大腸桿菌利用廢棄生物質(zhì)高效生產(chǎn)丁二酸的代謝工程研究

大腸桿菌利用廢棄生物質(zhì)高效生產(chǎn)丁二酸的代謝工程研究利用木質(zhì)纖維素類生產(chǎn)生物化學(xué)品及生物燃料是生物煉制的核心內(nèi)容。丁二酸是一種平臺(tái)化合物,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、餐飲等行業(yè),同時(shí),丁二酸還可用于生產(chǎn)一些重要的聚酯、烷烴等。目前,利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)丁二酸有很多挑戰(zhàn),比如木質(zhì)纖維素預(yù)處理成本控制、基因工程菌的構(gòu)建、五碳糖和六碳糖的利用等等。在本論文中,我們利用Palmariapalmata、Strophanthuspreussii、Cocosnuciferawater(可可椰子水)以及elephantgrassstalk(大象草莖)四種生物質(zhì)為原料,開展了生物合成丁二酸的研究。首先,我們利用紅巨藻P.palmata進(jìn)行了微生物合成丁二酸的研究。在工程菌E.coliKLPPP中分別敲除了乳酸脫氫酶A(ldhA)、丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)、磷酸轉(zhuǎn)乙酰激酶A(pta-ackA)、丙酮酸氧化酶B(poxB)等基因,并且過表達(dá)了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。P.palmala水解產(chǎn)物含有葡萄糖(12.57±0.17g/L)和半乳糖(18.03±0.10g/L)。經(jīng)過72小時(shí)得雙階段發(fā)酵,重組菌利用半乳糖(1.20±0.02mol/mol)作為底物比利用葡萄糖(0.48±0.03mol/mol)得到的丁二酸摩爾產(chǎn)率更高。丁二酸的濃度及摩爾產(chǎn)率分別達(dá)到22.40±0.12g/L和1.13±0.02mol/mol(總糖)。這一結(jié)果表明,P.palmata生物質(zhì)是一種新型的、具有替代性的生物基化學(xué)品的發(fā)酵原料。第二,對(duì)E.coli工程菌利用S.preussii發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的生物煉制過程進(jìn)行了研究。我們對(duì)S.preussii的甲醇浸提預(yù)處理工藝進(jìn)行了優(yōu)化。S.preussii甲醇浸提物主要含有葡萄糖(9.00±0.02g/L)、半乳糖(4.00±0.02g/L)、木糖(6.00±0.02g/L)、阿拉伯糖(0.50±0.02g/L)。工程菌E.coliK3OS中過表達(dá)了吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶基因(sthA),同時(shí)敲除ldhA,pflB,pta-ackA,poxB。該菌有效利用了S.prussii的甲醇浸提產(chǎn)物。在M9培養(yǎng)基中,經(jīng)過72小時(shí)的雙階段發(fā)酵,丁二酸濃度達(dá)到14.39±0.02g/L,產(chǎn)率為1.10±0.01mol/mol(總糖)。這一水平達(dá)到利用S.preussii甲醇浸提物發(fā)酵產(chǎn)生丁二酸最大理論值的64%。第三,我們構(gòu)建了工程菌E.coliM6PM,該菌過表達(dá)了Bacillussubtilis的丙酮酸羧化酶基因(pyc)基因,并對(duì)ldhA、pflB、pta-aackA、poxB、pgi、mureinclusterC(mreC)進(jìn)行了突變,下調(diào)了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)基因的活性。我們利用該菌進(jìn)行了可可椰子水混合糖發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的研究。C.nuciferawater主要含有葡萄糖(5.00±0.02g/L)、果糖(6.10±0.01g/L)、蔗糖(6.70±0.02g/L)。經(jīng)過72小時(shí)得雙階段發(fā)酵,丁二酸最終濃度達(dá)到11.78±0.02g/L,產(chǎn)率為1.23±0.01mol/mol(總糖)。這一水平達(dá)到利用C.nuciferawater發(fā)酵產(chǎn)生丁二酸最大理論值的72%。這一研究也顯示了可可椰子水作為底物生產(chǎn)生物化學(xué)品的重要性。第四,利用大香草莖水解物進(jìn)行了丁二酸發(fā)酵。大香草莖水解物主要含有葡萄糖(11.60±0.04g/L)、木糖(27.22±0.04g/L)、阿拉伯糖(0.65±0.04g/L)。工程菌E.coliM6PM可有效利用大香草莖水解物發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。該工程菌對(duì)ldhA、pflB、pta-ackA、poxB、pgi、mreC等多基因進(jìn)行了突變、下調(diào)了ppc基因、過表達(dá)了B.subtilis的pyc。經(jīng)過72小時(shí)雙階段發(fā)酵,產(chǎn)生的丁二酸最終濃度達(dá)到30.03±0.02g/L,產(chǎn)率為1.09mol/mol。這一研究說明了工程菌利用可再生的生物質(zhì)作為原料發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸得可能性。最