2127.7、2659.6和3191.5mg/L,氯化苦分別為0.09、0.18、0.36、0.54和0.72mg/L),以只添加無菌水組為對照。迅速用另一直徑15cm的大培養(yǎng)皿蓋蓋上,并用封口膜封嚴,于25℃、45r/min搖床上培養(yǎng)1d。將各處理菌懸液用無菌水稀釋13倍,在選定波長下測定不同處理組菌懸液的吸光值,由標準曲線方程獲得不同處理的菌懸液濃度。根據(jù)式(4)、(5)計算各藥劑對姜瘟病菌的抑制率。凈生長量=菌液濃度?N26-Ν26(4)抑制率/%=對照組凈生長量?處理組凈生長量對照組凈生長量×100(5)抑制率/%=對照組凈生長量-處理組凈生長量對照組凈生長量×100(5)式中N為每1mL菌懸液中的細菌數(shù)。采用DPS軟件分別計算出兩種藥劑的EC50、EC90、95%置信限和相應(yīng)的b值及標準差(SD)。1.4.3藥劑處理和安全性評價采用層析缸作為密閉熏蒸容器。將分離活化得到的2齡根結(jié)線蟲配制成2000條/mL的懸浮液,分別添加50μL于三孔凹玻片的3個凹穴內(nèi),設(shè)2次重復(fù)。將處理后的凹玻片置于密封性良好的層析缸內(nèi),同時放置一個盛有無菌水的培養(yǎng)皿蓋,在預(yù)備試驗的基礎(chǔ)上,向培養(yǎng)皿蓋中加入處理藥劑(層析缸容積用水標定為5.15L。棉隆的熏蒸質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L,氯化苦分別為0.89、1.79、2.68、3.58、4.47mg/L),迅速蓋上層析蓋并用封口膜封嚴。以只添加無菌水為對照,試驗重復(fù)2次。將層析缸于室溫下培養(yǎng)48h后取出凹玻片,于空氣中暴露放置3min,4×10倍顯微鏡下鏡檢,記錄根結(jié)線蟲的死亡情況(蟲體僵直且完全停止活動者視為死亡)。根據(jù)式(6)、(7)計算各藥劑處理死亡率和校正死亡率。死亡率/%=死亡線蟲數(shù)調(diào)查總線蟲數(shù)×100/%=死亡線蟲數(shù)調(diào)查總線蟲數(shù)×100(6)校正死亡率/%=處理死亡率?對照死亡率1?對照死亡率×100/%=處理死亡率-對照死亡率1-對照死亡率×100(7)采用DPS軟件分別計算出兩種藥劑的EC50、EC90、95%置信限和相應(yīng)的b值及標準差(SD)。2結(jié)果與分析2.1土壤熏蒸劑對生姜莖腐病的毒性結(jié)果(見表1)表明,氯化苦和棉隆對生姜莖腐病菌均表現(xiàn)出較高的毒力,且氯化苦的毒力高于棉隆。2.2土壤熏蒸劑對姜醇菌的毒性2.2.1菌懸液濃度c平板活菌計數(shù)結(jié)果為每1mL菌懸液中的細菌數(shù)(N)=3.2×1010個。以吸光度(A)為縱坐標,菌懸液濃度(c)為橫坐標進行線性回歸,得標準曲線方程A=0.1345c-0.0713(R2=0.9861,c的單位為109個/mL)。結(jié)果表明,在0.49×109～3.6×109個/mL濃度范圍內(nèi),菌懸液濃度與吸光度值至呈良好的線性關(guān)系。2.2.2中毒試驗的結(jié)果由表2可知,氯化苦對姜瘟病菌的活性較高,而棉隆的活性較低。2.3穩(wěn)定性試驗結(jié)果48h后空白對照組存活率很高,均達90%以上,表明試驗體系穩(wěn)定可靠。兩種藥劑對南方根結(jié)線蟲的毒力存在一定的差異(表3),其中棉隆對南方根結(jié)線蟲的活性較高,氯化苦的毒力低于棉隆。3培養(yǎng)培養(yǎng)基及藥劑熏蒸容器的大小對試驗結(jié)果影響較大,容器太小將導(dǎo)致藥劑計量困難,試驗誤差增大。本研究經(jīng)預(yù)試,選取了合適的容器進行毒性試驗,所改進的生測方法具有良好的重現(xiàn)性,可為快速準確地評價其他土壤熏蒸劑的毒力提供參考。此外,姜瘟病菌數(shù)量的測定若采用平板菌落計數(shù)法較為費時且誤差較大,利用比色法則更為快捷和準確。NA培養(yǎng)基比LB培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富,更適宜姜瘟病菌生長,試驗中可根據(jù)實際情況選擇合適的培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)時間。另外,藥劑揮發(fā)后可能不易透過菌懸液液面起到殺菌效果,因此應(yīng)盡量增大液面面積并使用低速搖床培養(yǎng),使病原菌充分接觸液面空氣。本研究表明,棉隆對姜瘟病菌活性較低,加之其用量大、成本高、處理時間長,故不推薦專門使用棉隆來控制生姜病害。有研究證明,氯化苦在被激活狀態(tài)下可生成一種誘導(dǎo)細菌有機體突變的代謝物,對土壤桿菌屬細菌防治效果較好,此外氯化苦還能有效控制土傳病原真菌,如鐮刀菌屬、疫霉屬、腐霉屬、絲核菌屬等,其防治土壤真菌的效果比溴甲烷高近20倍。本研究中氯化苦各濃度組對姜瘟病菌和生姜莖腐病菌表現(xiàn)出顯著的抑制