登革病毒感染小鼠模型的構(gòu)建

登革病毒感染小鼠模型的構(gòu)建

病毒是黃病毒屬的成員。這是一個有膜的單帶病毒。它傳播到埃及和白紋病毒。它在亞熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛流行，沒有得到有效控制。目前登革熱在非洲、美洲、東地中海、東南亞和西太平洋地區(qū)100多個國家呈地方性流行,東南亞和西太平洋地區(qū)受登革病毒影響尤為嚴重。DV有4種血清型(DV1—4),可引起登革熱、登革出血熱和登革熱出血綜合征,致病機制尚未闡明,缺乏合適的動物模型是主要原因之一。最近幾十年登革病毒感染病例數(shù)大幅上升,WHO估計每年全球約有5000萬登革病毒感染者,其中50萬人需住院治療,約2.5%死亡。研究人員正在努力構(gòu)建登革病毒感染動物模型,用于登革病毒的致病機理、免疫機制、藥物檢測和疫苗評價研究。1可用于疾病親屬和疾病原因的動物模型研究1.1登革病毒的復(fù)制位點登革病毒感染及病情嚴重程度受多種因素的影響:(1)宿主,包括遺傳的因素;(2)病毒的特征,包括毒力和細胞嗜性;(3)免疫反應(yīng),包括免疫保護作用和免疫增強效應(yīng)。利用針對非結(jié)構(gòu)蛋白NS3的抗體識別正在復(fù)制的登革病毒所在的細胞可確定登革病毒的親嗜性。已在人體尸檢標本中發(fā)現(xiàn)脾和淋巴結(jié)的巨噬細胞和樹突細胞均被感染。與之類似,在小鼠的脾、淋巴結(jié)和骨髓中的吞噬細胞中都檢測到了NS3蛋白。在病毒擴散至全身前,這些細胞會轉(zhuǎn)移到登革病毒復(fù)制的淋巴結(jié)內(nèi),并發(fā)現(xiàn)有骨髓中的骨髓細胞和肝細胞被感染的現(xiàn)象。在登革病毒抗體依賴增強效應(yīng)(ADE)小鼠模型中,還發(fā)現(xiàn)登革病毒可在肝竇內(nèi)皮細胞中復(fù)制。然而,人類感染登革病毒后是否也會出現(xiàn)同樣的情況,還有待于進一步的研究。登革熱的臨床癥狀包括發(fā)熱、皮疹、血小板減少(血小板計數(shù)≤100000個/mm3)、肝中的酶數(shù)量上升、出血和血漿滲出。血小板減少是感染登革病毒后最重要的癥狀之一,可見于病程的各個階段,當血小板計數(shù)低于50000個/mm3,可認為是出現(xiàn)重癥的前兆。嚴重的血小板減少可與血管滲漏綜合征有關(guān),其原因包括:血小板相關(guān)IgG即抗血小板抗體引起的自身免疫,最終導(dǎo)致血栓性毛細血管病;彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC);骨髓抑制,從而誘導(dǎo)早期的后發(fā)感染、前期的發(fā)熱和退燒后的噬紅細胞現(xiàn)象。血管損傷是登革病毒感染后的另一個病理表現(xiàn)。在登革出血熱患者皮膚活檢的毛細血管中,發(fā)現(xiàn)有明顯的變形和膨脹,但沒有嚴重損傷。血栓調(diào)節(jié)蛋白是內(nèi)皮損傷的重要標志,在有彌漫性血管內(nèi)凝血和登革患者體內(nèi)均會增加。而登革病毒感染能否引起彌漫性血管內(nèi)凝血仍具有爭議。另外,纖維蛋白溶解可繼發(fā)于纖溶酶原的激活,而登革病毒也被證實能直接激活纖溶酶原。此外在登革病毒感染的過程中,還發(fā)現(xiàn)了與出血癥狀有關(guān)的抗纖溶酶原抗體?？筃S1抗體可交叉激活不同的凝血分子和凝血細胞,如內(nèi)皮細胞、血小板和纖維蛋白原。血管滲漏可以導(dǎo)致低血容量性休克,而導(dǎo)致血管滲漏的原因尚不明了,伴有TNFα增加的細胞因子風暴和免疫系統(tǒng)失調(diào)都被證實與登革病毒誘導(dǎo)的血管滲透有關(guān)。糖氨基葡聚糖,如酸乙酰肝素,是一種帶負電的多糖,可讓登革病毒吸附并能在血管壁內(nèi)組成一道阻止蛋白滲漏的物理和電子屏障。多聚糖的破壞或者負電荷蛋白的中和都可能與登革病毒誘導(dǎo)的血管滲透有關(guān)。最后,血小板激活因子的激活可誘導(dǎo)增加血管的通透性?？偟膩碚f,人類感染和動物模型中的登革病毒的主要復(fù)制位點尚未明確。此外,目前還沒能建立可靠的重癥登革動物模型,但已知部分發(fā)病機制可能與血管滲漏綜合征的發(fā)展有關(guān)。1.2不同給藥劑量對登革病毒的復(fù)制效果影響研究表明蚊子每叮咬一次可傳播104~106PFU的WNV,假設(shè)登革病毒也處于相同水平,那么感染了104~106PFU登革病毒的動物相當于被蚊子叮咬一次。在皮下接種劑量為105PFU的登革病毒后,NHP可以維持病毒的復(fù)制。然而,動物體內(nèi)的登革病毒復(fù)制率遠低于人體,僅局限于淋巴組織,并伴有淋巴結(jié)病、淋巴球增多癥和白血病。另外,使用環(huán)磷酰胺可以讓登革病毒長期感染恒河猴的單核細胞,環(huán)磷酰胺是一種能影響細胞增殖和引起淋巴細胞減少的烷化劑和免疫抑制劑。在皮內(nèi)接種登革病毒后,部分恒河猴偶爾會出現(xiàn)血小板計數(shù)低的情況,但沒有其他明顯的臨床癥狀。最近發(fā)現(xiàn),靜脈內(nèi)接種猴子更高劑量的登革病毒可以引起出血和凝血障礙,感染后第3d出現(xiàn)瘀點、血腫、與DIC相關(guān)的D-二聚體的增加、凝血障礙,但沒有發(fā)熱、厭食或乏力等癥狀。因此,靜脈內(nèi)注入高劑量登革病毒的恒河猴能夠產(chǎn)生類似于人類出血熱的癥狀,并有望應(yīng)用于登革病毒感染相關(guān)凝血障礙的靶向干預(yù)治療的臨床前試驗。1.3病毒登格病毒感染小鼠模型1.3.1受試小鼠的登革病毒最初建立的登革病毒感染小鼠模型不會出現(xiàn)人類登革熱的臨床癥狀,而是發(fā)展為嗜神經(jīng)疾病,這一情況在人群中少見。包括A/J、BALB/c和C57BL/6小鼠在內(nèi)的免疫活性小鼠支持一定程度的登革病毒復(fù)制,出現(xiàn)有限的登革熱的特征性癥狀,如肝損傷、肝臟酶數(shù)量的增高、白細胞計數(shù)增加、血細胞減少以及紅細胞比容增加,A/J和BALB/c小鼠可最終死于麻痹癱瘓。有報道在高度改良的病毒毒株高劑量感染的BALB/c小鼠中可出現(xiàn)與登革出血熱相似的癥狀。在C57BL/6小鼠體表不同的四個點真皮內(nèi)注射高劑量登革病毒(3×109PFU,DENV-2strain16681),可觀察到出血癥狀,且小鼠內(nèi)皮細胞可感染登革病毒。感染了高劑量登革病毒的其他免疫活性小鼠也可以發(fā)生沒有明顯癥狀的內(nèi)皮損傷以及組織出血。1.3.2ag119小鼠毒力檢測感染了登革病毒臨床分離株的AG129小鼠被誘導(dǎo)產(chǎn)生了與其他模型相似的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。然而,使用小鼠改良的DENV-2D2S10株感染AG129小鼠出現(xiàn)了血管滲漏綜合征,與人類常見的嚴重癥狀相似。毒力增強的DENV-2D2S10株在E蛋白的硫酸肝素連接域發(fā)生突變,可以降低被清除率,引起缺乏IFN-α/β受體的A129和C57/BL6小鼠致命性的疾病。隨后發(fā)現(xiàn)NS1區(qū)發(fā)生變異的DENV-D2S10的三斑純化克隆株S221可引起缺乏IFN-α/β受體的A129小鼠發(fā)病。使用高度小鼠改良的DENV-2毒株可引起B(yǎng)ALB/c小鼠出現(xiàn)了嚴重疾病的癥狀,包括肝損傷、出血癥狀和血管滲漏,但毒力增強的原因尚未闡明。最近發(fā)現(xiàn)未經(jīng)小鼠改良的登革病毒株能引起免疫功能不全小鼠嚴重疾病。腹腔注射不同劑量(102-107pfu)的DENV-2D2Y98P株(passage20),根據(jù)劑量的不同,可使AG129小鼠出現(xiàn)不同的癥狀,包括從輕度到重度的疾病,以肝的酶類增加和脾的結(jié)構(gòu)破壞為特征,但沒有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。一個在NS4B區(qū)的變異被認為是導(dǎo)致病毒毒力改變的原因。1.3.3在腫瘤細胞內(nèi)接種登革病毒SCID小鼠存在T細胞和B細胞的發(fā)育障礙,自身缺乏體液免疫和細胞免疫,可以接受異體移植,已廣泛用于病毒感染模型的研究。SCID小鼠在感染登革病毒之前,會先移植入腫瘤細胞,登革病毒就接種在這些移植的細胞里。登革病毒可以在SCID小鼠的腫瘤模型中高效復(fù)制,先主要感染移植的腫瘤細胞,然后轉(zhuǎn)移到大腦,引起麻痹癱瘓,如K562-engraftedSCID小鼠、Huh7-engraftedSCID小鼠、HepG2-engraftedSCID小鼠。因此,這一模型與登革病毒的親嗜性和致病機理研究相關(guān)性不大,但可以用于藥物及疫苗的評價。1.3.4小鼠的人體內(nèi)免疫反應(yīng)人類細胞比小鼠細胞更容易感染登革病毒,所以建立登革病毒感染小鼠模型的另一個方法是發(fā)展人源化小鼠,如在小鼠體內(nèi)移植包括CD+43等的人類源性細胞。移植腫瘤細胞到SCID小鼠體內(nèi)很容易,但是由于其固有免疫反應(yīng),包括能阻止移植造血組織的NK細胞,所以移植人類組織入小鼠是很困難的?？蓪CID小鼠先與非肥胖糖尿病(NOD)小鼠回交,再與敲除了IL2Rγ的KO小鼠回交。其中NOD小鼠的NK細胞功能缺陷,以及因C5缺乏導(dǎo)致的溶血補體反應(yīng)缺陷。這種天生缺陷與改良免疫反應(yīng)的結(jié)合讓人類的各種細胞和組織可更好地移植到小鼠體內(nèi)。NOD/SCID/IL2RγKO小鼠和人類CD+43祖細胞的重組使人類不同的細胞可以在小鼠體內(nèi)生長,包括登革病毒感染的主要靶細胞樹突細胞。登革病毒可在不同的小鼠組織中感染人類細胞,包括脾、骨髓、肝及所有與登革病毒感染臨床體征相關(guān)的組織。在感染登革病毒后,小鼠出現(xiàn)登革熱的臨床癥狀,包括發(fā)熱、紅疹和血小板減少,但還沒有出現(xiàn)更嚴重的癥狀。這些小鼠提供了研究人體內(nèi)免疫機制的可能性。目前要產(chǎn)生穩(wěn)定足量的抗體還很困難,難以將抗體產(chǎn)品化,但小鼠通常都能產(chǎn)生針對登革病毒特有的T細胞反應(yīng),使其成為研究在持續(xù)感染中T細胞交叉反應(yīng)的重要模型。相反,使用4種不同的低傳代數(shù)DENV-2或?qū)嶒炇腋牧嫉腄ENV-2感染RAG和IL2Rγ基因缺陷的RAG-hu小鼠,小鼠可出現(xiàn)發(fā)熱癥狀,但沒有其他癥狀。另外,大部分的RAG/IL2RγKO小鼠(10/16)都產(chǎn)生了抗登革病毒抗體,其中3只小鼠產(chǎn)生了中和抗體。最近,有一種新的BLT-NSG小鼠模型,它是移植有臍帶血造血干細胞的人源化NOD-scidIL2rγnull小鼠,同時移植了人類胎兒的甲狀腺和肝組織。研究發(fā)現(xiàn)在BLT-NSG小鼠的血清中登革病毒特異抗體滴度增加。另外,在急性期和記憶期由BLT-NSG小鼠的脾細胞產(chǎn)生的B淋巴細胞分泌出DNNV特異性具有中和能力的IgM抗體。BLT-NSG小鼠中的人源性T細胞分泌包括DENV肽池和HLA-A2限制肽的IFN-γ。BLT-NSG小鼠也用于研究對登革病毒疫苗的人類免疫反應(yīng)和連續(xù)登革病毒感染的初始免疫作用。2增加病毒載量流行病學研究表明重癥登革與不同血清型的DENV二次感染之間密切相關(guān)。在特定條件下,抗DENV抗體可以通過交叉反應(yīng)產(chǎn)生ADE效應(yīng),造成更嚴重的疾病。ADE效應(yīng)通過增強登革病毒對含有Fcγ受體的細胞的感染,增加病毒載量。重癥登革的免疫致病機理可能與交叉反應(yīng)的T細胞有關(guān),交叉反應(yīng)的T細胞通過參與前炎癥級聯(lián)反應(yīng),同時產(chǎn)生比同型T細胞更高水平的TNFα和IFN-γ,從而導(dǎo)致細胞因子的紊亂。盡管如此,大多數(shù)二次感染異型登革病毒的病人都表現(xiàn)為無癥狀或典型登革熱的癥狀。因此,適應(yīng)性免疫應(yīng)答不僅與免疫致病機理有關(guān),還能對機體產(chǎn)生有效的保護。造成交叉免疫保護和免疫病理損傷這兩個截然相反效應(yīng)的因素還不清楚,而這一問題也成為解決重癥登革致病機制及免疫保護機制的關(guān)鍵性問題,對完善疫苗設(shè)計有潛在的應(yīng)用價值。2.1血清型/基因型denv的同源性和免疫反應(yīng)NHP不能出現(xiàn)臨床癥狀,但能產(chǎn)生與人體內(nèi)相似的免疫應(yīng)答。人類初次感染4種血清中的任意一種皆可誘導(dǎo)廣泛的可交叉反應(yīng)的抗體和T細胞應(yīng)答,但是免疫應(yīng)答主要針對原感染的血清型。異型登革病毒感染者血清間的交叉反應(yīng)性相當普遍,尤其是在高保守的NS蛋白表位或E蛋白保守表位,但要區(qū)分不同的表位和依賴于各種血清型/基因型DENV同源性的程度。另外,NHP相繼感染異型登革病毒可以誘導(dǎo)交叉免疫應(yīng)答,但針對首次感染血清型的抗體滴度最高,與在人體和小鼠體內(nèi)觀察到的結(jié)果相似,這種現(xiàn)象被稱為“原抗原之罪”。NHP繼發(fā)感染DENV會增加出現(xiàn)病毒血癥的幾率,暗示了ADE效應(yīng)可能通過交叉反應(yīng)的抗體增加病毒載量。與之相似,在感染登革病毒之前,抗登革病毒單克隆抗體1A15被動轉(zhuǎn)移,恒河猴發(fā)生病毒血癥的幾率增加3到100倍。細胞免疫在NHP模型中并不明顯。有研究發(fā)現(xiàn)在感染登革病毒后,會出現(xiàn)T細胞的交叉反應(yīng),同時針對初次感染血清型的免疫應(yīng)答會更強,與在人體內(nèi)的情況相似。在人體內(nèi)初次感染的登革病毒可參與登革出血熱和登革休克綜合征的免疫發(fā)病機制中,低親和度的記憶T細胞會被高度激活?？偠灾?在NHP模型中可以看到病毒血癥的增加,但沒出現(xiàn)血管滲漏或與登革出血熱和登革休克綜合征類似的癥狀,因此無法將這一模型運用于致病機理及免疫病理機制的研究。2.2t細胞誘導(dǎo)的免疫致病機制對交叉反應(yīng)機制的研究:部分免疫缺陷的AG129小鼠能對登革病毒產(chǎn)生廣泛的交叉反應(yīng)和持久的抗體應(yīng)答。在小鼠模型中,相繼感染的登革病毒會引起第二次感染血清型病毒載量的減少和對抗致命性感染的機體保護。另外,已證明T細胞在保護機體方面有重要作用。對DENV-1產(chǎn)生免疫且缺乏T細胞的小鼠在二次感染DENV-2DS210后,出現(xiàn)了疾病的臨床癥狀。目前尚不能建立繼發(fā)感染登革病毒造成嚴重疾病的動物模型,但可用于研究由交叉反應(yīng)的T細胞誘導(dǎo)的免疫致病機制。利用AG129小鼠先感染DENV-1,6至8周后再感染DENV-2,建立了連續(xù)感染模型。從在ELISPOT中發(fā)現(xiàn)的DENV-1特異性細胞數(shù)目增加,以及從在二次感染DENV-2的小鼠分離出的多克隆刺激脾細胞的上清液中,發(fā)現(xiàn)抗DENV-1的親和力增加,都可證實在急性二次感染不同血清型時,DENV特異性親和力的增加是由交叉反應(yīng)的記憶B細胞介導(dǎo)的。然而,即使對DENV特異性親和力增加,對DENV特異性的中和能力是沒有增加的,中和能力可能是由幼稚B細胞介導(dǎo)的。將DENV-1免疫B細胞和T細胞轉(zhuǎn)移至已經(jīng)二次感染了DENV-2的幼鼠,發(fā)現(xiàn)死亡率降低了。缺乏T細胞的小鼠會出現(xiàn)癥狀,但二次感染DENV能痊愈。并發(fā)現(xiàn)了保護性交叉抗體是由成熟的漿細胞和記憶B細胞分泌的,且交叉反應(yīng)的B細胞和T細胞能產(chǎn)生對二次感染異種血清型DENV的保護。最近,利用C57BL/6小鼠模型發(fā)現(xiàn),T細胞的表位對免疫保護和免疫增強有著不同的作用。雖然這些小鼠模型都初步闡明了登革病毒繼發(fā)感染時交叉反應(yīng)T細胞的激活模式,但仍未真正建立重癥登革模型。因此,要構(gòu)建出支持病毒復(fù)制、自然T細胞應(yīng)答和重癥登革癥狀的小鼠模型需要更好地闡明T細胞應(yīng)答在登革病毒二次感染和血管滲漏的作用。2.2.2發(fā)病機制的可能通過被動轉(zhuǎn)運抗登革病毒單克隆抗體、交叉反應(yīng)的免疫血清或稀釋的同型血清,已經(jīng)成功在AG129小鼠和其他小鼠中建立ADE小鼠模型。用抗登革病毒血清預(yù)處理小鼠,感染低于致死量的登革病毒劑量(105PFUDENV-2D2S10i.v.)即會死亡。這一預(yù)處理可提高小鼠血清及部分組織中的病毒載量,并出現(xiàn)與登革出血熱和登革休克綜合征相似的癥狀,包括血管滲漏綜合征、血清中TNF-α和IL-10水平增加以及死亡前血小板計數(shù)偏低。在使用107PFUDENV-2D2S10的致死性模型中,同樣出現(xiàn)了上述所有癥狀,說明發(fā)病機制可能與病毒載量密切相關(guān)。高病毒載量可以通過高滴度DENV培養(yǎng)物直接注入,也可以通過ADE效應(yīng)誘導(dǎo)。值得注意的是,接受血清或抗體被動轉(zhuǎn)移的小鼠并沒有對登革病毒產(chǎn)生記憶。免疫記憶的出現(xiàn)可能會限制ADE效應(yīng)的誘導(dǎo),連續(xù)感染登革病毒的小鼠模型可用于研究記憶細胞免疫應(yīng)答下的ADE效應(yīng)。中和抗體的數(shù)量似乎對誘導(dǎo)免疫保護還是ADE效應(yīng)至關(guān)重要。最近研發(fā)了一種全新的小鼠改良毒株,該毒株可以在IFNAR1-/-小鼠(只缺乏IFN受體)中誘導(dǎo)致命的疾病。使用DENV-3感染IFNγ缺陷小鼠,小鼠會出現(xiàn)嚴重的癥狀和病毒的高水平復(fù)制,死亡率更高。研究表明,IFNγ的缺乏與一氧化氮合酶2(NOS2)的表達較少以及NOS2-/-小鼠對DENV-3感染敏感性增強有關(guān),對DENV-3的保護機制可依靠IFNγ-NOS2-NO依賴的通道來控制病毒的復(fù)制和疾病的嚴重程度。因此,DENV-3感染的免疫缺陷小鼠重癥模型也許能成為闡明疾病的免疫發(fā)病機制和保護機制的工具。2.3初次和繼發(fā)感染間隔時間的延長人體內(nèi)體液免疫的記憶應(yīng)答隨著時間的推移而減弱,而初次感染和繼發(fā)感染之間間隔時間的長短可能是發(fā)展為重癥的關(guān)鍵。由于小鼠的壽命短,小鼠模型并不是解決上述問題最理想的模型,可能NHP模型更適合這一研究。3可用于藥物治療效果評價研究的小鼠模型目前還沒有商業(yè)化抗登革病毒的特效藥物,只有輸液用于登革出血熱和登革休克綜合癥的支持治療。3.1尼姆樹胺和板栗樹精胺已經(jīng)將抗病毒候選藥物在小鼠麻痹和腦炎模型中進行了評價;但其在人群中的療效尚不確定,因為藥物在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生物學藥效反應(yīng)與在其他組織不同。尼姆樹葉的提取液可抑制病毒復(fù)制,防止受感染乳鼠出現(xiàn)臨床癥狀。栗樹精胺是一種糖苷酶抑制劑,可抑制病毒蛋白的折疊,降低病毒滴度并使A/J小鼠感染后的死亡率下降。該藥和另一種抗病毒藥物聯(lián)合應(yīng)用于感染了未改良DENV菌株(TSV01)的AG129小鼠中,可有效降低病毒載量和炎癥反應(yīng)。表明登革病毒TSV01株可用于檢驗準抗病毒藥物對病毒血癥的治療效果,并可說明聯(lián)合用藥中不同抗病毒藥物的協(xié)同作用。3.2ade效應(yīng)的檢測感染小鼠改良的DENV的AG小鼠模型可出現(xiàn)致命的血管滲漏綜合征,也被用于抗病毒的試驗。藥效指標可以是發(fā)病率、死亡率、病毒載量、血管滲漏的癥狀、血小板數(shù)量和TNFα等前炎癥因子的水平。在出現(xiàn)ADE效應(yīng)的AG129小鼠中,應(yīng)用siRNA靶向登革病毒基因組中的5’環(huán)化序列,可延長壽命并大幅度降低病毒載量。該模型產(chǎn)生的單克隆抗體無法與Fcγ受體結(jié)合,可用于研究預(yù)防和治療用藥物。因此,能出現(xiàn)與人類癥狀相似的免疫缺陷小鼠模型對抗病毒藥物的評價非常有效。4臨床前疫苗的準備登革疫苗尚未研制成功,部分處于臨床試驗的1/2階段。迄今正在研發(fā)的登革病毒疫苗有減毒活疫苗、滅活疫苗、病毒樣顆粒(VLP)以及以E蛋白、PrM蛋白、NS1蛋白為靶向的亞單位疫苗。臨床前疫苗的測試包括安全性、傳染性(指活疫苗)、免疫致病性及保護性的評估。由于NHP模型價格昂貴,通常使用小鼠模型作為疫苗臨床前研究的第一步?？偟膩碚f,免疫活性小鼠是測試疫苗免疫原性最適宜模型。4.1基于登革病毒的免疫反應(yīng)強度在乳鼠模型中,登革病毒的復(fù)制量很低,這可能會導(dǎo)致低估減毒活疫苗的免疫應(yīng)答強度。感染了登革病毒的免疫活性小鼠,不管是乳鼠還是成鼠,皆可致神經(jīng)系統(tǒng)疾病并死于麻痹癱瘓。乳鼠是個非常好的測試安全性的模型,可用于評估減毒活疫苗的潛在神經(jīng)毒力。4.2病毒登格病毒感染跳蚤模型4.4養(yǎng)疫防治模型NHP模型主要用于致病