人神經(jīng)干細胞移植對脊髓損傷大鼠后路運動功能恢復的影響

人神經(jīng)干細胞移植對脊髓損傷大鼠后路運動功能恢復的影響

隨著競技體育的發(fā)展，場上性道路事故已成為除道路事故和建筑物事故外的另一個重要因素。脊髓損傷常遺留嚴重的殘疾,約半數(shù)SCI患者出現(xiàn)四肢癱瘓,嚴重影響患者生活自理能力和生活質量。研究表明,胚胎源性干細胞移植能夠一定程度地改善脊髓損傷大鼠的后肢功能,但胚胎源性干細胞的多向分化潛能為SCI患者治療的不確定性埋下隱患。神經(jīng)干細胞(neuralstemcells,NSCs)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內新生細胞的源泉,具有向中樞神經(jīng)細胞分化的先天優(yōu)勢,在體外能分化為神經(jīng)元,為SCI的干細胞移植治療提供新的細胞來源。本實驗以人神經(jīng)干細胞(hNSCs)為研究對象,觀察hNSCs移植對胸段脊髓打擊損傷模型大鼠后肢運動功能恢復的影響,并初步探討其作用機理,為進一步采用hNSCs移植治療SCI患者的臨床研究提供實驗依據(jù)。1材料和方法1.1實驗材料1.2小鼠海馬區(qū)的dmem/fpse人神經(jīng)干細胞自孕2~3個月流產胎兒海馬區(qū)組織中分離培養(yǎng)。細胞的獲取得到當事人知情同意,并獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會許可。嚴格無菌條件下取胎齡為2~3個月的流產胎兒海馬區(qū)組織,置于含4℃磷酸緩沖液的培養(yǎng)皿中,顯微鏡下細心剝除血管和筋膜,剪碎海馬區(qū)組織,0.125%胰酶和0.04%DNaseⅠ消化20min,終止消化后,經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾制成單細胞懸液,接種到含B27、EGF、bFGF的無血清DMEM/F12的培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將培養(yǎng)12天的原代神經(jīng)球采用機械吹打,并結合酶消化制成單細胞懸液,以1×108/L細胞密度接種培養(yǎng),每2周左右傳代一次。1.3小鼠單克隆抗體hnsc的檢測Nestin細胞免疫熒光鑒定:取生長良好的人神經(jīng)干細胞接種于置有經(jīng)多聚賴氨酸處理的蓋玻片的12孔培養(yǎng)板中,待細胞在蓋玻片上貼壁3~5h后用來鑒定:PBS洗滌3次,5min/次;4%多聚甲醛固定30min,PBS洗滌3次,5min/次;3%過氧化氫室溫下浸泡10min;0.1%TritonX-100常溫下孵育10min,PBS洗滌3次,5min/次;正常山羊血清封閉液(即用型)37℃孵育30min,甩干不洗;滴加小鼠抗人Nestin單克隆抗體200μl(1∶200稀釋),4℃過夜;滴加羊抗小鼠IgG-FITC100μl(1∶500稀釋),37℃孵育30min后,熒光顯微鏡下觀察、拍照。移植前1天,機械打散呈神經(jīng)球狀懸浮生長的神經(jīng)干細胞后,將hNSC進行CM-DiI標記。標記成功后調整細胞濃度為1×1010/L保存于DMEM/F12培養(yǎng)液中準備移植。1.4髓傷模型的制作采用通用型脊髓打擊器建立大鼠脊髓損傷模型。成年雌性SD大鼠24只,10%水合氯醛3~4ml/kg腹腔內注射麻醉,背部正中切口,暴露第9~11胸椎椎板,用顯微剪將T10全椎板切除暴露脊髓。通用型脊髓打擊器10g重錘自5cm高度處自由下落,制成T10段脊髓損傷模型,打擊后脊髓即刻出血、腫脹,大鼠雙下肢抽搐,尾巴甩動,隨后完全松弛。圍手術期肌注青霉素20萬IU/kg預防感染,連續(xù)3d;并定時進行膀胱按摩,協(xié)助排便。傷后第8天隨機分為移植組和對照組,每組12只。脊髓損傷后1周內2只動物死亡,移植后3只動物死亡。移植組10只、對照組9只進入結果分析。1.5cmdii標記的人神經(jīng)干細胞懸液的注入脊髓損傷后第8天,移植組大鼠沿原手術切口暴露損傷脊髓,將采用CM-DiI標記的人神經(jīng)干細胞懸液5μl直接用微量注射器多點緩慢注入到脊髓損傷處,總細胞數(shù)約5×104個。對照組則給予5μl不含細胞的DMEM/F12培養(yǎng)液。1.6運動功能評分將大鼠放入一固定場所,通過觀察大鼠后肢運動、軀干位置及穩(wěn)定性、步態(tài)協(xié)調性、爪的位置、足趾間隙及尾的位置等,采用Basso,Beattie,Bresnahan(BBB)行為功能評定量表評定大鼠的后肢運動功能。正常大鼠BBB評分為21分。脊髓損傷后1d,主要靠前肢拖著身體移動,腹部貼地,雙后肢運動功能喪失,雙足底向上呈不負重狀,大小便失禁,BBB評分為0分。分別于細胞移植當天及移植后1、2、3、4、6、8周,由兩名熟悉BBB評分標準的非本組實驗人員實行盲法評分。1.7gfap、neun、cnpase、nist的表達遷移分別于hNSCs移植后第4、8周,每組采用深部麻醉下安樂處死4只動物,于損傷中心頭尾側各1cm處切斷脊髓,迅速包埋,連續(xù)冰凍切片厚約4μm。熒光顯微鏡下觀察移植細胞的存活和遷移,以及檢測移植組織內GFAP、NeuN、CNPase、Nestin的表達。具體步驟如下:將冰凍切片室溫下干燥20min,冷丙酮固定10min后風干;3%過氧化氫溶液浸泡20min,阻斷內源性過氧化物酶;正常山羊封閉血清37℃封閉30min;滴加Nestin、NeuN、CNPase、GFAP一抗(1∶200稀釋)50μl,4℃濕盒中過夜,陰性對照以PBS代替一抗;滴加羊抗小鼠熒光二抗FITC(1∶500稀釋)50μl,37℃孵育60min;水性封片劑封片;激光共聚焦顯微鏡下觀察。余實驗動物于本實驗結束后安樂處死。1.8統(tǒng)計分析采用SSPS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析,數(shù)據(jù)以表示,組間比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1培養(yǎng)液中雜細胞的傳代自流產胎兒海馬區(qū)分離培養(yǎng)的細胞,在含bFGF、EGF、B27的無血清DMEM/F12培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2周后呈團狀,懸浮生長。原代細胞培養(yǎng)初期,見一些貼壁的雜細胞及漂浮的細胞碎片。經(jīng)傳代后,雜細胞逐漸減少甚至消失。存活的單個細胞經(jīng)分裂各自形成神經(jīng)球,大小不等,隨培養(yǎng)時間延長神經(jīng)球逐漸增大。2.2人神經(jīng)干細胞貼壁神經(jīng)球經(jīng)Nestin間接免疫熒光染色呈陽性。培養(yǎng)的人神經(jīng)干細胞加入24孔培養(yǎng)板后2h即可貼壁。CM-DiI標記的hNSCs在熒光顯微鏡下觀察,波長543nm激發(fā)光下呈紅色熒光。2.3移植后4周的bcb評分移植組BBB評分隨時間延長而增加,而且移植后各個時間點的BBB評分均高于對照組,移植后4周時,移植組BBB評分顯著高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。移植后8周時,移植組BBB評分≥15分,而對照組均≤10分,見表1。2.4hnscs的遷移熒光顯微鏡下,hNSCs移植后4、8周脊髓組織切片可見大量呈紅色熒光的CM-DiI標記的hNSCs,移植后4周可見CM-DiI標記的hNSCs主要存活于注射部位,少數(shù)向四周遷移,而移植后8周則見大部分細胞向損傷頭尾兩側遷移,最遠可遷移至距注射部位10mm處。移植后4周及8周免疫熒光染色均可見到移植的hNSCs部分表達GFAP、NeuN、CNPase(圖1C、1F、1J中黃色熒光),且在移植后8周還檢測到Nestin表達、仍保持未分化狀態(tài)的移植hNSCs(圖1M中黃色熒光)。3術后運動功能恢復促進SCI肢體運動功能恢復的關鍵在于損傷脊髓的再生修復,目前中樞神經(jīng)再生機制尚未完全揭示。研究表明干細胞移植是恢復肢體功能的有效方法之一,干細胞移植修復脊髓損傷可以促進脊髓組織修復,甚至功能恢復。本實驗結果顯示,hNSCs移植后各個時間點BBB評分均高于對照組,移植后4周時,移植組大鼠后肢BBB評分顯著高于對照組,表明移植的hNSCs可促進大鼠后肢運動功能的恢復。而且hNSCs移植治療大鼠脊髓損傷4周時后肢運動功能比1周時有明顯的恢復,推測這可能與損傷脊髓處神經(jīng)的修復和再生有關。免疫熒光結果證實,hNSCs可在損傷脊髓處長時間存活至少達鼠后肢運動功能的恢復。而且hNSCs移植治療大鼠脊髓損傷4周時后肢運動功能比1周時有明顯的恢復,推測這可能與損傷脊髓處神經(jīng)的修復和再生有關。免疫熒光結果證實,hNSCs可在損傷脊髓處長時間存活至少達8周,可分化為神經(jīng)元、少突膠質細胞和星形膠質細胞,并向損傷脊髓的頭尾兩端遷移,最遠可達10mm。目前,移植細胞在受損脊髓中存活、聚集和遷移的機制尚不清楚,分析1周時起效可能與細胞開始適應脊髓微環(huán)境,分化成神經(jīng)細胞并分泌促進神經(jīng)再生的細胞因子有關,也可能與移植細胞開始向神經(jīng)環(huán)路整合作用有關,4周時后肢運動功能恢復較1周明顯,說明植入細胞能長期存活并適應機體環(huán)境,繼續(xù)促進損傷脊髓的再生修復。1.1.1實驗動物成年雌性SD大鼠24只,體重225±25g,購自南方醫(yī)科大學動物中心。1.1.2hnscs移植DMEM/F12購自Hyclone公司;B27、堿性成纖維生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)和N2購自Sigma公司;DNaseⅠ購自Roche公司;CM-DiI熒光染料購自Eugene,OR公司;小鼠抗人Nestin一抗、小鼠抗人NeuN一抗、小鼠抗人GFAP一抗、小鼠抗人CNPase一抗和羊抗小鼠IgG-FITC二抗購自abcam公司;正常山羊封閉血清購自武漢博士德公司。移植的hNSCs可以在大鼠脊髓損傷處存活、遷移,分化為神經(jīng)元、星形膠質細胞和少突膠質細胞,并能使脊髓損傷大鼠的后肢運動功能得到部分恢復,其機制可能與以下因素有關:①hNSCs填充損傷區(qū),補充損傷后缺失的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞;②分泌有益于宿主脊髓的多種神經(jīng)營養(yǎng)因子,改善脊髓局部微環(huán)境,促進軸突的功能再生;③提供化學或物理的引導,刺激脊髓神經(jīng)生長,引導損傷神經(jīng)再生