營養(yǎng)不良型大皰表皮松解癥新生兒col7a1基因異常分析

營養(yǎng)不良型大皰表皮松解癥新生兒col7a1基因異常分析

不良的共濟失，表皮松弛（deb）是一組以皮膚或粘膜損傷為主的共濟失。如果發(fā)生輕度事故，可能會發(fā)生水泡或大皰疹，愈合后會留下萎縮的痕跡。DEB包括常染色體顯性遺傳和隱性遺傳兩類,均與編碼基底膜下Ⅶ型膠原的COL7A1基因的突變有關(guān)。COL7A1基因定位于人3p21.3區(qū)域,有118個外顯子,是迄今發(fā)現(xiàn)的外顯子最多的基因,長度23kb。目前大多數(shù)實驗室對于DEB的基因診斷采取傳統(tǒng)的Sanger測序法進行COL7A1全基因外顯子區(qū)的序列分析,該方法耗資大,而且費時、費力。近年來第二代測序技術(shù)發(fā)展迅速,因其具有高通量、高性價比的特點,在臨床遺傳病基因診斷的應(yīng)用日益廣泛,但目前該技術(shù)尚未應(yīng)用于DEB的基因診斷。本研究應(yīng)用目標(biāo)區(qū)序列捕獲和二代測序技術(shù),對1例新生兒營養(yǎng)不良型大皰表皮松解癥進行檢測,并應(yīng)用Sanger測序?qū)τ谕蛔兾稽c在患兒及其家系中進行驗證和檢測,為DEB的診斷提供了新的思路。1cola7a1基因回復(fù)突變位點的確定患兒,男,生后5h,因“發(fā)現(xiàn)皮膚缺損5h”入院?；純合礕1P1,因“孕母產(chǎn)前發(fā)熱”行剖宮產(chǎn)娩出。患兒母親在8歲時曾出現(xiàn)皮膚大皰樣皮疹,其母親和姐妹也有類似的皮膚病變?；純焊赣H無相關(guān)疾病史。其父母非近親結(jié)婚。查體:患兒雙側(cè)外耳廓可見燙傷樣改變,耳廓結(jié)構(gòu)完整,基地潮紅,輕度糜爛,輕觸有出血,唇部、臀部、雙肘關(guān)節(jié)、雙手指末端、雙小腿見片狀表皮缺失,糜爛面及松弛型大皰,皰液渾濁,皰壁松弛,尼氏征陰性?？谇粌?nèi)可見少量表皮破損,伴少量黏液樣物質(zhì)流出(圖1)。征得研究對象或其監(jiān)護人知情同意后,提取了患兒及其父母、外祖母外周血,應(yīng)用北京Tiangen公司的TIANampBlood血液基因組DNA提取試劑盒(目錄號:DP318)提取全血基因組DNA。采用第二代高通量測序方法,取3μgDNA經(jīng)美國Covaris公司CovarisS2超聲儀將其隨機打斷,純化后的DNA使用末端修復(fù)反應(yīng)緩沖液和末端修復(fù)酶混合物進行末端補平,進而在其3′端加入A形成特有的懸垂結(jié)構(gòu),通過接頭連接形成標(biāo)準(zhǔn)的Solexa測序文庫,取1μl制備好的文庫樣本,用Nanodrop2000對文庫樣本進行定量。文庫經(jīng)PCR擴增后,取3μgDNA,應(yīng)用北京邁基諾基因科技研發(fā)的新生兒遺傳疾病基因檢測試劑盒進行雜交,洗脫的雜交文庫質(zhì)控合格后經(jīng)IlluminaHiSeq2000上機測序。按照本實驗室常規(guī)的Sanger法對c.6781C>T點突變患兒樣本進行測序驗證。并對其父母、外祖母的樣本進行該位點的序列分析。擴增引物如下,COL7A1-F:5′-GACATCCGACTTGTTCTCCG;COL7A1-R:5′-GGCCAGGTTCTCCTTTAGGT。高通量測序數(shù)據(jù)應(yīng)用SOAPaligner和SOAPsnp軟件,過濾低質(zhì)量值(質(zhì)量值≤20)和低覆蓋度(深度≤10)的SNP,找出序列中的SNP;用GATK軟件找出序列中所含有的插入/缺失(InDel)的信息;利用CCDS、人類基因組數(shù)據(jù)庫、dbSNP信息對SNP和InDel進行注釋,確定突變位點。第二代高通量測序結(jié)果顯示患兒在chr-48610345的位置COL7A1基因(NM_000094)第86個外顯子上發(fā)現(xiàn)1個雜合突變點:c.6781C>T,引起該基因第2261位氨基酸由精氨酸變?yōu)榻K止密碼子(p.R2261X)(圖2)。針對c.6781C>T點突變Sanger測序結(jié)果與二代高通量測序結(jié)果一致(圖3)。為了確定患兒COL7A1基因c.6781C>T突變位點的遺傳來源,對患兒的父親、母親、外祖母的該位點進行序列分析。結(jié)果顯示患兒父親正常,其母親和外祖母與患兒相同,在COL7A1基因外顯子86上第6781堿基發(fā)生雜和突變。見圖4。2deb基因檢測本例患兒出生時在口腔內(nèi)、雙側(cè)外耳廓、雙下肢及右肘部就出現(xiàn)皮膚缺損、糜爛,提示患兒在宮內(nèi)就已經(jīng)發(fā)生皮膚病變,而且水皰分布在皮膚易摩擦和受壓處的耳廓和四肢,具有典型大皰表皮松解癥的臨床表現(xiàn)。應(yīng)用二代高通量測序結(jié)果顯示,患兒存在COL7A1基因外顯子86上第6781位堿基C→T的雜和突變,引起第2261位氨基酸由精氨酸變?yōu)榻K止密碼子(p.R2261X),導(dǎo)致提前終止密碼子(prematureterminationcodon,PTC)的產(chǎn)生。該突變已有報道,該報道為1例新生兒起病的Hallopeay-Siemens型常染色體隱性大皰表皮松解癥,是常染色體隱性遺傳大皰表皮松解癥中最嚴(yán)重的一個亞型,患兒軀干及四肢皮膚缺損、糜爛,口腔黏膜、眼結(jié)膜和鼻子突出部分均有破損,手腳指甲生后3個月全部潰爛脫落,基因檢測結(jié)果顯示該患兒為攜帶434insGCAT和R2261X兩種復(fù)合雜合突變,兩種突變分別來源于父親和母親,患兒攜帶的兩種突變,434insGCAT導(dǎo)致移碼突變,從而使外顯子5產(chǎn)生PCT,而R2261X導(dǎo)致外顯子86產(chǎn)生PCT,使Ⅶ型膠原肽鏈合成提前終止,最終致蛋白質(zhì)縮短,不能產(chǎn)生正常的Ⅶ型膠原,因而臨床癥狀較本文報道的患兒嚴(yán)重。本例患兒僅為1條染色體發(fā)生突變,所以臨床癥狀輕。為了明確家系中其他成員是否存在相同突變,通過一代測序表明家系中患兒的母親、外祖母均存在R2261X的突變,而患者父親和100例正常對照均不存在此突變,排除該突變是基因多態(tài)性的可能,并結(jié)合已有的文獻報道,提示此突變是導(dǎo)致該家系病變的特異性突變,患兒的突變基因來源于母親的家系,但由于表型異質(zhì)性,患兒與其母親、外祖母的臨床表現(xiàn)差異較大。已有文獻報道,DEB的基因型和表型之間具有密切關(guān)聯(lián),但表型異質(zhì)性較為多見,產(chǎn)生的原因可能為Ⅶ型膠原分子上不同功能位點發(fā)生突變,引起“蛋白自殺”,或者是由于等位基因上不同突變組成的復(fù)合突變所產(chǎn)生的不同結(jié)果,還有可能是由于某些突變需要COL7A1基因2個等位基因的純合子共同表達。由此可見利用基因檢測明確DEB分型非常重要,但目前大多數(shù)實驗室對于DEB的基因診斷采取傳統(tǒng)的Sanger測序法進行COL7A1全基因外顯子區(qū)的序列分析。國內(nèi)報道一個DEB家系的基因突變檢測,設(shè)計了72對引物對COL7A1基因全部118個外顯子進行序列分析,檢測費用較高,這些費用包括72個PCR反應(yīng)及產(chǎn)物純化等樣品處理的費用、毛細管電泳、實驗耗材以及設(shè)備維護費用等,以及大量的序列片段分離并觀察分析結(jié)果非常耗時、耗力。相對于Sanger測序,第