水產(chǎn)養(yǎng)殖-藥理學(xué)-6-第六章-漁藥安全性評價課件

第六章漁藥安全性評價漁用藥物與其他醫(yī)用、獸用藥品、農(nóng)藥、飼料添加劑以及各種工業(yè)用及生活用化學(xué)藥品一樣，在推廣應(yīng)用以前，均需要檢驗其毒性和安全性，即進行毒理學(xué)方面的試驗研究和安全性的毒理學(xué)評價，只有被試驗證明是安全而有效的漁用藥物，才能獲準進入臨床應(yīng)用階段。第一節(jié)漁藥毒理學(xué)簡介第二節(jié)漁藥的安全評價第一節(jié)漁藥毒理學(xué)簡介毒理學(xué)（toxicology）：是研究化學(xué)、物理、生物等因素對生物機體負面效應(yīng)的綜合性學(xué)科。漁藥毒理學(xué)：主要是研究漁用藥物對水生動、植物體的有害影響，包括這些有害影響發(fā)生的程度、頻率和發(fā)生的機制，以及如何應(yīng)用毒理學(xué)資料預(yù)測漁藥對人類和環(huán)境生態(tài)的潛在危害，從而達到控制和預(yù)防這類危害發(fā)生的目的。毒理學(xué)研究的范圍很廣，包括毒物的來源、化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、毒性、影響毒性的因素、毒物代謝動力學(xué)、毒物的生物轉(zhuǎn)化、作用機理、中毒的診斷癥狀、病理變化、組織病理、中毒的診斷、毒物的檢測方法、中毒的治療與預(yù)防等。此外毒理學(xué)還研究毒物的一些特殊作用，如“三致”作用、免疫抑制作用、行為異常、遺傳異常、對生殖的影響、對生態(tài)的影響以及毒物及其他化學(xué)物質(zhì)之間的聯(lián)合作用和相互作用等?，F(xiàn)代毒理學(xué)的研究方法可概括為實驗室方法、臨床觀察和現(xiàn)場調(diào)查、綜合危險度評定等三大類。漁藥毒理學(xué)的研究內(nèi)容主要包括以下幾個方面：即急性毒性試驗、亞急性毒性試驗和慢性毒性試驗、致突變試驗、生殖毒性試驗、致癌試驗、臨床毒性觀察和其他毒性試驗等。漁藥毒理學(xué)試驗又可大致分為兩類：一般毒性試驗和特殊毒性試驗一般毒性試驗指那些不以觀察和測定某種特定的毒性反應(yīng)為目的而設(shè)計的毒性試驗，所觀察的毒性指標具有廣譜性和不確定性等特點，如急性、亞急性、慢性（或終身）毒性試驗等。特殊毒性試驗指以觀察和測定藥物能否引起某種或某些特定毒性反應(yīng)為目的而設(shè)計的毒性試驗，毒性指標明確。狹義的特殊毒性試驗是指致畸、致突變、致癌等“三致”試驗。廣義的特殊毒性試驗還包括過敏性試驗、局部刺激試驗、免疫毒性試驗、光敏試驗、眼毒試驗、耳毒試驗等。在毒理學(xué)試驗研究的設(shè)計中，都應(yīng)該特別注意劑量、給藥途徑、動物種屬和給藥次數(shù)與觀測期限等方面。毒性試驗一、急性毒性試驗二、亞急性毒性試驗三、慢性毒性試驗四、特殊毒理學(xué)試驗五、行為回避反應(yīng)六、毒代動力學(xué)研究一、急性毒性試驗急性毒性試驗是在1d內(nèi)單次或多次（2～3次）對實驗動物給予藥物后，在7d內(nèi)，連續(xù)觀察實驗動物所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)和死亡情況，觀察毒性反應(yīng)過程中毒性的表現(xiàn)，分析毒性主要涉及何種組織和器官，毒性反應(yīng)出現(xiàn)的時間、毒性損害的嚴重程度，是否可以逆轉(zhuǎn)消失。如果實驗動物中毒死亡應(yīng)及時解剖，進行尸檢，如果發(fā)現(xiàn)病變器官就應(yīng)該進一步做病理學(xué)檢查。急性毒性試驗的目的:1.確定受試藥物的毒性強度；2.計算治療指數(shù)（therapeuticindex,TI），半數(shù)致死量LD50和半數(shù)有效量ED50的比值即治療指數(shù)；3.觀察毒性癥狀為臨床檢測毒性提供參考依據(jù)，4.為亞急性、慢性毒性的試驗設(shè)計提供參考資料。藥物急性毒性的測定，可分為靜水式生物測試法和流水式生物測試法兩種。常以開始致死濃度（ILL）、半數(shù)致死濃度LC50和半數(shù)有效量ED50或半數(shù)忍受限（TLm），并結(jié)合該漁藥引起受試生物體中毒的癥狀和特點，評價被測試漁藥毒性的強弱以及它對水環(huán)境的污染程度，為制定該漁藥的最高用藥量或環(huán)境中最大允許濃度（MATC）提供基本數(shù)據(jù)。由于急性毒性試驗的水生動物，常以小型個體為主，其中主要是各種魚類。通常要選擇敏感性高、來源廣、易于飼養(yǎng)的品種，如鰱、草魚，也可以選用金魚、鯉魚、黃鱔等。一般選用的動物個體差異不應(yīng)過大（同一批試驗中，最大個體與最小個體規(guī)格差異應(yīng)不超過1.5倍），以體重小于5.0g體長小于7.0cm的較好。進行毒性試驗之前，首先將受試動物在實驗室內(nèi)養(yǎng)殖7-10d，剔除有病或畸形個體后隨機分組進行試驗。試驗時，要控制水溫保持恒定：以溫水性魚類為25℃，冷水性魚類為12℃為宜。溶解氧要穩(wěn)定在5.0mg/L以上，pH控制在6.5-8.5之間。靜水試驗每日至少換一次試驗溶液，流式試驗每24h要換95%的新試液。試驗期間，對照組受試動物的死亡率應(yīng)低于5%。在急性毒性試驗期間，對受試動物一般不投喂餌料，從致毒開始，觀察記錄受試魚類的中毒表現(xiàn)，生理、生化變化和死亡情況。并將觀察結(jié)果采用內(nèi)插法或幾率單位-對數(shù)圖解法求出實驗動物的開始致死濃度（開始致死水平，ILL）、全部死亡的最小濃度（LC100）和半數(shù)致死濃度LC50。急性毒性的參數(shù)：半數(shù)致死劑量LD50在測定藥物毒性的實際工作中，往往要先做預(yù)備試驗，大概了解藥物引起受試動物全部死亡和不引起死亡的劑量范圍，再將受試動物分為幾組，各組給予不同的劑量，然后觀察各組的死亡率。各組動物的死亡率隨著劑量增加而遞升，但是兩者不是直線關(guān)系，呈長尾的“S”型曲線。如果將劑量值變換成對數(shù)值，則死亡率的曲線成為一條對稱的“S”型曲線，這條曲線的兩端伸延平坦，即上升速度較緩慢。藥物毒性性試驗中，死亡率從開始上升階段和鄰近100%死亡的終了階段，劑量的增加所引起的死亡率上升是比較緩慢的，即在兩端處的劑量稍有變動時，在死亡率上不宜表現(xiàn)出來。而在中間階段，即在50%死亡率處，劑量稍有增減變動時，便立即會在死亡率上產(chǎn)生明顯的差別。由此可見，位于曲線兩端的最小致死量和絕對致死量等指標都不夠敏感，且穩(wěn)定性較差，誤差較大，若作為藥物毒性測定的主要指標是不合適的。而位于曲線中段的半數(shù)致濃度最為敏感，同時也比較穩(wěn)定，誤差小，所以半數(shù)致死濃度是用來表示和衡量某藥物（或毒性）大小較常用的指標。LC50測定方法在許多統(tǒng)計學(xué)專著中都有詳細的論述和應(yīng)用舉例。LC50測定方法雖然眾多，其實影響LC50測定結(jié)果準確性的因素不是計算方法的不同，其關(guān)鍵是試驗設(shè)計應(yīng)符合要求，藥物劑量大小的確定，藥物稱量與配制，受試動物的種類、體重、性別、健康狀態(tài)，給藥操作的熟練程度。下面介紹兩種簡便的測定計算LC50的方法1.目測概率單位法

（繪圖法、直線內(nèi)插法）將試驗劑量換算成對數(shù)劑量，死亡率換算成概率（機率）單位，使劑量-死亡率曲線直線化。即按劑量與死亡百分數(shù)直接在圖紙上繪出LC50。步驟如下：1）編制計算表將劑量換算成對數(shù)劑量（X）；將死亡率換算成概率單位（Y），死亡率為0或100%者不列入。計算表應(yīng)含劑量、對數(shù)劑量、動物數(shù)、死亡動物數(shù)、死亡率、概率單位等項目。2）用目測法求LC50依據(jù)計算表中數(shù)據(jù)，以圖紙的橫坐標為對數(shù)劑量（X），縱坐標為死亡率的概率單位（Y），繪制散點圖。然后順著各點分布的趨勢目測較適直線，可先執(zhí)一條黑線在點圖上移動，使點子大體上交錯分布在直線的上下，各點至直線的縱向距離應(yīng)盡量短些，并重點照顧Y=5附近的點子。黑線位置確定后，即用鉛筆在圖上定下兩點，然后作一直線。從縱坐標概率單位為5處作一水平線，過水平線與直線的交點作垂直線與橫坐標相交，此處的讀數(shù)極為LC50的對數(shù)值。3）求LC50的可限區(qū)間上面所求得的LC50是一個樣本指標，只能作為總體LC50的點值估計，同時也可對總體LC50做范圍估計，即求總體LC50的可信區(qū)間。A.按下式求各致死量對數(shù)值的標準差B.按下列公式求半數(shù)致死量對數(shù)值的標準誤C.按下式求半數(shù)致死量的95%可信區(qū)間在實驗設(shè)計上，本法要求劑量按等比數(shù)級排列，如出現(xiàn)相鄰的重復(fù)0或100%，應(yīng)將靠邊的組棄去不計，是小劑量組只有1組0，大劑量組只有1組100%。算式如下：其中Xm——最大劑量的對數(shù)i—相鄰兩劑量比值（高劑量為分子）的對數(shù)p—各組的死亡率，以小數(shù)表示。

2.改進寇氏（karber）法急性毒性試驗舉例急性毒性一般根據(jù)LC50的大小，參照急性毒性的標準進行評價。更多的則是采用漁藥的安全濃度進行評價。國內(nèi)外關(guān)于藥物安全濃度的評價方法，主要有以下幾種：1.經(jīng)驗公式，即安全濃度=96h的半數(shù)致死濃度（96hLC50）×0.12.律納方法（Reineya），即試驗生物10個或20個在不同的藥液濃度中養(yǎng)殖，10d能全部存活的藥液濃度極為該漁藥的安全濃度。3.特倫堡（Tumbell）公式

4.Pichering等方法通過試驗得出該漁藥對實驗動物的最高允許濃度（MATC），然后除以96h的LC50，得出其應(yīng)用系數(shù)（AF），帶入下公式求出安全濃度：二、亞急性毒性試驗亞急性毒性試驗：是為了觀察受試動物在較長的時間內(nèi)（一般在相當于1/10左右的生命時間內(nèi)），少量多次地反復(fù)接觸受試漁藥所引起的損害作用或產(chǎn)生的中毒作用。亞急性毒性試驗又稱短期試驗、亞慢性毒性試驗。亞急性毒性試驗是評價漁藥毒性重要和有效方法之一。進行亞急性毒性試驗的目的：為了進一步了解受試漁藥在受試動物體內(nèi)有無蓄積作用；實驗動物能否對受試漁藥產(chǎn)生耐受性；測定受試漁藥毒性作用的靶器官和靶組織，初步估計出最大無作用劑量及中毒閾劑量，并確定是否需要進行慢性毒性試驗，為慢性毒性試驗劑量的選擇提供依據(jù)。亞急性毒性試驗常用的試驗方法有：1.細胞培養(yǎng)

如敵百蟲、六氯苯、汞、鋅對細胞有絲分裂的抑制作用；苯能引起細胞染色體損傷和畸變率增高。測定培養(yǎng)細胞中RNA的合成，可反應(yīng)藥液或污染物對細胞的毒性作用。2.組織病變

如魚類接觸苯酚，可影響肝臟正常功能，使肝組織空泡化；重金屬能破壞鰓組織，使鰓絲上皮腫脹，柱狀細胞分解及壞死。3.生理生化等指標的測定

如鋅能使魚類血液中淋巴細胞數(shù)量減少；有機磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯農(nóng)藥對膽堿酯酶的活性有特異的抑制作用。4.對魚類呼吸活動影響

一般是通過測定耗氧率、鰓蓋活動頻率或呼吸率等指標研究藥物對魚類呼吸活動影響。亞急性毒性的評價方法是將試驗數(shù)據(jù)匯總成表，進行相應(yīng)的統(tǒng)計處理和分析，并根據(jù)中毒時出現(xiàn)的癥狀，以及停藥后組織和功能損害的發(fā)展和恢復(fù)情況做出綜合性評價。三、慢性毒性試驗慢性毒性試驗：是指向受試動物反復(fù)多次給藥，連續(xù)給藥超過90d，對水產(chǎn)動物而言，給藥時間幾乎占去生命周期的大部分時間甚至終生。慢性毒性試驗的目的是為了觀察受試動物長期連續(xù)接觸藥物對機體的影響。通過實驗動物了解藥物的毒性反應(yīng)、劑量與毒性反應(yīng)的關(guān)系、藥物毒性的主要靶器官、毒性反應(yīng)的性質(zhì)和程度及可逆性等，動物的耐受量、無毒性反應(yīng)的劑量、毒性反應(yīng)的劑量及安全范圍，毒性產(chǎn)生時間、達峰時間、持續(xù)時間及可能反復(fù)產(chǎn)生毒性反應(yīng)的時間，有否遲發(fā)性毒性反應(yīng)，有否蓄積性或耐受性等?？傊?，通過慢性毒性試驗，可以了解短期試驗所不能測得的反應(yīng)，從而可以確定最大無作用劑量。慢性毒性試驗的方法與亞急性毒性試驗在試驗設(shè)計、觀察指標等方面基本相同。慢性毒性試驗一般是在急性毒性試驗和亞急性毒性試驗的基礎(chǔ)上進行的，根據(jù)急性和亞急性毒性試驗數(shù)據(jù)設(shè)置試驗濃度。試驗可從胚胎或魚苗階段開始，也可從性腺還未發(fā)育成熟的幼魚開始，一直延續(xù)到魚的生長發(fā)育成熟，以至產(chǎn)卵孵化。由于試驗時間較長，一般需要使用流水裝置，以保持藥液濃度恒定和魚類生存的良好條件。此外，還要注意食物、氧氣、pH等適宜魚類的生長條件；所得到的存活率、生長率、產(chǎn)卵率和孵化率等數(shù)據(jù)，采取統(tǒng)計的方法進行處理，以此求出漁藥對試驗對象的最大允許濃度。除此之外，檢測魚體內(nèi)的蓄積也有較大的價值。有些藥物，不僅在試驗的第一個生活周期，而且持續(xù)三代仍可檢出有蓄積的現(xiàn)象，如甲基汞在魚體內(nèi)迅速蓄積，第二代和第三代的魚卵和胚胎中均有從親魚轉(zhuǎn)移下來的大量汞殘留。由于慢性試驗的周期較長，為了縮短周期，可尋找成熟時間短的無脊椎動物作為試驗對象，還可探索采用短期毒性試驗的方法預(yù)測慢性毒性的可能性。慢性毒性試驗是毒理學(xué)研究中試驗周期最長、困難最大、耗資最高、難以進行重復(fù)的試驗，對于新藥研究成功與否具有重要的作用。慢性毒性試驗是臨床前安全性評價的主要內(nèi)容，它還為臨床安全用藥的劑量設(shè)計以及毒副作用監(jiān)測提供參考依據(jù)。四、特殊毒理學(xué)試驗特殊毒理學(xué)試驗也稱專門毒性試驗，主要包括繁殖試驗、致畸試驗、致突變試驗和致癌試驗等。1.繁殖試驗是檢驗受試藥物對實驗動物生殖機能影響的一種方法。試驗項目有一般生殖毒性試驗（喂養(yǎng)致畸試驗）、傳統(tǒng)致畸試驗和喂養(yǎng)繁殖試驗。在水產(chǎn)動物中還廣泛應(yīng)用胚胎毒性試驗。試驗?zāi)康氖菫榱肆私馑幬飳嶒瀯游锷硻C能的影響以及胚胎毒性，并為致畸試驗提供資料。實驗動物為小鼠或大鼠，有時也用兔。一般設(shè)計3個藥物劑量組和1個對照組。最高劑量應(yīng)產(chǎn)生輕度毒性反應(yīng)；最低劑量為治療有效劑量的2～3倍。給藥途徑與臨床用藥相同。給藥時間：一般生殖毒性試驗為雄性交配前60d，雌性交配前14d。繁殖試驗為大鼠斷奶后開始飼喂受試藥物，直到90d。傳統(tǒng)致畸試驗為胚胎器官形成期（7-15d）開始飼喂受試藥物。胚胎毒性，廣而言之是漁藥對動物胚胎產(chǎn)生的毒性作用。如以魚類作為試驗對象，因魚類胚胎在不同發(fā)育階段，對藥物敏感性會有所不同。其毒性可以表現(xiàn)出胚胎死亡、胚胎發(fā)育遲緩、胚胎畸形及胚胎功能不全等四個方面。試驗用魚卵要求對受試藥物比較敏感，并且便于觀察。屬于半漂浮性的鰱、鳙、草魚、青魚的魚卵符合這個要求。特別是草魚卵，其卵胚發(fā)育初期有明顯的藍綠色、比鰱卵胚的淡藍色（有的略呈淡灰色）容易觀察。金魚、圓尾斗魚、食蚊魚等小型觀賞魚類，易于繁殖，便于取材，也可作為漁藥毒性測試的魚卵。試驗魚數(shù)量可以視容器大小，魚類品種而定，一般為20-100個。為了便于觀察胚胎發(fā)育，可采用透明的玻璃皿，如培養(yǎng)皿、培養(yǎng)缸等作為試驗容器，但是以能盛溶液200-500ml的容器較好。去用試驗的魚卵，必須首先確定它們是受精卵，一般待發(fā)育過原腸中期時方開始毒性試驗。胚胎毒性試驗處理的方法有兩種：一種是以受試藥物處理親魚，如對產(chǎn)卵的試驗親魚每日定時定量投喂含有一定量漁藥的餌料，或者把親魚飼養(yǎng)于含有試驗漁藥的水中，使其接觸吸收藥物，或者對親魚人工注射一定劑量的藥物，取其人工授精或自然受精的卵使用。另一種是在正常的魚卵，將其直接放入含有受試漁藥的溶液中處理。受試藥物的濃度，一般根據(jù)96h的LD50值為基礎(chǔ)，按其比例遞減的方式設(shè)計試驗濃度，但是必須包括魚卵全部死亡的最小濃度（LC100）與魚卵全部存活的最大毒物濃度（LC0），以便能獲得半數(shù)忍受限、開始致死濃度及閾濃度等。2.致畸試驗致畸試驗是為了了解受試藥物是否通過母體對胚胎發(fā)育過程(主要是胚胎的器官分化過程)產(chǎn)生不利影響。對魚類的致畸試驗可以利用親魚和受精卵進行。胚胎畸形是觀察指標之一。其致畸原(teratogens)可以從兩個方面分析。一是來自親魚母體，由于通過母體的血液循環(huán)傳遞至生殖腺，如敵百蟲、敵敵畏等許多藥物就易于在母體的生殖腺內(nèi)積累，經(jīng)卵母細胞的二次成熟分裂，脫離濾泡排卵，產(chǎn)卵受精直至孵化，于卵黃囊吸收階段方顯示出較強的毒性，出現(xiàn)畸形胚胎，導(dǎo)致發(fā)育遲緩，功能不全以致死亡。另一方面，由于受精卵直接接觸外來藥物。尤其以卵胚的早期發(fā)育階段，特別是在囊胚期之前，極易引起畸形的現(xiàn)象。對哺乳動物具有致畸性的有毒物質(zhì)能引起胎兒非致死性的組織或機能變化，例如導(dǎo)致腭裂、并趾、骨化延緩、肋畸形、腎發(fā)育不全、畸形足等仔胎畸形。致畸試驗是在胚胎細胞分化和胎兒組織形成期給受孕動物飼喂受試藥物，然后在分娩期觀察仔胎是否出現(xiàn)畸形以判定受試藥物的毒性。過早地給予受試藥物可能會影響受精卵的著床過程，此時胚胎對致畸物的反應(yīng)往往不敏感，過遲給予受試藥物，則胚胎發(fā)育基本成熟，致畸作用就可能不會顯示出來。實驗動物常用小鼠、大鼠和兔。劑量分組方法與慢性毒性試驗相同，至少應(yīng)用3種劑量。一般以最大無作用劑量用于高劑量組，以其1／30左右的劑量用于低劑量組。一般小鼠與大鼠于妊娠6-15d，兔于妊娠6-18d飼喂受試藥物，至妊娠結(jié)束前1-2d，以手術(shù)方法從母體內(nèi)取出胎兒，檢查每個活胎有無外觀畸形，并進行特殊的固定或染色以檢查胎兒臟、腦部及骨骼畸形等。根據(jù)各組動物畸胎出現(xiàn)的數(shù)量及所產(chǎn)活胎總數(shù)，計算畸胎發(fā)生率。經(jīng)統(tǒng)計處理后求出最小致畸劑量，并以致畸指數(shù)比較不同毒物的致畸強度。致畸指數(shù)=A／B式中A——母體的LD50B——最小致畸劑量。一般認為致畸指數(shù)在10以下的毒物為非致畸物，10-100者為致畸物；>100者為強致畸物。3.致突變試驗致突變毒性是指生物細胞的遺傳物質(zhì)出現(xiàn)可被察覺并可遺傳的變化，它包括基因突變和染色體畸變。致突變試驗的項目包括1）微生物回復(fù)突變試驗、2）哺乳動物培養(yǎng)細胞染色體畸變試驗3）微核試驗1）微生物回復(fù)突變試驗（Ames試驗）所用微生物為組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌的TA97、TA98、TAl00、TAl02，或大腸桿菌WP2的若干株。上述4株鼠傷寒沙門氏菌常用。應(yīng)在加肝微粒體酶(S9)混合物和不加S9的平行條件下實驗，受試動物至少5個不同劑量，另設(shè)陰性對照組和陽性對照組。最大劑量可達每皿5.0mg，最小劑量不得小于有效濃度和藥量。2）哺乳動物培養(yǎng)細胞染色體畸變試驗

用哺乳動物原代或傳代培養(yǎng)細胞進行。設(shè)3個以上受試藥物組，1個陰性對照組，1個陽性對照組。最大劑量應(yīng)以50%細胞生長抑制濃度為準，最低劑量不得小于有效治療劑量的2～3倍。3）微核試驗

用性成熟的小鼠進行。最少設(shè)3個受試藥物劑量組，1個陰性和1個陽性對照組。最大劑量應(yīng)以1／2LD50為準，最小劑量不得小于治療有效劑量的2～3倍。以上3種試驗均應(yīng)按規(guī)定的方法作結(jié)果判定。陽性對照藥物應(yīng)獲得陽性結(jié)果，溶劑對照的陰性組應(yīng)獲得陰性結(jié)果。否則結(jié)果無效；應(yīng)重新試驗。根據(jù)農(nóng)業(yè)部有關(guān)《新獸藥特殊毒性試驗技術(shù)要求》規(guī)定，致突變試驗必須至少做三項試驗，其中Ames試驗和微核試驗為必做項目，精子致畸、睪丸精原細胞染色體畸變、顯性致死突變試驗三項可任選一項，如果前二者任何一項為陽性，均必做顯性致死突變試驗。致癌試驗較為復(fù)雜，國內(nèi)因受條件限制，新獸藥的特殊毒性試驗中暫未列入。4.致癌試驗對于化學(xué)結(jié)構(gòu)與致癌有關(guān)，致突變試驗為陽性，或毒性試驗提示有可能致癌的藥物，必須進行致癌試驗。選擇實驗動物應(yīng)根據(jù)動物對某種受試藥物致癌作用反應(yīng)的敏感性決定。大鼠或小鼠對多種致癌物的反應(yīng)較敏感，故致癌試驗一般多選用大鼠或小鼠，有時還需要增加一種非嚙齒類動物如犬和猴。此外，根據(jù)試驗要求，也可選用其他動物，如雛鴨對黃曲霉毒素誘發(fā)肝癌的作用較敏感，雞對致食管癌因子較為敏感。選擇動物時，應(yīng)對所選動物的腫瘤自然發(fā)生率有所了解。由于本實驗持續(xù)時間較長，為使實驗動物的腫瘤發(fā)生率與對照組相比具有明顯的顯著的差異，并考慮到試驗中途動物可能發(fā)生死亡等因素，實驗動物的數(shù)量不宜太少，一般情況下，嚙齒類動物每個劑量組中雌雄至少各25-50只，犬、猴每組4-6只。試驗期限通常要求從斷乳開始（有時在斷乳前開始）直到自然死亡，幾乎包括整個生命期，因為大量的腫瘤多數(shù)發(fā)生在生命后期。此外，試驗期限長可使某些致癌性較弱的受試藥物充分顯現(xiàn)其作用。小鼠試驗期至少為一年半，大鼠至少為2年。若試驗已進行一年半或2年，出現(xiàn)腫瘤的情況仍不甚顯著時，則應(yīng)繼續(xù)延長，一般在動物接近自然死亡期前進行病理剖檢，以免因自然死亡而影響病變的觀察。試驗過程中要求經(jīng)常觀察動物的一般狀況，定期檢查和記錄腫瘤的總發(fā)生率、各種腫瘤發(fā)生率和腫瘤出現(xiàn)期限等指標。病理學(xué)檢查是評定受試藥物致癌作用的主要依據(jù)，在病理剖檢時應(yīng)仔細檢查每一個器官，發(fā)現(xiàn)腫瘤或疑似腫瘤的組織器官均應(yīng)進行細胞病理學(xué)檢查，小動物的臟器較小，應(yīng)做系統(tǒng)的組織學(xué)檢查。在對照組與試驗組(給藥組)之間進行如下比較：①對照組中出現(xiàn)的某種腫瘤在試驗組中的發(fā)生率是否增高。②在試驗組中是否出現(xiàn)某種在對照組中從未見到的腫瘤。③上述兩種情況是否在試驗組中同時發(fā)生。如對某種動物無論多大劑量的藥物均發(fā)現(xiàn)有明確的致癌作用，則認為對人有致癌的潛在性，定為致癌陽性。如果在受試的兩種動物均為陰性結(jié)果，可定為致癌陰性。有些化學(xué)物質(zhì)，在應(yīng)用高劑量時對實驗動物的致癌性輕微，欲測定其在極低量時是否引起公害則很困難。飼料添加劑及農(nóng)藥殘留的致癌問題在動物毒理學(xué)中十分重要。關(guān)于漁藥施藥后對水產(chǎn)動物(魚、蝦等)及人體致毒、致癌評價常用以下公式：

式中HCC一致毒致癌基準(mg／L)；RAI——每日有危險物質(zhì)攝入量(mg／kg·d)；WA——平均體重(kg)；Wt——成人每日消費量(mg／kg·d)；F——魚蝦的消費率；BCF——毒物、藥物的生物濃縮因子。漁藥引起魚類的回避，是魚類對外界環(huán)境刺激的一種保護性反應(yīng)，它是通過嗅覺、視覺、側(cè)線及其他感受器而實現(xiàn)的?；乇芊磻?yīng)是一種生理效應(yīng)，當外界環(huán)境物質(zhì)對魚類某一感官產(chǎn)生刺激，就會導(dǎo)致其行為的改變。利用魚類的回避特性，可以在一定程度上判定漁藥毒性的大小與作用的持續(xù)情況。五、行為回避反應(yīng)回避試驗裝置，是進行回避試驗的基本條件。目前國內(nèi)外所用的裝置種類很多，形式不一，且各具特色。主要裝置有：管道型回避槽、分叉型回避槽、TL一81型魚類回避槽、環(huán)型回避槽。試驗時，先將試驗魚放入回避槽進行馴化，然后分別放入清水與試液，記錄魚類在各只槽內(nèi)的停留時間與進入次數(shù)，計算出不同濃度內(nèi)魚類回避的百分率，以判斷試魚類對受試漁藥的回避反應(yīng)。六、毒代動力學(xué)研究急性和慢性毒性試驗，是考察藥物在不同劑量水平產(chǎn)生毒性的表現(xiàn)和程度，劑量和給藥時間與毒性的關(guān)系，毒性靶器官與藥物的關(guān)系等，但是并未涉及體內(nèi)藥物濃度及其在體內(nèi)駐留蓄積的問題。開展毒代動力學(xué)研究，對于理解藥物毒性實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)毒性的劑量水平和時程的關(guān)系，提高毒性研究資料的價值等均具有意義。毒代動力學(xué)試驗是毒理學(xué)研究的一個重要組成部分。它能提供毒代動力學(xué)參數(shù)．比較全身染毒(systemicexposure)與毒性的關(guān)系。與藥物代謝動力學(xué)研究不同，毒代動力學(xué)是在毒性試驗條件下進行研究，用于解釋毒性試驗結(jié)果，而不是為了描述藥物動力學(xué)的基本特征。毒代動力學(xué)研究的主要目的：一是在毒性實驗條件下藥物所達到的全身染毒與毒性發(fā)現(xiàn)的內(nèi)在聯(lián)系；二是比較實驗動物和靶動物的全身染毒來解釋毒理實驗數(shù)據(jù)的價值；三是為臨床前毒性研究的實驗設(shè)計，如動物種屬、實驗劑量和用藥方案的設(shè)計提供依據(jù)。最終目的是通過不同毒性實驗中的毒代動力學(xué)研究，并與不同的毒性研究結(jié)果一起為藥物的安全性評價提供依據(jù)。1.毒代動力學(xué)研究的設(shè)計

毒代動力學(xué)試驗設(shè)計應(yīng)遵循以下基本原則：首先，與藥代動力學(xué)研究一樣，要求建立專屬性好、靈敏度高的血藥濃度測定方法。其次，研究采用與藥物臨床應(yīng)用和動物毒性研究相同的給藥途徑和劑型，以便比較不同種屬動物的藥物全身染毒程度與毒性之間的關(guān)系。其三，測定目標物可以是原型藥物，也可以是活性代謝物。當藥物代謝成數(shù)種活性代謝物時，而且產(chǎn)生毒性的活性代謝物明顯影響組織或靶組織反應(yīng)時，應(yīng)主要測定其代謝物的濃度。其四，數(shù)據(jù)和參數(shù)統(tǒng)計，通常以平均值和變異系數(shù)(或相對標準差)表達。2.毒代動力學(xué)的研究內(nèi)容

毒代動力學(xué)的研究一般包括在毒性試驗中的單劑量試驗、多劑量試驗、組織分布試驗、遺傳毒性試驗、致癌試驗、生殖毒性試驗以及特殊藥物(如生物技術(shù)藥物)的毒代動力學(xué)研究。研究方案要根據(jù)不同的試驗來制定。單劑量試驗：單劑量試驗中的毒代動力學(xué)研究，有助于確定試驗劑趕方案，預(yù)測給藥期間藥物全身染毒的速度、程度和持續(xù)時間。多劑量和慢性毒性試驗：多次給藥毒代動力學(xué)試驗的設(shè)計原則是，試驗方案和動物選擇應(yīng)與藥效學(xué)研究和藥代動力學(xué)研究相符。組織分布試驗：單劑量給藥的組織分布研究，應(yīng)作為藥物臨床前安全性評價的組成部分。出現(xiàn)以下情況時應(yīng)考慮進行多劑量給藥的組織分布試驗研究：①單劑量時出現(xiàn)或提示，藥物或代謝物在器官或組織中蓄積．分布半衰期較長；②在藥代動力學(xué)和毒代動力學(xué)研究中，血液循環(huán)中藥物或代謝物的穩(wěn)態(tài)濃度顯著高于單劑量給約研究中所預(yù)測的濃度；③單劑量組織分布試驗和藥理試驗中，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵性組織分布與組織的病理變化相關(guān)；④擬開發(fā)具有特異性分布的靶向釋放藥物時。多劑量給藥的組織分布試驗的設(shè)計，應(yīng)有針對性地選擇一定的劑量和特定種屬的動物。應(yīng)利用已有的藥代動力學(xué)和毒代動力學(xué)資料，設(shè)計給藥時間和選擇目標組織進行測定。一般給藥不得少于1周，血漿藥物或代謝物濃度未達到穩(wěn)態(tài)時也不必長于3周。對于半衰期長的藥物、不完全消除的藥物，或具有不可預(yù)見的毒性靶器官分布的藥物，多劑量組織分布試驗方案設(shè)計和給藥時間的確定應(yīng)有區(qū)別。第二節(jié)漁藥的安全評價漁用藥物的不合理使用，會對用藥的水產(chǎn)動、植物、水產(chǎn)食品的消費者(人)和環(huán)境生態(tài)產(chǎn)生有害影響。為了保障人、動物健康和環(huán)境不被污染，避免含化學(xué)物質(zhì)殘留的水產(chǎn)品對人引起有害反應(yīng)，就必須對食品動物所能接觸的各種化學(xué)物質(zhì)(如藥物、添加劑、工農(nóng)業(yè)污染物、生物毒素等)進行安全性評價。藥物安全性評價，主要包括毒理學(xué)評價靶動物毒性評價殘留安全性評價環(huán)境的安全性評價一、毒理學(xué)評價毒理學(xué)評價主要包括四個階段：急性毒性試驗階段蓄積毒性和致突變試驗階段亞慢性毒性試驗（包括繁殖試驗和致畸試驗)和代謝毒性試驗階段慢性毒性試驗階段(包括致癌試驗）1.急性毒性試驗

目的是要了解受試藥物毒性的強度和性質(zhì)，為蓄積亞慢性試驗的劑量選擇提供依據(jù)。試驗項目包括測定經(jīng)口LD50。如劑量達10.0g／kgb.w．仍不引起動物死亡，則不必繼續(xù)測定，必要時尚需進行7d喂養(yǎng)試驗。如LD50或7d喂養(yǎng)試驗的最小有效量小于人可能攝入量的10倍，此化合物應(yīng)放棄，不得用于食品動物。如>10倍，可進入下一階段試驗。2.蓄積試驗

急性毒性試驗LD50>10.0g／kgb.w.者，可不必進行蓄積毒性試驗。蓄積試驗可用蓄積系數(shù)法或20d試驗法。如蓄積系數(shù)(k)<3，為強蓄積性；k≥3為弱蓄積性。在20d試驗中，如果1／20LD50劑量組動物有死亡，而且有量效關(guān)系，則為強蓄積性；如1／20LD50劑量組動物無死亡，則為弱蓄積性。強蓄積性化合物應(yīng)放棄。3.亞慢性毒性試驗和代謝毒性試驗

亞慢性試驗的目的，是觀察受試藥物以不同劑量長期飼喂，對動物的毒性作用性質(zhì)和靶器官，并確定最大無作用劑量；了解受試藥物對動物繁殖功能的影響以及對其子代的致畸作用；為慢性毒性和致癌試驗的劑量選擇提供依據(jù)，并為評價受試藥物能否應(yīng)用于食品動物提供依據(jù)。試驗項目包括90d喂養(yǎng)試驗、喂養(yǎng)繁殖試驗、喂養(yǎng)致畸試驗和傳統(tǒng)致畸試驗。前3項試驗可用同一批動物進行。如上述試驗中的任何一項的最敏感指標的最大無作用劑量(以mg／kgb.w.計)≤人的可能攝入量的100倍，就表明該化合物的毒性較強，應(yīng)予放棄。如>I00倍<300倍，可進行慢性毒性試驗。對于≥300倍者，則不必再進行慢性毒性試驗。4.慢性毒性試驗(包括致癌試驗)

目的是要發(fā)現(xiàn)僅長期接觸才出現(xiàn)的毒性作用，尤其是進行性或不可逆的毒性作用及致癌作用；進一步確定最大無作用劑量，對最終評價受試藥物能否用于食品動物提供依據(jù)。實際工作中可將2種慢性毒性試驗和致癌試驗結(jié)合在一個動物試驗中進行?？捎?種性別的大鼠和(或)小鼠進行。如慢性毒性試驗所得的最大無作用劑量≤人的可能攝入量的50倍，表示毒性較強，應(yīng)予放棄；>50倍而<100倍者，還需進行進一步評議；>100倍者，可考慮允許使用于食品動物，并制訂日許量（ADI）。如果任何一個劑量發(fā)現(xiàn)有致癌作用，且有量效關(guān)系，則需進行再評議，以做出評價。靶動物的毒性評價就是直接用靶動物進行藥理學(xué)試驗，旨在確定藥物在靶動物可能的毒副作用或不良反應(yīng)、毒副作用的劑量范圍，從而提出減少或避免毒副作用的辦法。二、藥物對靶動物的毒性評價用靶動物進行毒性研究的目的：要證明受試藥物在推薦使用條件下對靶動物的安全性；了解與受試藥物毒性有關(guān)的癥狀和反應(yīng)；若最大推薦量的5倍或不足5倍的劑量就能使受實驗動物中毒，毒性研究應(yīng)證明受試藥物對動物的健康或生產(chǎn)不產(chǎn)生明顯副作用的最大劑量；確定受試藥物對受試動物的安全范圍。

基本要求

試驗設(shè)計要合理．嚴格對照，由有經(jīng)驗的研究人員進行。實際工作中用采用盲樣法。受試動物對照動物應(yīng)具有相同的特點，一視同仁地對待，只是藥物暴露不一樣。在整個試驗過程中．臨床觀察應(yīng)每日記錄2次，每周7d。所有試驗組都應(yīng)采用合適的臨床病理學(xué)程序。若研究中包括組織學(xué)檢查內(nèi)容，組織應(yīng)從所有動物或每組中一定數(shù)量的有代表性的動物(通常為一半或事先規(guī)定的量)中采取。試驗組和對照組都應(yīng)進行組織學(xué)檢查。如果組織經(jīng)顯微觀察有損傷，下一個較低劑量組的組織也應(yīng)做相應(yīng)檢查，直到確定無可察性作用量為止。1.動物耐受性試驗

藥物在受試動物體內(nèi)的劑量反應(yīng)曲線，是一個從無效到有效再至中毒反應(yīng)的連續(xù)的動力學(xué)過程。人們感興趣的是有效劑量和中毒劑量，以及兩者之差所代表的安全范圍(圖4—2)。藥物的耐受性試驗是在對照條件下，確定靶動物對藥物毒性劑量的反應(yīng)。即通過誘導(dǎo)毒性和記錄受試動物對特定劑量的臨床癥狀來變化。這可提示藥物中毒作用的臨床表現(xiàn)。一般而言，對于起局部作用的動物，不需做耐受性試驗。2.食用魚的安全性評價

近年來水產(chǎn)業(yè)得到了迅速發(fā)展，無論是淡水還是海水水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中都在廣泛使用治療藥、防腐藥、消毒藥、麻醉藥、滲透調(diào)節(jié)增強劑等各種藥物。進行對食用魚的安全性評價試驗前，首先應(yīng)該進行全面的文獻檢索，包括擬用于對照的每種疾病或綜合征的病原、受感染魚的種類、疾病的流行和危害、病原學(xué)中的環(huán)境或其他因素方面的資料，還應(yīng)包括控制魚病的技術(shù)資料。治療性化合物可以3種方式用于魚類：添加于水中浸浴受試魚類，混合于飼料投喂魚類和直接注射魚體。一般而言，對于外寄生蟲和體表細菌感染癥，可將藥物添加于水中進行浸浴治療，對于全身性細菌感染和內(nèi)寄生蟲病，可通過制作藥物飼料或注射給藥．對水產(chǎn)動物而言，溫度是一種非常重要的外部因素．因為魚類是變溫動物。溫度變化也會影響受試水產(chǎn)動物對藥物的代謝速度。其他環(huán)境因素的影響通常都比溫度小。對于口服給藥，試驗應(yīng)選擇標準的魚種。對于溫水魚疾病預(yù)防的相關(guān)試驗?？刹捎冒唿c叉尾鮰等魚類進行。而虹鱒等可作為冷水魚疾病預(yù)防試驗的試驗魚。受試魚的發(fā)育階段依藥物的用途而定。試驗應(yīng)在商業(yè)養(yǎng)殖條件下至少兩種水溫(反映生產(chǎn)實踐)的范圍進行，例如溫水魚為17℃和25℃，冷水魚為12℃和17℃。受試動物可能出現(xiàn)的副作用至少要連續(xù)觀察14d。任何可察性反應(yīng)都應(yīng)記錄和報告，包括流行性和嚴重性。為證明藥物的有效性，每種疾病至少要進行兩種規(guī)范的對照研究?？诜o藥的漁用藥物的有效性和安全性評價應(yīng)依據(jù)如下步驟：1）在離體條件下，證明藥物的抑制或殺滅病原菌的有效濃度，包括時間與劑量關(guān)系。2）用實驗感染魚建立控制病原菌的有效劑量，測定時間／劑量關(guān)系。應(yīng)采用劑量梯度試驗測定對典型傳染病的效果，包括1個不加藥的對照組和3個非零的治療劑量組。3個劑量中，有1個是所估計的最佳劑量。其他試驗組在特定試驗中還用以對比評價受試魚的增重率和飼料報酬。3）在生產(chǎn)條件下證明藥物至少對3種流行病的效果。希望在多個地點進行試驗，但是這并非是強制性要求。也須設(shè)立不感染不加藥的對照組。4）毒性研究應(yīng)采用外表正常的動物進行，應(yīng)能證明藥品在受試動物的合適安全范圍。安全性研究也包括1個非加藥的對照組和3個非零的藥物劑量組。3個劑量應(yīng)是1個推薦劑量，1個估計的毒性劑量和1個中等劑量，或者使用0X、1X、3×、5×的方案。給藥時期應(yīng)是最大推薦使用的期限的3倍。所有試驗須用已經(jīng)上市的配合飼料進行。對于擬用于親魚的藥物，還要求有繁殖方面的試驗資料。5）安全性評價的參數(shù)。所有的中毒反應(yīng)應(yīng)是有特征性的，還應(yīng)監(jiān)測死亡率、發(fā)病率、增重率、血液學(xué)和血液化學(xué)。每個治療組的動物均應(yīng)進行尸體剖檢。6）試驗前應(yīng)確定統(tǒng)計分析的方法。若資料收集后發(fā)現(xiàn)所期望的差異很明顯，可不必進行統(tǒng)計分析。對于通過浸浴給藥的藥物，就是將藥物加到養(yǎng)魚的水中，或?qū)Ⅳ~放入含藥的溶液中進行浸浴處理，使魚與藥物接觸一段時間或長期接觸。要用標準的魚種進行試驗。受試魚發(fā)育階段的確定取決于藥物的用途。所有藥物要在至少兩個不同水質(zhì)條件下進行試驗。水質(zhì)對藥物的有效性和(或)動物的安全不應(yīng)產(chǎn)生影響(如溫度、pH、總硬度、總硬度或有機質(zhì)負荷)。所選定的試驗條件取決于藥物在水中的理化特征。對受試動物應(yīng)該就副作用等至少觀測14d。任何可察性反應(yīng)均應(yīng)記錄和報告，包括流行性和嚴重性。為證明藥物的有效性，每種疾病至少要進行兩個規(guī)范的對照試驗。對浸浴給藥的藥物的有效性和安全性評價步驟如下：1）用離體試驗確定抑制或殺滅病原菌的有效濃度，包括時間和劑量關(guān)系。2）建立在特定時間控制實驗室使魚發(fā)病病原菌的有效濃度；例如15.0mg或30.0mg，1、4、8、12h等。確定時間／劑量關(guān)系。用劑量梯度研究法確定對規(guī)范的重癥感染的效果，采用不加藥的空白對照組和3個非零的治療濃度。3個濃度中有1個應(yīng)該是所估計的最佳藥物濃度，2個濃度分別是較低和較高劑量組。在疾病治療過程中，時間／劑量關(guān)系至關(guān)重要。不感染不加藥的對照組用以確定正常或健康魚的“正?！劳雎?，在特定的試驗或測定中，該對照組也可以對比評價受試魚的增重率和飼料報酬。3）要證明藥物在生產(chǎn)條件下至少對2種暴發(fā)性流行病的有效性?？稍诙鄠€地點進行試驗，但是這并非是強制性要求。也必須設(shè)立不感染不給藥的對照組。4）安全性試驗應(yīng)使用外表正常的魚進行，以證明藥品在擬用動物種屬的安全范圍。安全性試驗分組也包括：1個非加藥的對照組和3個非零藥物濃度組，3個濃度應(yīng)是1個擬用濃度、1個估計的毒性濃度和1個中等濃度，或者用推薦應(yīng)用濃度的倍數(shù)0×、1×、3x和5x的方案。給藥期應(yīng)是最大推薦使用期的3倍。所有研究均應(yīng)使用已經(jīng)上市的配合飼料進行。對于擬用于親魚的藥物還需要藥物對繁殖影響的資料。j：5）安全性評價的參數(shù)。所有的毒性反應(yīng)是具有特點的。還應(yīng)監(jiān)測死亡率、發(fā)病率、增重率、血液學(xué)和血液化學(xué)指標。每個處理組的動物應(yīng)進行尸體剖檢。6）研究前應(yīng)確定合適的統(tǒng)計分析方法。中草藥是我國的國粹。漁用中藥的安全性和有效性評價尚無統(tǒng)一的要求。中藥飼料添加劑，一般要做急性毒性試驗。如因給藥濃度或給藥體積過大，無法測出LD50者，可測定最大濃度下的最大容積。試驗一般是在24h內(nèi)灌服2～4次，在7d內(nèi)觀察動物的表現(xiàn)。三、中草藥的評價對于文獻記載有中等毒性的中藥，除進行急性毒性試驗外，還應(yīng)做亞慢性毒性試驗。如受試樣品體積過大，難以選出中毒的最大劑量時，則應(yīng)參考急性毒性試驗。選擇動物能承受的最大劑量或數(shù)倍于最大有效量的劑最(高于臨界推薦劑量)為高劑量組進行分組試驗。給藥方式與臨床一致；亞慢性毒性試驗常用大鼠，給藥和觀察期為60～90d。按西藥的方法測定毒理學(xué)指標。中藥的臨床試驗也分實驗臨床試驗和擴大區(qū)域臨床試驗兩部分。對于保健促生長的中藥，實驗臨床試驗是在實驗室條件下進行，目的是要確定有效劑量和安全性。試驗分不同劑量組，每組動物的數(shù)量應(yīng)符合統(tǒng)計學(xué)要求。實驗動物為靶動物，用藥方式與推薦的臨床應(yīng)用藥方式相同。應(yīng)設(shè)空白對照組，有同類有效中藥可用的，還應(yīng)設(shè)陽性對照組。擴大區(qū)域的試驗是自然生產(chǎn)條件下的較大范圍內(nèi)考察藥物的有效性的安全性。試驗設(shè)一個對照組和兩個劑量組。兩個劑量組中，一組為推薦的臨床有效量，另一組為高劑量組(劑量為推薦臨床劑量的1倍或幾倍)。臨床試驗的觀察指標有發(fā)病率、存活率、增重率、飼料報酬率和動物產(chǎn)品質(zhì)量等。對于防治疾病的中藥，實驗臨床試驗應(yīng)采用人工發(fā)病模型進行試驗。感染前給藥是觀察預(yù)防作用，感染后給藥以觀察治療作用。受試動物分為空白對照組、陽性對照組和2～3個受試藥物組。試驗前最好進行體外抑菌試驗。如果人工感染有困難，也可利用自然病例。但是自然病例的性質(zhì)、發(fā)病的程度等必須診斷確實。擴大區(qū)域試驗前，應(yīng)做流行病學(xué)調(diào)查，選擇合適的常發(fā)病的動物群體進行試驗。無論預(yù)防還是治療試驗，均需設(shè)對照組(空白對照和有效對照)。對于試驗結(jié)果應(yīng)進行統(tǒng)計分析。四、殘留研究畜、禽、水產(chǎn)動物是人類蛋白質(zhì)食品肉、乳、蟹、魚的來源，因而在畜、禽、水產(chǎn)動物飼養(yǎng)過程中所用的化學(xué)物質(zhì)的安全性評價與人類食品中化學(xué)物質(zhì)殘留的安全性評價直接相關(guān)。同時，由于獸用藥品只是在有限時間內(nèi)使用，而大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)，不論是像黃曲霉等偶然污染物還是有目的使用的飼料添加劑，一般都是長期的、甚至是對食品動物終生使用。因此，對于任何一種飼料添加劑(或飼料污染物)進行安全性評價，需考慮以下幾方面的問題。飼料中化學(xué)物質(zhì)對食品動物、共生微生物以及食品消費者的毒性。畜、禽、水產(chǎn)品中作為持久性殘留物的添加劑及其代謝物的化學(xué)性質(zhì)和數(shù)量。畜、禽、水產(chǎn)品中殘留物對人的潛在毒性，動物哪些組織或器官中的含量高。殘留物在食品中的允許殘留量。是否有適宜的監(jiān)測方法。食品加工過程對飼料添加劑在食品中的殘留及各種代謝的毒性是否有影響。1.代謝研究和用于毒性測試殘留物的選擇

對靶動物使用的化合物，不一定在可食性產(chǎn)品中出現(xiàn)。動物體的酶系統(tǒng)或體液可能對此化合起作用，產(chǎn)生出新的物質(zhì)（代謝物和降解物）。動物可食產(chǎn)品中的這些物質(zhì)，是原型化合物吸收速度與程度、代謝速度與程度以及原型化合物和代謝物排泄速度的復(fù)合函數(shù)。受試動物體內(nèi)化合物的總殘留，由母體化合物、游離代謝物及與內(nèi)源性分子共價結(jié)合的代謝物組成。組織中每種殘留物的相對量和絕對量，隨著化合物具有不相似的毒性潛能，因此，必須研究用藥靶動物可食產(chǎn)品中總殘留的數(shù)量、持續(xù)時間和化學(xué)性質(zhì)，還要研究化合物在毒性實驗動物體內(nèi)的代謝情況。總殘留清除研究：最后一次給藥后，靶動物可食性組織中與藥物有關(guān)的總殘留的消除應(yīng)該測定。對于水產(chǎn)動物，可食性組織是主要是肌肉。這些組織將用以進行原形藥物和各個代謝物的定性和定量測定。通過這些數(shù)據(jù)可以用作建立休藥期標準。放射性示蹤法是迄今用于確定藥物總殘留最有用的技術(shù)。14C是被最為廣泛使用的同位素，因為它的標記不會出現(xiàn)分子間交換的問題。清除研究通常是向過去未用藥的足量動物給予放射標記的藥物，最后一次用藥后，間隔一定時間將分組的動物處死。所給的化合物具有很高的放射性純度，因為放射性標記的污染物可能造成一種藥物持續(xù)殘留的假象。放射性標記的地點，應(yīng)保證原形藥物中很可能與毒性有關(guān)的部分得到了恰當?shù)臉擞?。例如，如果一個原形化合物中有兩個部分可能與毒性有關(guān)，代謝作用可能使它們分解成兩部分，那么就應(yīng)該測定這兩部分的清除情況。可將每部分分別標記的化合物等摩爾給藥，進行單次研究，或分別將每部分標記的化合物等分摩給藥，進行兩次研究；或?qū)煞N同位素標記如14C和3H)的化合物同時給藥，進行單次研究。所給劑量應(yīng)是打算使用的高劑量，應(yīng)按靶動物暴露藥物的方式給藥。例如，藥物是以某種特定治療作用而給動物用一次，則放射性標記的藥物只給動物用一次。若要延長治療同時又要零休藥期，就要提供能證明殘留濃度已近似達到穩(wěn)態(tài)的資料。殘留清除研究可采用7d給藥方案。若無法證明是否達到穩(wěn)態(tài)濃度，就要確證延長治療不會產(chǎn)生新的代謝物。例如，證明代謝物的類型和組織中代謝物的相對比例是穩(wěn)定的。測定組織中總殘留清除時，零休藥期和隨后3個時間至少要各宰殺3頭動物。若為零休藥期，則要向6頭動物給藥足夠長時間以證明殘留達到穩(wěn)態(tài)，隨后在零時宰殺動物。靶動物的代謝研究：新藥應(yīng)能提供靶動物按要求的最大使用劑量給藥后可食組織中化合物的代謝命運方面的資料。已發(fā)表的文獻常常包含密切相關(guān)化合物代謝的資料。這些資料很有參考價值，但是通常不能代替受試化合物在靶動物體內(nèi)代謝過程方面的試驗觀測。代謝研究可使用總殘留清除研究采集的組織。如果組