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認(rèn)證信息

認(rèn)證類(lèi)型：個(gè)人認(rèn)證

認(rèn)證主體：羅**（實(shí)名認(rèn)證）

IP屬地：廣西

IP屬地：廣西 上傳時(shí)間：2023-12-11 格式：DOC 頁(yè)數(shù)：9 大?。?1KB 積分：12 舉報(bào) 版權(quán)申訴

基因定點(diǎn)突變?nèi)ヂ砸?、定點(diǎn)突變的目的把目的基因上面的一個(gè)堿基換成另外一個(gè)堿基。二、定點(diǎn)突變的原理定點(diǎn)突變是指通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒错憽睵CR〕等方法向目的DNA片段〔可以是基因組，也可以是質(zhì)粒〕中引入所需變化〔通常是表征有利方向的變化〕，包括堿基的添加、刪除、點(diǎn)突變等。定點(diǎn)突變能迅速、高效的提高DNA所表達(dá)的目的蛋白的性狀及表征，是基因研究工作中一種非常有用的手段。體外定點(diǎn)突變技術(shù)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復(fù)雜關(guān)系的有力工具，也是實(shí)驗(yàn)室中改造/優(yōu)化基因常用的手段。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能，二者之間的關(guān)系是蛋白質(zhì)組研究的重點(diǎn)之一。對(duì)某個(gè)基因的特定堿基進(jìn)行定點(diǎn)改變、缺失或者插入，可以改變對(duì)應(yīng)的氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，對(duì)突變基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行研究有助于人類(lèi)了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，探討蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)/結(jié)構(gòu)域。而利用定點(diǎn)突變技術(shù)改造基因：比方野生型的綠色熒光蛋白〔wtGFP〕是在紫外光激發(fā)下能夠發(fā)出微弱的綠色熒光，經(jīng)過(guò)對(duì)其發(fā)光結(jié)構(gòu)域的特定氨基酸定點(diǎn)改造，現(xiàn)在的GFP能在可見(jiàn)光的波長(zhǎng)范圍被激發(fā)〔吸收區(qū)紅移〕，而且發(fā)光強(qiáng)度比原來(lái)強(qiáng)上百倍，甚至還出現(xiàn)了黃色熒光蛋白，藍(lán)色熒光蛋白等等。定點(diǎn)突變技術(shù)的潛在應(yīng)用領(lǐng)域很廣，比方研究蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)、改造酶的不同活性或者動(dòng)力學(xué)特性，改造啟動(dòng)子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是穩(wěn)定性、活性、研究蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，以及藥物研發(fā)、基因治療等等方面。通過(guò)設(shè)計(jì)引物，并利用PCR將模板擴(kuò)增出來(lái)，然后去掉模板，剩下來(lái)的就是我們的PCR產(chǎn)物，在PCR產(chǎn)物上就已經(jīng)把這個(gè)點(diǎn)變過(guò)來(lái)了，然后再轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆，再測(cè)序確定就行了。三、引物設(shè)計(jì)原那么引物設(shè)計(jì)的一般原那么不再重復(fù)。突變引物設(shè)計(jì)的特殊原那么：〔1〕通常引物長(zhǎng)度為25~45bp，我們建議引物長(zhǎng)度為30~35bp。一般都是以要突變的堿基為中心，加上兩邊的一段序列，兩邊長(zhǎng)度至少為11-12bp。假設(shè)兩邊引物太短了，很可能會(huì)造成突變實(shí)驗(yàn)失敗，因?yàn)橐镏辽僖?1-12個(gè)bp才能與模板搭上，而這種突變PCR要求兩邊都能與引物搭上，所以?xún)蛇呑詈酶髟O(shè)至少12個(gè)bp，并且合成多一條反向互補(bǔ)的引物?！?〕如果設(shè)定的引物長(zhǎng)度為30bp，接下來(lái)需要計(jì)算引物的Tm值，看是否到達(dá)78℃〔GC含量應(yīng)大于40%〔3〕如果Tm值低于78℃，那么適當(dāng)改變引物的長(zhǎng)度以使其Tm值到達(dá)78℃〔GC含量應(yīng)大于〔4〕設(shè)計(jì)上下游引物時(shí)確保突變點(diǎn)在引物的中央位置?！?〕最好使用經(jīng)過(guò)純化的引物。

Tm值計(jì)算公式：Tm=0.41×(%ofGC)–675/L+81.5注：L：引物堿基數(shù)；%ofGC：引物GC含量。四、引物設(shè)計(jì)實(shí)例以GCG→ACG為例：5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’〔1〕首先設(shè)計(jì)30bp長(zhǎng)的上下游引物，并將A(T)設(shè)計(jì)在引物的中央位置。Primer#1:5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’Primer#2:5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’〔2〕引物GC含量為40%，L為30，將這兩個(gè)數(shù)值帶入Tm值計(jì)算公式，得到其Tm=75.5〔Tm=0.41×40-675/30+81.5〕。通過(guò)計(jì)算可以看出其Tm低于78℃，這樣的引物是不適宜的，所以必須調(diào)整引物長(zhǎng)度?！?〕重新調(diào)整引物長(zhǎng)度。Primer#1:5’-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3’Primer#2:5’-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3’在引物兩端加5mer〔斜體下劃線(xiàn)處〕，這樣引物的GC含量為45.7%，L值為35，將這兩個(gè)數(shù)值帶入Tm值計(jì)算公式，得到其Tm為80.952〔Tm=0.41×47.5-675/35+81.5〕，這樣的引物就可以用于突變實(shí)驗(yàn)了。五、突變所用聚合酶及Buffer引物和質(zhì)粒都準(zhǔn)備好后，當(dāng)然就是做PCR嘍，不過(guò)對(duì)于PCR的酶和buffer，不能用平時(shí)的，我們做PCR把整個(gè)質(zhì)粒擴(kuò)出來(lái)，延伸長(zhǎng)度到達(dá)幾個(gè)K，所以要用那些GCbuffer或擴(kuò)增長(zhǎng)片段的buffer，另外，要用保真性能較好的PFU酶來(lái)擴(kuò)增，防止引進(jìn)新的突變。除了使用基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖校鏢tratagene和塞百盛的試劑盒，但價(jià)格昂貴?？梢允褂酶弑Ｕ娴木酆厦?，如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTARTMHSDNApolymerase。六、如何去掉PCR產(chǎn)物最簡(jiǎn)單的方法就是用DpnI酶，DpnI能夠識(shí)別甲基化位點(diǎn)并將其酶切，我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質(zhì)粒，從大腸桿菌里提出來(lái)的質(zhì)粒一般都被甲基化保護(hù)起來(lái)〔除非你用的是甲基化缺陷型的菌株〕，而PCR產(chǎn)物都是沒(méi)有甲基化的，所以DpnI酶能夠特異性地切割模板〔質(zhì)?！扯粫?huì)影響PCR產(chǎn)物，從而去掉模板留下PCR產(chǎn)物，所以提質(zhì)粒時(shí)那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。DpnI處理的時(shí)間最好長(zhǎng)一點(diǎn)，最少一個(gè)小時(shí)吧，最好能有兩三個(gè)小時(shí)，因?yàn)槿绻０逄幚淼貌桓蓛?，哪怕只有那么一點(diǎn)點(diǎn)，模板直接在平板上長(zhǎng)出來(lái)，就會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。七、如何拿到質(zhì)粒直接把通過(guò)DpnI處理的PCR產(chǎn)物拿去做轉(zhuǎn)化就行了，然后再篩選出陽(yáng)性克隆，并提出質(zhì)粒，拿去測(cè)序，驗(yàn)證突變結(jié)果。八、圖示八、定點(diǎn)突變操作步驟[A]誘導(dǎo)突變基因〔PCR反響〕以待突變的質(zhì)粒為模板，用設(shè)計(jì)的引物及Muta-direct?酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增反響，誘導(dǎo)目的基因突變。1.設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物。[注]參考引物設(shè)計(jì)指導(dǎo)2.準(zhǔn)備模板質(zhì)粒DNA[注]用dam+型菌株〔例如DH5α菌株〕作為宿主菌。在end+型菌株中常有克隆數(shù)低的現(xiàn)象，但是對(duì)突變效率沒(méi)有影響。提取質(zhì)粒DNA時(shí)我們建議您使用本公司的質(zhì)粒提純?cè)噭┖小?.[選項(xiàng)]對(duì)照反響體系〔50μl反響體系〕10×ReactionBuffer5μlpUC18controlplasmid〔10ng/μl，total20ng〕2μlControlprimermix〔20pmol/μl〕2μldNTPmixture〔each2.5mM〕2μldH2O38μlMuta-direct?Enzyme1μl4.樣品反響體系〔50μl反響體系〕10×ReactionBuffer5μlSampleplasmid〔10ng/μl，total20ng〕

2μlSampleprimer(F)〔10pmol/μl〕1μlSampleprimer(R)〔10pmol/μl〕1μldNTPmixture〔each2.5mM〕2μldH2O38μlMuta-direct?Enzyme1μl5.PCR反響條件[注]按如下參數(shù)設(shè)置PCR擴(kuò)增條件。CyclesTemperatureReactionTime1cycle95℃30sec15cycle9530sec551min721minperplasmidKb6.PCR擴(kuò)增反響完成后冰育5分鐘，然后置于室溫〔防止反復(fù)凍融〕。[注]按以下提供的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，控制PCR循環(huán)數(shù)。注意當(dāng)突變點(diǎn)位點(diǎn)超過(guò)4個(gè)時(shí)會(huì)發(fā)生突變率降低的現(xiàn)象。MutationCycles1~2Nucleotide15cycles3Nucleotides18cycles[B]突變質(zhì)粒選擇PCR反響結(jié)束后使用Mutazyme?酶消化甲基化質(zhì)粒從而選擇突變質(zhì)粒DNA。1.準(zhǔn)備PCR反響產(chǎn)物2.參加1μl〔10U/μl〕Mutazyme?酶37℃溫育1[注]當(dāng)質(zhì)粒DNA用量過(guò)多時(shí)Mutazyme?酶可能發(fā)生與樣品反響不完全的現(xiàn)象。因此我們建議為了保證突變率請(qǐng)嚴(yán)格遵照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作。如果突變率低，可以適當(dāng)延長(zhǎng)反響時(shí)間或增加Mutazyme?酶用量。[C]轉(zhuǎn)化反響完畢后在質(zhì)粒DNA上會(huì)產(chǎn)生缺口，當(dāng)把這個(gè)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入E.coli中時(shí)請(qǐng)選擇dam+型菌株，例如DH5α。1.將10μl樣品加到50μl感受態(tài)細(xì)胞里，然后放置在冰上30分鐘。2.接下來(lái)可以參照一般的轉(zhuǎn)化步驟進(jìn)行。序列分析通常當(dāng)LB平板上出白色菌落那么說(shuō)明發(fā)生了突變。為了證實(shí)這一結(jié)果，我們建議對(duì)白色單菌落進(jìn)行測(cè)序分析。先講最簡(jiǎn)單的一個(gè)點(diǎn)的定點(diǎn)突變技術(shù)，其它較長(zhǎng)片段的突變，刪除，插入技術(shù)以后會(huì)慢慢奉上：在做實(shí)驗(yàn)之前，我們首先要搞清楚實(shí)驗(yàn)的目的和實(shí)驗(yàn)的原理。

實(shí)驗(yàn)的目的應(yīng)該比擬明確吧：就是要把自己的基因上面的一個(gè)堿基換成另外一個(gè)堿基。一般情況下我們會(huì)有幾種可能使我們需要這樣去做：

第一：我們吊出來(lái)的基因有點(diǎn)突變，相信這可能是大家經(jīng)常會(huì)遇到的問(wèn)題。基因好不容易吊出來(lái)，并裝進(jìn)了自己的載體，卻發(fā)現(xiàn)有一兩個(gè)堿基跟自己的預(yù)期序列或所有的公共數(shù)據(jù)庫(kù)不匹配，然后暴昏。

大家實(shí)驗(yàn)室里面還是用Taq酶為主吧，Pfu這樣的高保真酶大家應(yīng)該用得不多吧，Taq酶的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)都很明顯：優(yōu)點(diǎn)就是擴(kuò)增效能強(qiáng)，缺點(diǎn)就是保真性差，其錯(cuò)配機(jī)率是比擬高的，相關(guān)數(shù)字忘了，大家可以去網(wǎng)上查那個(gè)數(shù)字，不過(guò)感覺(jué)如果是2000bp的基因，如果擴(kuò)四五十個(gè)循環(huán)的話(huà)，很大機(jī)率會(huì)出現(xiàn)點(diǎn)突變，當(dāng)然這也跟具體PCR體系里的Buffer有很大關(guān)系，詳細(xì)情況這里就不討論了。

第二：要研究基因的功能，在基因上自己選定位置更換堿基的保守序列，或者改造成不同的亞型，總之就是要人工改造堿基序列符合自己的實(shí)驗(yàn)需要，相信這也是那些研究基因的人經(jīng)常的一種思路吧。對(duì)于第一種情況：我們首先要分析出現(xiàn)堿基不匹配的位置是不是重要的位置，如果不是很重要，大可不必管它，比方說(shuō)是三聯(lián)密碼子的最后一位，堿基的改變并沒(méi)有引起相應(yīng)氨基酸的改變，那么一般情況下也可以不去理它。另外，在NCBI上人類(lèi)的基因的版本一直在變化，也就是說(shuō)同一個(gè)基因有不同的版本，或者稱(chēng)不同的亞型，其堿基序列有些許的差異，只要自己克隆出來(lái)的堿基序列與其中一個(gè)相匹配，一般也就可以不做定點(diǎn)突變了。如果有時(shí)間沒(méi)錢(qián)，那干脆重新PCR然后再克隆進(jìn)自己的載體了，不過(guò)最好換個(gè)保真性好一點(diǎn)的酶如PFU，或者PCR循環(huán)數(shù)低一點(diǎn)，不過(guò)這些東西有時(shí)候也得靠運(yùn)氣啦。實(shí)在不行的話(huà)再來(lái)做定點(diǎn)突變。

對(duì)于第二種情況：這種情況下一般也就只能做定點(diǎn)突變了。接下來(lái)開(kāi)始聊一聊定點(diǎn)突變的原理吧，那個(gè)Stratagene試劑盒！上面有一個(gè)說(shuō)明書(shū)，說(shuō)得好似很正規(guī)，不過(guò)上面好多都是什么專(zhuān)利啊什么注意之類(lèi)的話(huà)，看都不看，我們簡(jiǎn)明扼要地只講實(shí)驗(yàn)方面，通過(guò)設(shè)計(jì)引物，并利用PCR將模板擴(kuò)增出來(lái)，然后去掉模板，剩下來(lái)的就是我們的PCR產(chǎn)物，在PCR產(chǎn)物上就已經(jīng)把這個(gè)點(diǎn)變過(guò)來(lái)了，然后再轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆，再測(cè)序確定就行了。

大家馬上就會(huì)想到幾個(gè)問(wèn)題了：

第一：引物怎么設(shè)計(jì)呢？

第二：模板怎么去掉呢？

第三：怎么拿到質(zhì)粒呢？對(duì)于第一個(gè)問(wèn)題：怎么設(shè)計(jì)引物？

我只能講一些原那么，并舉一些例子。

引物設(shè)計(jì)的原那么其它貼子上都有講，這里就不重復(fù)了：

不過(guò)這種突變引物要加上一個(gè)原那么：

一般都是以要突變的堿基為中心，加上兩邊的一段序列，兩邊長(zhǎng)度至少為11-12basepair。

假設(shè)兩邊引物太短了，很可能會(huì)造成突變實(shí)驗(yàn)失敗，大家應(yīng)該都知道，引物至少要11-12個(gè)basepair才能與模板搭上，而這種突變PCR要求兩邊都能與引物搭上，所以?xún)蛇呑詈酶髟O(shè)至少12個(gè)basepair，并且合成多一條反向互補(bǔ)的引物。

這么說(shuō)大家可能不是很清楚，那我就舉個(gè)例子吧：

X71661.1TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG960

現(xiàn)有序列TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG924

***********************************************************

|----deletion

X71661.1AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT1020

現(xiàn)有序列AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT984〔上面為目的序列，下面為現(xiàn)有序列：我們發(fā)現(xiàn)有一個(gè)A堿基的缺失，其直接結(jié)果是在表達(dá)蛋白時(shí)后面的氨基酸全部錯(cuò)配〕我們以它為中心設(shè)計(jì)引物：兩邊各至少12個(gè)堿基，左邊由于含有較多的A造成引物GC%含量過(guò)低，故拉長(zhǎng)引物使GC%含量不至過(guò)低，也使引物退火溫度升高。故合成引物CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG

并合成反向互補(bǔ)引物CTTCTGGAATTCCTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG

其實(shí)也不一定要反向互補(bǔ)序列，只要反向引物也是兩邊都有大于12個(gè)堿基，同時(shí)符合引物設(shè)計(jì)的原那么就行了。

引物合成公司有很多家，大家可以去尋找，不同廠家的引物在價(jià)錢(qián)質(zhì)量上有一些差異，不過(guò)價(jià)錢(qián)一般都是一塊多一個(gè)堿基，合成時(shí)間約為一周。

這樣的結(jié)果是PCR時(shí)把整個(gè)質(zhì)粒都給擴(kuò)出來(lái)了，得到的PCR產(chǎn)物是一條鏈完整，另一鏈有缺刻的PCR產(chǎn)物對(duì)于第二個(gè)問(wèn)題：

怎么去掉模板呢？再簡(jiǎn)單的方法就是用DpnI酶，DpnI能夠識(shí)別甲基化位點(diǎn)并將其酶切，我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質(zhì)粒，從大腸桿菌里提出來(lái)的質(zhì)粒一般都被甲基化保護(hù)起來(lái)〔除非你用的是甲基化缺陷型的菌株〕，而PCR產(chǎn)物都是沒(méi)有甲基化的，所以DpnI酶能夠特異性地切割模板〔質(zhì)粒〕而不會(huì)影響PCR產(chǎn)物，從而去掉模板留下PCR產(chǎn)物，所以提質(zhì)粒時(shí)那些菌株一定不能是甲基化缺陷株，不會(huì)那么湊巧吧，哈哈。關(guān)于第三個(gè)問(wèn)題：

直接把通過(guò)DpnI處理的PCR產(chǎn)物拿去做轉(zhuǎn)化就行了，呵呵，然后再篩選出陽(yáng)性克隆，并提出質(zhì)粒，拿去測(cè)序〔這個(gè)就不用我多說(shuō)了吧〕，驗(yàn)證突變結(jié)果，一般都沒(méi)問(wèn)題的啦，我做了幾十個(gè)突變了，到目前為止還沒(méi)有做不出來(lái)的，呵呵，不要砸我啊。下面講一下具體的實(shí)驗(yàn)步驟以及一些實(shí)驗(yàn)中要注意的事情：

1、根據(jù)現(xiàn)有基因設(shè)計(jì)引物；

2、合成引物并準(zhǔn)備好模板；

3、PCR，

4、DpnI處理酶切產(chǎn)物；

5、轉(zhuǎn)化酶切產(chǎn)物；

6、篩選陽(yáng)性克隆；

7、送測(cè)序并測(cè)全長(zhǎng)。

最后就是慶祝啦，呵呵，沒(méi)什么復(fù)雜的。引物和質(zhì)粒都準(zhǔn)備好后，當(dāng)然就是做PCR嘍，不過(guò)對(duì)于PCR的酶和buffer，不能用平時(shí)的，我們做PCR把整個(gè)質(zhì)粒擴(kuò)出來(lái)，延伸長(zhǎng)度到達(dá)幾個(gè)K，所以要用那些GCbuffer或擴(kuò)增長(zhǎng)片段的buffer，另外，要用保真性能較好的PFU酶來(lái)擴(kuò)增，防止引進(jìn)新的突變。

那種Quickchange試劑盒分為幾種不同的類(lèi)型

什么QuikChange?Site-DirectedMutagenesisKit標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)突變?cè)噭┖?、QuikChange?XLSite-DirectedMutagenesisKit長(zhǎng)模板單點(diǎn)突變?cè)噭┖小?gt;8kb〕從原理上是一樣的，只是PCR的酶和BUFFER不一樣，后面用了比擬適合長(zhǎng)片段擴(kuò)增的酶和BUFFER罷了，沒(méi)什么特別的東西。另外，DpnI處理的時(shí)間最好長(zhǎng)一點(diǎn)，最少一個(gè)小時(shí)吧，最好能有兩三個(gè)小時(shí)，因?yàn)槿绻０逄幚淼貌桓蓛?，哪怕只有那么一點(diǎn)點(diǎn)，模板直接在平板上長(zhǎng)出來(lái)，就會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。實(shí)驗(yàn)板長(zhǎng)出來(lái)的菌有兩種可能

一種是質(zhì)粒DPNI沒(méi)處理干凈長(zhǎng)出來(lái)的〔模板〕，一種是PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化出來(lái)的

〔突變體〕

不過(guò)這兩種菌長(zhǎng)得一模一樣^_^，即使提出質(zhì)粒來(lái)也是一樣〔酶切和PCR都無(wú)法區(qū)分〕，除了測(cè)序，是分不出來(lái)的，

做PCR時(shí)也最好做一個(gè)負(fù)對(duì)照〔不加引物〕，

實(shí)驗(yàn)管由于PCR時(shí)有引物，所以在DNPI處理前里面既含有模板又含有PCR產(chǎn)物，而對(duì)照管由于PCR時(shí)沒(méi)放引物，所以在DPNI處理前里面只有模板。

如果兩者都拿去DNPI處理

就能夠證明模板已經(jīng)被去除干凈。

假設(shè)實(shí)驗(yàn)順利的話(huà)應(yīng)該是：正對(duì)照長(zhǎng)菌負(fù)對(duì)照不長(zhǎng)菌。

如果出現(xiàn)正負(fù)對(duì)照都長(zhǎng)菌，那么就是DpnI沒(méi)處理好，

如果正負(fù)對(duì)照都不長(zhǎng)菌，那么有兩種可能，一種是PCR陰性，也就是說(shuō)PCR出問(wèn)題了，另外一個(gè)可能就是轉(zhuǎn)化出問(wèn)題了。要搞清楚是哪個(gè)問(wèn)題，跑膠說(shuō)明不了問(wèn)題，那就做個(gè)轉(zhuǎn)化的對(duì)照，拿試劑盒的對(duì)照實(shí)驗(yàn)去試感受態(tài)，馬上就能知道轉(zhuǎn)化有沒(méi)問(wèn)題。

如果正對(duì)照很多菌，負(fù)對(duì)照有幾個(gè)菌，那么就是DPNI處理得不干凈，這個(gè)時(shí)候就得靠運(yùn)氣了^_^大家有什么問(wèn)題我們可以繼續(xù)討論。另外，如果大家既沒(méi)有DpnI酶也沒(méi)有好的PCR酶和BUFFER的話(huà)，那也有其它方法進(jìn)行定點(diǎn)突變，只是麻煩一點(diǎn)，如果大家有需要的話(huà)，我會(huì)把方法貼上來(lái)。

對(duì)于多點(diǎn)突變技術(shù)及較長(zhǎng)片段的缺失插入技術(shù)，同樣的，如果大家有需要的話(huà)，我會(huì)把方法貼上來(lái)。

不過(guò)，如果你有錢(qián)的話(huà)，那就去買(mǎi)那個(gè)試劑盒吧，其中QuikChange?Site-DirectedMutagenesisKit標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)突變?cè)噭┖?、QuikChange?XLSite-DirectedMutagenesisKit長(zhǎng)模板單點(diǎn)突變?cè)噭┖小?gt;8kb〕的原理我上面已經(jīng)說(shuō)了，只是補(bǔ)充了一些我認(rèn)為的考前須知。如果你更有錢(qián)的話(huà)，那么你可以叫其它公司幫你做定點(diǎn)突變效勞，大約是改一個(gè)點(diǎn)1000元左右。如果有需要我可以提供公司的聯(lián)系方式。

下面我以一個(gè)例子為例來(lái)講100個(gè)bp以下的堿基插入缺失或者改變實(shí)驗(yàn)方案。其實(shí)這種方案并不是那么好的，只不過(guò)考慮到大家一般都沒(méi)有TYPEII限制性?xún)?nèi)切酶或者UDGandNTHIII〔另外兩種方法〕，所以才打算先介紹這種方法。

首先先說(shuō)明一點(diǎn)，這種方法在原理上存在一定成功機(jī)率，也就是說(shuō)有運(yùn)氣成分。而定點(diǎn)突變那么一般都是百分之百成功的，而這種100bp以下的插入缺失或者堿基改變可能要測(cè)幾個(gè)克隆才能挑到一個(gè)好的克隆，大家如果要用請(qǐng)慎重考慮。

同樣的，我只變那幾十個(gè)堿基，并沒(méi)有改變載體及其它地方，所以我還是依賴(lài)于DPNI酶。舉例：

HomosapiensFzE3是一個(gè)人類(lèi)基因，其含有32個(gè)氨基酸的信號(hào)肽MRDPGAAAPLSSLGLCALVLALLGALSAGAGA，后面是成熟肽QPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDI

AYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPC

RSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSGGPGGGPTAYP

TAPYLPDLPFTALPPGASDGRGRPAFPFSCPRQLKVPPYLGYRFLGERDCGAPCEPGRAN

GLMYFKEEERRFARLWVGVWSVLCCASTLFTVLTYLVDMRRFSYPERPIIFLSGCYFMVA

VAHVAGFLLEDRAVCVERFSDDGYRTVAQGTKKEGCTILFMVLYFFGMASSIWWVILSLT

WFLAAGMKWGHEAIEANSQYFHLAAWAVPAVKTITILAMGQVDGDLLSGVCYVGLSSVDA

LRGFVLAPLFVYLFIGTSFLLAGFVSLFRIRTIMKHDGTKTEKLEKLMVRIGVFSVLYTV

PATIVLACYFYEQAFREHWERTWLLQTCKSYAVPCPPGHFPPMSPDFTVFMIKYLMTMIV

GITTGFWIWSGKTLQSWRRFYHRLSHSSKGETAV，想在信號(hào)肽和成熟肽之間插入一個(gè)FLAG標(biāo)簽并在標(biāo)簽前面加上一個(gè)Leucine。即在信號(hào)肽和成熟肽之間插入一段序列：TTAATGGACTACAAAGACGATGACGACAAG〔一共三十個(gè)bp〕、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

信號(hào)肽：

ATGCGGGACCCCGGCGCGGCCGTTCCGCTTTCGTCCCTGGGCTTCTGTGCCCTGGTGCTG

GCGCTGCTGGGCGCACTGTCCGCGGGCGCCGGGGCG

成熟肽：

CAGCCGTACCACGGAGAGAAGGGC

ATCTCCGTGCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATC

GCCTACAACCAGACCATCCTGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAAGAGGACGCGGGC

CTCGAGGTGCACCAGTTCTACCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGTTCTCCCGAACTCCGCTTT

TTCTTATGCTCCATGTATGCGCCCGTGTGCACCGTGCTCGATCAGGCCATCCCGCCGTGT

CGTTCTCTGTGCGAGCGCGCCCGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTC

CAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGAACTTCCCGGTGCACGGTGCGGGCGAGATCTGC

GTGGGCCAGAACACGTCGGACGGCTCCGGGGGCCCAGGCGGCGGGCCCACTGCCTACCCT

ACCGCGCCCTACCTGCCGGACCTGCCCTTCACCGCGCTGCCCCCGGGGGCCTCAGATGGC

AAGGGGCGTCCCGCCTTCCCCTTCTCATGCCCCCGTCAGCTCAAGGTGCCCCCGTACCTG

GGCTACCGCTTCCTGGGTGAGCGCGATTGTGGCGCCCCGTGCGAACCGGGCCGTGCCAAC

GGCCTGATGTACTTTAAGGAGGAGGAGAGGCGCTTCGCCCGCCTCTGGGTGGGCGTGTGG

TCCGTGCTGTGCTGCGCCTCGACGCTCTTTACCGTTCTCACGTACCTGGTGGACATGCGG

CGCTTCAGCTACCCAGAGCGGCCCATCATCTTCCTGTCGGGCTGCTACTTCATGGTGGCC

GTGGCGCACGTGGCCGGCTTCTTTCTAGAGGACCGCGCCGTGTGCGTGGAGCGCTTCTCG

GACGATGGCTACCGCACGGTGGCGCAGGGCACCAAGAAAGAGGGCTGCACCATCCTCTTC

ATGGTGCTCTACTTCTTCGGCATGGCCAGCTCCATCTGGTGGGTCATTCTGTCTCTCACT

TGGTTCCTGGCGGCCGGCATGAAATGGGGCCACGAAGCCATCGAGGCCAACTCGCAGTAC

TTCCACCTGGCCGCGTGGGCCGTGCCCGCCGTCAAGACCATCACTATCCTGGCCATGGGC

CAGGTAGACGGGGACCTGCTGAACGGGGTGTGCTACGTTGGCTTCTCCAGTGTGGACGCG

CTGCGGGGCTTCGTGCTGGCGCCTCTGTTCGTCTACTTCTTCATAGGCACGTCCTTCTTG

CTGGCCGGCTTCGTGTCCTTCTTCCGTATCCGCACCATCATGAAACACGACGGCACCAAG

ACCGAGAAGCTGGAGAAGCTCATGGTGCGCATCGGCGTCTTCAGCGTGCTCTACACAGTG

CCCGCCACCATCGTCCTGGCCTGCTACTTCTACGAGCAGGCCTTCCGCGAGCACTGGGAG

CGCACCTGGCTCCTGCAGACGTGCAAGAGCTATGCCGTGCCCTGCCCGCCCGGCCACTTC

CCGCCCATGAGCCCCGACTTCACCGTCTTCATGATCAAGTGCCTGATGACCATGATCGTC

GGCATCACCACTGGCTTCTGGATCTGGTCGGGCAAGACCCTGCAGTCGTGGCGCCGCTTC

TACCACAGACTTAGCCACAGCAGCAAGGGAGAGACCGCGGTATGA插入序列

TTAATGGACTACAAAGACGATGACGACAAG

通過(guò)引物3端大于或等于18個(gè)堿基的匹配使引物與模板質(zhì)粒搭配，再通過(guò)引物5端的序列來(lái)補(bǔ)上那三十個(gè)堿基，先用PNK酶把引物磷酸化，再用下面這兩條引物把整個(gè)質(zhì)粒給擴(kuò)增出來(lái)，上游和下游引物就剛好把那三十個(gè)堿基給補(bǔ)上了，再參照引物的設(shè)計(jì)原那么做一些潤(rùn)色，細(xì)心的朋友可以具體分析一下這兩條引物。擴(kuò)出來(lái)后再用DPNI酶把模板質(zhì)粒去掉，再用連接酶把PCR產(chǎn)物的兩端連接起來(lái)〔雖然是平端連接，可是由于是同一條PCR產(chǎn)物的兩端連接，效率會(huì)很高〕，轉(zhuǎn)化后，測(cè)序驗(yàn)證，OK。

設(shè)計(jì)引物

forwardprimer:GGACTACAAAGACGATGACGACAAGCAGCCGTACCACGGAGAGAAG

88.5

reserveprimer:ATTAACGCCCCGGCGCCCGCGGACAGT

86.9

但是由于引物的合成是由3端向5端合成，而且每合成多一個(gè)堿基的效率最多也是百分之九十九點(diǎn)幾而不是百分之一百，所以我們拿到手的引物其實(shí)是一個(gè)混合物，比方說(shuō)我們合成一條長(zhǎng)二十個(gè)堿基的引物，實(shí)際上拿到手的是一個(gè)混合物，里面即含有二十個(gè)堿基的引物，也含有一定比率的十九個(gè)、十八個(gè)、十七個(gè)……堿基的引物。

所以我們用這種方法做PCR時(shí)，如果連上的是足額長(zhǎng)度的引物，那么實(shí)驗(yàn)也就成功了，如果連上的是少一兩個(gè)堿基的引物，那么實(shí)驗(yàn)就失敗了，不過(guò)引物當(dāng)中主要的仍是足額長(zhǎng)度的引物，所以成功機(jī)率還是蠻高的。不過(guò)送測(cè)序時(shí)就要做好準(zhǔn)備，可能要測(cè)三五個(gè)才能拿到