吞噬細(xì)胞nadph氧化酶的家族研究進(jìn)展

吞噬細(xì)胞nadph氧化酶的家族研究進(jìn)展

nox（nadholnime）最初發(fā)現(xiàn)于中性細(xì)胞和mcclovac細(xì)胞。當(dāng)炎癥反應(yīng)時(shí)，這兩種細(xì)胞都會發(fā)生“氧化反應(yīng)”，導(dǎo)致大量的ros，這是身體對疾病的第一個(gè)預(yù)防措施。ROS不再是有氧代謝的副產(chǎn)物,而是具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫功能、激素生物合成功能的活性產(chǎn)物。NOX和DUOX(dualoxidase)是公認(rèn)的能夠調(diào)節(jié)ROS產(chǎn)生的特殊功能酶,與吞噬細(xì)胞中NADPH氧化酶所制造的ROS不同,NOX和DUOX所產(chǎn)生的ROS不主要起細(xì)胞防御功能,而是作為第二信使,參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡的調(diào)節(jié)。NADPH氧化酶位于吞噬細(xì)胞質(zhì)膜上,帶有細(xì)胞色素C和FAD基團(tuán)。該氧化酶是由gp91phox,p22phox,p47phox,p67phox,p40phox和Rac六種亞基組成的復(fù)合體。gp91phox和p22phox亞基位于質(zhì)膜上,當(dāng)與胞漿中的另外幾種亞基結(jié)合時(shí)可形成有活性的NADPH氧化酶復(fù)合體。gp91phox是其主要的功能亞基,p22phox的C末端有一富含脯氨酸的尾巴,可能用來結(jié)合NADPH氧化酶的胞質(zhì)激活因子,從而發(fā)揮胞內(nèi)調(diào)節(jié)作用。吞噬細(xì)胞中的NADPH氧化酶通常是靜止的,當(dāng)受到胞外信息,如激素、細(xì)胞因子甚至細(xì)菌等一些物質(zhì)的刺激時(shí),胞漿中的p47phox,p67phox,p40phox和Rac通過p22phox上富含脯氨酸的尾巴與之結(jié)合形成酶復(fù)合體,這種結(jié)合能夠使gp91phox的構(gòu)像發(fā)生變化,并通過誘導(dǎo)電子的跨膜轉(zhuǎn)動激活該酶,從而發(fā)揮生物學(xué)作用。1nox家族的結(jié)構(gòu)及與nadph、fad的關(guān)系在不同種類的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一系列NADPH氧化酶催化亞基即gp91phox的同源物,分別稱其為NOX1,NOX2(gp91phox),NOX3,NOX4,NOX5,DUOX1,DUOX2,后來被命名為NOX的蛋白家族。NOX分子大致可以分為N端的疏水跨膜區(qū)和C端的黃素蛋白結(jié)合區(qū)兩個(gè)大的結(jié)構(gòu)域。黃素蛋白結(jié)合區(qū)與許多FAD結(jié)合蛋白包括細(xì)胞色素P450還原酶有微弱的同源性。NOX家族的分子量介于564至737,它們均有6個(gè)跨膜片段,一些保守的區(qū)段可能與NADPH,FAD的結(jié)合有關(guān)。NOX5的N末端有鈣結(jié)合區(qū),能使NOX5直接對鈣離子起反應(yīng)。gp91phox,NOX3和NOX4的跨膜α-螺旋靠近N端的最末端,該序列附近有蛋白水解位點(diǎn),故認(rèn)為這一段極有可能是信號肽序列。NOX5沒有末端這段信號肽,在胞質(zhì)側(cè)的N末端序列含有脯氨酸豐富區(qū)。NOX5的這一脯氨酸豐富區(qū)可能相當(dāng)于NADPH酶復(fù)合體中的p22phox,可以與胞內(nèi)能識別該區(qū)的調(diào)節(jié)蛋白相互作用,從而調(diào)節(jié)自身的活性。DUOX1蛋白和DUOX2蛋白均由3部分組成。第1部分位于胞外的N端,與Ⅰ跨膜片段相連,該部分的氨基酸序列顯示了DUOX蛋白的特異性,豬和人DUOX的N端分別有6個(gè)和5個(gè)糖基化位點(diǎn)。第2部分位于Ⅰ,Ⅱ跨膜片段之間,有2個(gè)EF手結(jié)構(gòu),是鈣離子(Ca2+)的結(jié)合位點(diǎn)。C端位于胞內(nèi),與Ⅱ到Ⅶ6個(gè)跨膜片段相連,有4個(gè)NADPH結(jié)合區(qū),1個(gè)FAD結(jié)合區(qū)。由于DUOX蛋白的C端氨基酸序列呈現(xiàn)NOX家族的特性,故將其歸為NOX家族的成員。當(dāng)位于胞內(nèi)的DUOX蛋白處于去糖基化或低糖基化狀態(tài)時(shí),不具有氧化酶活性;當(dāng)受到刺激性因子作用后,發(fā)生糖基化反應(yīng)并結(jié)合在質(zhì)膜頂部,才具有活性。2nox4在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)2.1NOX1NOX1基因位于X染色體上。NOX1至少有3種剪切變構(gòu)體(splicevariants),即NOX1α(外顯子1~13)、NOX1β(外顯子1~10,12,13)、NOX1γ(外顯子1~5,14)。選擇性的剪接掉NOX1外顯子11,則不能編碼蛋白產(chǎn)生超氧化物。NOX1主要表達(dá)在結(jié)腸,血管平滑肌中也可見到,在子宮及前列腺破骨細(xì)胞、視網(wǎng)膜的外細(xì)胞中也有微弱的表達(dá)。NOX1在胃黏膜的表達(dá)存在種屬性,在人的胃細(xì)胞中不表達(dá),而在豚鼠的胃黏膜和胃小凹細(xì)胞中表達(dá)。很多腫瘤或者轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中,都可以檢測到NOX1的表達(dá)。2.2NOX2NOX2首先在中性粒細(xì)胞和吞噬細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn),因此常被稱為吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶。NOX2在B淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中也有少量表達(dá)。在調(diào)查各個(gè)器官NOX家族亞基mRNA的組織分布時(shí)發(fā)現(xiàn)NOX2是分布最廣泛的,如胸腺、小腸、脾、胰腺、卵巢、胎盤、前列腺中均有分布。NOX2分布的廣泛性也可能是由于它們都含有表達(dá)NOX2的外周血細(xì)胞而造成的。然而,越來越多的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白表達(dá)方面的證據(jù)顯示,NOX2在非吞噬細(xì)胞內(nèi)也有表達(dá),主要包括神經(jīng)元、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞和造血系統(tǒng)的細(xì)胞。在吞噬細(xì)胞內(nèi),NOX2既存在于細(xì)胞內(nèi),也存在于胞膜。在靜息狀態(tài)的中性粒細(xì)胞內(nèi),NOX2主要定位在細(xì)胞內(nèi),當(dāng)吞噬細(xì)胞受到刺激時(shí),同吞噬小體或細(xì)胞膜發(fā)生融合,NOX2易位到細(xì)胞的表面。這種融合在NOX2殺微生物的活性中起關(guān)鍵作用。除了這種融合之外,細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS也能通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活NOX2。除了吞噬細(xì)胞以外,其他細(xì)胞分布主要是依賴其細(xì)胞類型的特異性。在平滑肌細(xì)胞中,NOX2同其核周圍的細(xì)胞骨架緊密結(jié)合。NOX2在海馬神經(jīng)元中主要位于膜的突觸部位,使它在記憶功能中起重要作用。2.3NOX3NOX3中56%的氨基酸同NOX2存在序列同源性。人類的NOX3基因位于6號染色體上。序列對比和親水性圖分析結(jié)果顯示NOX3的總體結(jié)構(gòu)同NOX1和NOX2有高度的相似性,并證明NOX3是位于內(nèi)耳的一種NADPH氧化酶。通過遺傳學(xué)研究揭示頭部傾斜的老鼠突變體潛在NOX3基因突變;因?yàn)轭^部傾斜的老鼠存在前庭功能障礙,NOX3在內(nèi)耳的作用也就被確定了。通過PCR和原位雜交分析,發(fā)現(xiàn)NOX3在內(nèi)耳高表達(dá),包括耳蝸和前庭的感覺上皮及螺旋神經(jīng)節(jié)。NOX3在其他一些組織中低表達(dá),如胎兒的脾、腎、顱骨和腦。2.4NOX4最初NOX4作為NADPH氧化酶主要在成人和胎兒的腎組織表達(dá),NOX4同NOX2的氨基酸序列有39%的同源性。NOX4主要在成年腎表達(dá),可能作為一種敏感性氧感受器,此外,NOX4mRNA亦在非吞噬型細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞)中表達(dá),而在單核細(xì)胞中表達(dá)很低。在血管細(xì)胞中,內(nèi)皮細(xì)胞主要表達(dá)NOX4,而血管平滑肌細(xì)胞主要表達(dá)NOX4和NOX1。Wingler等發(fā)現(xiàn)將1μmol/LAngⅡ與大鼠血管平滑肌細(xì)胞孵育4h,NOX1mRNA和NOX4mRNA水平分別升高4倍和6倍。免疫組織化學(xué)研究表明在人腎皮質(zhì)遠(yuǎn)端小管的上皮細(xì)胞檢測到NOX4的表達(dá)。p22phoxmRNA在腎內(nèi)大量表達(dá),p22phox蛋白定位在遠(yuǎn)端腎小管細(xì)胞,提示p22phox與NOX4之間存在聯(lián)系。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),p22phox能與異位表達(dá)的NOX4形成復(fù)合物,增加NOX4的穩(wěn)定性。盡管NOX4產(chǎn)生的量很少,但是它能增加p22phox的表達(dá),促進(jìn)依賴NOX4的ROS產(chǎn)生;相反,RNAi介導(dǎo)的敲除內(nèi)源性p22phox轉(zhuǎn)錄物導(dǎo)致NOX4活性降低。這些研究表明NOX4同p22phox形成復(fù)合物產(chǎn)生超氧化物氧化酶。p47phox和p67phox共表達(dá)在依賴NOX4產(chǎn)生ROS方面沒有任何作用。另外,Rac也不能調(diào)節(jié)NOX4的活性。異位表達(dá)的NOX4細(xì)胞,通過RNAi使Rac1不表達(dá),但并不影響腎小球膜細(xì)胞由AngⅡ誘導(dǎo)的NOX4產(chǎn)生ROS,不管是有活性還是無活性的Rac1對NOX4的活性均無影響。2.5NOX5NOX5在所有胚胎組織中均有表達(dá),在卵巢、胎盤、胰腺中微弱表達(dá)。NOX5除了含有NOX1~4的基本催化部分外,還有編碼氨基末端結(jié)構(gòu)域,包含4個(gè)EF手結(jié)構(gòu)是鈣離子結(jié)合位點(diǎn)。在NOX5轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)通過NOX5鈣依賴性產(chǎn)生ROS。鈣結(jié)合能改變EF手構(gòu)象,促使其結(jié)合催化域,從而激活從NADPH到氧的電子傳遞來形成超氧化物。在NOX5的全長結(jié)構(gòu)中沒有與p22phox形成功能性復(fù)合體的結(jié)構(gòu),因此缺乏p22phox也不影響NOX5的活性,免疫共沉淀也沒有檢測到NOX5和p22phox的復(fù)合體。最近研究發(fā)現(xiàn)卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯(phorbolmyristateacetate,PMA)激發(fā)T494磷酸化和NOX5的S498,能增加酶對鈣的敏感度,從而激活酶。2.6DUOX(dualoxidases)DUOX1和DUOX2基因定位于人類第15號染色體的長臂上。人的DUOX1和DUOX2蛋白有83%的序列相似。DUOX1和DUOX2主要在甲狀腺組織表達(dá),但在某些甲狀腺外組織如唾液腺、支氣管、肺、前列腺等也有低水平表達(dá),最近還發(fā)現(xiàn)DUOX2蛋白在整個(gè)消化道均有表達(dá)。DUOX的NADPH氧化酶部分是跨膜片段和2個(gè)EF手結(jié)構(gòu)。EF手結(jié)構(gòu)的存在表明鈣是直接調(diào)節(jié)這些酶的,與早期發(fā)現(xiàn)的鈣離子載體刺激甲狀腺細(xì)胞產(chǎn)生H2O2是相符的。在個(gè)別的哺乳動物細(xì)胞中異源性DUOX表達(dá),并不能改變ROS的釋放,說明DUOX的激活需要不同的組織特異性氧化酶成分參與。在甲狀腺濾泡中,DUOX蛋白存在于甲狀腺細(xì)胞質(zhì)膜頂部的濾泡腔,能提供甲狀腺過氧化物酶介導(dǎo)的碘化作用和甲狀腺球蛋白酪氨酸殘基交聯(lián)所需要的H2O2。DUOX2突變可導(dǎo)致先天性甲狀腺功能減退。DUOX1在甲狀腺組織中的作用還不清楚。最近提出DUOX酶在非甲狀腺組織中的宿主防御中起重要作用。在外甲狀腺組織中表達(dá)的DUOX蛋白可能參與H2O2介導(dǎo)的上皮細(xì)胞宿主防御系統(tǒng)。3ros誘導(dǎo)的erk1/2激酶信號通路對k-ras活性的影響NOX家族可以誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。目前研究最多的是絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)和酪氨酸蛋白激酶。研究顯示用H2O2處理細(xì)胞,能導(dǎo)致細(xì)胞磷酸化和p38MAPK激活。大量的證據(jù)表明通過NADPH氧化酶能激活MAPK通路。ROS引起的細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的改變可激活由MAPK家族不同成員參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,它可能是通過激活上游的ERK1/2激酶信號通路,也可能是通過ROS間接地抑制磷酸化的活性。NADPH氧化酶抑制劑和過氧化氫酶的過表達(dá)可阻斷AngⅡ參與p38MAPK磷酸化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),氧化劑可引發(fā)細(xì)胞氧化應(yīng)激,產(chǎn)生ROS,啟動酪氨酸蛋白激酶(tyrosineproteinkinase,TPK)活性。ROS能夠降低磷酸酶活性,提高蛋白酪氨酸磷酸化,從而影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。TPKs能控制很多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白磷酸化狀態(tài),因此能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、生長、代謝和生存。與這種生物化學(xué)機(jī)制相符合的NOX的衍生物ROS已經(jīng)被證明在幾種不同的細(xì)胞類型中調(diào)整蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化。大量的研究證明NOX能夠引起細(xì)胞的死亡。ROS可以通過間接損傷DNA、類脂和蛋白,或是直接通過ROS介導(dǎo)激活信號通路來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ROS能夠激活前期凋亡信號通路MAPK,如SAPK/JNK,ERK1/2和p38。MAPK通路的激活主要是依賴ROS抑制酪氨酸磷酸酶。高濃度的ROS、超氧化物能抑制caspases,導(dǎo)致細(xì)胞從凋亡轉(zhuǎn)變?yōu)閴乃?。然而在另一些情況下,NOX衍生物ROS能夠抑制細(xì)胞的凋亡。ROS作為一種抗凋亡信號能激活NF-κB,Akt/ASK1途徑。超氧化物是Fas介導(dǎo)的細(xì)胞死亡的抑制劑。NOX的激活一般是與細(xì)胞的凋亡相聯(lián)系的,但在特定的條件下也可能起抗凋亡的作用。4nox4與腫瘤細(xì)胞ros1的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn),在硬化病的發(fā)病過程中,7-酮膽甾醇可能通過激活I(lǐng)RE1/JNK/AP-1信號通路,促進(jìn)NOX4的表達(dá),使得ROS生成增多,從而引起平滑肌細(xì)胞凋亡。NOX在腫瘤細(xì)胞及其相同組織來源的正常組織中表達(dá)不同,提示NOX的異常表達(dá)和調(diào)節(jié)可能與腫瘤發(fā)生和腫瘤細(xì)胞ROS增加有關(guān)。NOX1在兩種大腸癌細(xì)胞Caco-2,T-84及轉(zhuǎn)化細(xì)胞HEK293中表達(dá)增加。前列腺癌組織標(biāo)本中NOX1蛋白含量較正常前列腺組織明顯增加。研究表明,氧化的低密度脂蛋白能夠激活人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞中的NOX4而促進(jìn)ROS的生成。活化的NADPH氧化酶生成的過多的ROS又能夠氧化低密度脂蛋白,而氧化的低密度脂蛋白又能促進(jìn)NADPH氧化酶的活化,進(jìn)而形成惡性循環(huán),促進(jìn)動脈粥樣硬化的形成。5ros在腫瘤中的表達(dá)NOX家族是NADPH氧化酶的同源物,存在于不同的非吞噬細(xì)胞質(zhì)膜上,組織表達(dá)有一定的特異性。它們正