HPLC方法開發(fā)-流動(dòng)相的選擇課件

HPLC方法開發(fā)

——流動(dòng)相的選擇HPLC方法開發(fā)——流動(dòng)相的選擇1.流動(dòng)相的一般要求

流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力流動(dòng)相具有一定惰性流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)純度高流動(dòng)相的黏度要盡量小流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑流動(dòng)相配置好后要進(jìn)行過濾流動(dòng)相配制好后要進(jìn)行脫氣HPLC方法開發(fā)——流動(dòng)相的選擇2.常用溶劑的重要性質(zhì)

極性黏度沸點(diǎn)紫外截止波長HPLC方法開發(fā)——流動(dòng)相的選擇常用溶劑參數(shù)表SolventPolarityViscosity(cp20℃)BoilingPoint(℃)UVCutOff(nm)Hexane(正己烷)0.060.3369210Carbontetrachloride(四氯化碳)1.600.9777265Toluene(甲苯)2.400.59111285Benzene(苯)3.000.6580210Methylenechloride(二氯甲烷)3.400.4440245n-propanol(異丙醇)4.002.2798210Tetrahydrofuran(四氫呋喃)4.200.5566220Ethanol(乙醇)4.301.2079210Chloroform(氯仿)4.400.5761245Acetone(丙酮)5.400.3257330Acetonitrile(乙腈)6.200.3782190Dimethylformamide(二甲基甲酰胺)6.400.92153270Methanol(甲醇)6.600.6065205Ethyleneglycol(乙二醇)6.9019.90197210Dimethylsulfoxide(二甲亞砜)7.202.24189260Water10.201.00100210HPLC方法開發(fā)——流動(dòng)相的選擇3.過濾

溶劑和樣品過濾非常重要，它會(huì)對(duì)色譜柱、儀器起到保護(hù)作用，消除由于污染對(duì)分析結(jié)果的影響。色譜柱：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損，同時(shí)也會(huì)增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。HPLC方法開發(fā)——流動(dòng)相的選擇4.脫氣氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但成本高。超聲脫氣法：流動(dòng)相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩10-15min。在線真空脫氣法：Agilent1100LC真空脫機(jī)利用膜滲透技術(shù)，在線脫氣。HPLC方法開發(fā)——流動(dòng)相的選擇5.溶劑過濾器的防護(hù)溶劑的質(zhì)量或污染以及藻類的生長會(huì)堵塞溶劑過濾器，從而影響泵的運(yùn)行，尤其水溶液或磷酸鹽緩沖液。以下幾種方法可以有效防止溶劑瓶內(nèi)溶劑過濾器的堵塞。

（1）嚴(yán)格執(zhí)行溶劑過濾（2）勿使用多日存放的蒸餾水及磷酸鹽緩沖液（3）避免使溶劑瓶暴露在直射陽光下，盡量使用琥珀色的溶劑瓶盛放水溶液或磷酸鹽緩沖液。堵塞后的處理法方法：將過濾頭從組件中取下，在濃硝酸（35%）中浸泡1h，然后用蒸餾水沖洗干凈。HPLC方法開發(fā)——流動(dòng)相的選擇6．流動(dòng)相的貯存流動(dòng)相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯容器內(nèi)，不要貯存在塑料容器中。貯存容器一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧及塵埃溶入流動(dòng)相。磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用，不要貯存超過規(guī)定的有效期。容器應(yīng)定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長的微生物。HPLC方法開發(fā)——流動(dòng)相的選擇7．HPLC實(shí)驗(yàn)用水HPLC實(shí)驗(yàn)用水除滿足藥典對(duì)純化水

一般要求外，還需要滿足以下要求：

項(xiàng)目指標(biāo)電阻率，MΩ·cm，25℃，最小18.0總有機(jī)碳（TOC)，mg/L，最大0.5微粒，μm濾器0.22

HPLC級(jí)水增加紫外加吸收要求：在1cm池中，用HPLC級(jí)水作空白，在190nm、200nm和250~400nm的吸收度分別不得過0.01、0.01和0.05。

HPLC方法開發(fā)——流動(dòng)相的選擇8.等度洗脫

在反相色譜中，極性越強(qiáng)的溶劑洗脫能力越弱。等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動(dòng)相組成保持恒定，適合于組分?jǐn)?shù)目較少，組分極性有一定差別的樣品，多用于含量測定。優(yōu)點(diǎn)：基線平穩(wěn)，保留時(shí)間重現(xiàn)性好，對(duì)流動(dòng)相純度要求低。缺點(diǎn)：較早洗脫出的色譜峰時(shí)分離度差，較晚洗脫出的色譜峰展寬理論塔板數(shù)低。HPLC方法開發(fā)——流動(dòng)相的選擇9.梯度洗脫

梯度洗脫是在一個(gè)分析周期內(nèi)程序控制流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度和pH值等，用于分析組分?jǐn)?shù)目多樣品。優(yōu)點(diǎn)：

縮短分析時(shí)間提高分離度改善峰形提高檢測靈敏度缺點(diǎn)：

增加基線漂移較長平衡時(shí)間

HPLC方法開發(fā)——流動(dòng)相的選擇9.梯度洗脫

在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視：要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相。梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時(shí)常出現(xiàn)壓力的變化。要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。

每次梯度洗脫之后必須10~30倍柱容積的初始流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱，使其恢復(fù)到初始狀態(tài)。HPLC方法開發(fā)——流動(dòng)相的選擇10．流動(dòng)相的pH值

反相離子抑制技術(shù)：采用反相色譜法分離弱酸或弱堿樣品時(shí)，通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術(shù)。對(duì)于弱酸，流動(dòng)相的pH值越小，組分的解離平衡常數(shù)Ka值越小，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的pKa值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在；對(duì)弱堿，流動(dòng)相的pH值越大，組分的Ka值越大，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于弱堿的pKa值時(shí)，弱堿主要以分子形式存在；分析弱酸樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸，常用10～50mmol/L磷酸鹽緩沖液，0.05%TFA；分析弱堿樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱堿，常用10mmol/L三乙胺溶液，0.05~0.5%NH4OH。

HPLC方法開發(fā)——流動(dòng)相的選擇10．流動(dòng)相的pH值當(dāng)溶液pH值等于化合物的pKa時(shí)，化合物半解離。在pKa±1.5的范圍內(nèi)，保留隨pH值的變化而發(fā)生明顯變化。超過此pH值范圍，化合物完全解離或不解離，保留隨pH值的變化很小。了解化合物的pKa值，可在pKa±2的范圍外調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，使化合物有較好的峰形，保持保留的恒定，使建立的方法具有耐用性。

HPLC方法開發(fā)——流動(dòng)相的選擇10．流動(dòng)相的pH值HPLC方法開發(fā)——流動(dòng)相的選擇11.緩沖鹽HPLC用緩沖鹽時(shí),由于泵頭內(nèi)的緩沖鹽溶液存在高壓析鹽現(xiàn)象,析出的細(xì)小鹽粒非常堅(jiān)硬,它附著在藍(lán)寶石活塞桿上,隨著藍(lán)寶石活塞桿的往復(fù)運(yùn)動(dòng),容易產(chǎn)生劃痕,并磨損密封墊,造成漏液等故障現(xiàn)象。在線Seal-wash選項(xiàng)能有效的帶走可能存在的緩沖鹽結(jié)晶。清洗液配制:90%水+10%異丙醇.該混合液可抑制菌類生長和減小水的表面張力。當(dāng)鹽溶液與有機(jī)溶劑溶液混合時(shí)，鹽溶液能與有機(jī)溶劑溶液完全混溶，而不會(huì)出現(xiàn)沉淀。但是在比例閥的混合點(diǎn)，重力作用使鹽顆粒沉淀下來，因此此時(shí)應(yīng)該在進(jìn)液口位于混合器下方放置含鹽流動(dòng)相進(jìn)液口位于混合器上方放置不含鹽流動(dòng)相；HPLC方法開發(fā)——流動(dòng)相的選擇11.緩沖鹽緩沖劑pKa緩沖范圍UV截止波長nm磷酸鹽2.11.1-3.1200(0.1%)7.26.2-8.212.311.3-13.3檸檬酸鹽3.12.1-6.4230(10mM)4.75.4甲酸鹽3.82.8-4.8210(10mM)乙酸鹽4.83.8-5.8210(10mM)氨水9.28.2-10.2200(10mM)三乙胺1110.0-12.0200(10mM)HPLC方法開發(fā)——流動(dòng)相的選擇12.離子對(duì)試劑作用原理：離子對(duì)試劑與待分析的物質(zhì)（多為在溶液狀態(tài)時(shí)顯以與離子對(duì)試劑相反的電荷）結(jié)合成離子對(duì)而呈中性，這樣非極性就表現(xiàn)出來，從而在色譜柱上有保留行為。試劑選擇：分析酸性（作用基團(tuán)）樣品一般用陽離子對(duì)試劑（四丁基溴化銨、四丁基硫酸氫銨），分析堿性樣品用陰離子對(duì)試劑（己烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉……十二烷基磺酸鈉）離子對(duì)的分離機(jī)制------離子對(duì)模型樣品離子首先在流動(dòng)相中與離子對(duì)試劑的反離子生成不荷電的疏水性離子對(duì)，然后溶解或吸附于非極性固定相上。離子對(duì)試劑的烷基C鏈越長，生成的離子對(duì)與固定相的親和力越大，因此組分的保留值也越大。使用離子對(duì)試劑濃度盡可能的低（一般0.005mol/L)，

以

保證對(duì)柱子填料的穩(wěn)定性影響最小及清洗方便。

HPLC方法開發(fā)——流動(dòng)相的選擇12.離子對(duì)試劑離子對(duì)試劑使用注意的因素有：1、離子對(duì)的濃度，這個(gè)一般情況下在滿足要求的前提下

越低越好。2、離子對(duì)溶液的pH，這個(gè)是進(jìn)行分離的最關(guān)鍵的因素，而只能在緩沖液中測定pH,不要混合有機(jī)相后測定。3、如果使用離子對(duì)試劑，一定注意平衡時(shí)間，正常的話在60-90分鐘才能達(dá)到徹底的平衡，還有在實(shí)驗(yàn)結(jié)束以后要沖洗超過2個(gè)小時(shí)，否則柱子可能會(huì)不可逆的損傷。4、用離子對(duì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所用的柱子盡量和其他的非離子對(duì)的分開使用。

HPLC方法開發(fā)——流動(dòng)相的選擇13.各種檢測器對(duì)流動(dòng)相的特殊要求

13.1UV：截止波長:將溶劑裝入1cm的比色皿，以空氣為參比，逐漸降低入射波長，溶劑的吸光度A＝1時(shí)的波長。中國藥典對(duì)UV法溶劑的要求是：以空氣為空白，溶劑和吸收池的吸收度：

在220~240nm范圍內(nèi)不得超過0.40

在241~250nm范圍內(nèi)不得過0.20

在251~300nm范圍內(nèi)不得過0.10

在300nm以上不得過0.05HPLC方法開發(fā)——流動(dòng)相的選擇13.各種檢測器對(duì)流動(dòng)相的特殊要求13.2ELSDELSD對(duì)流動(dòng)相的組成不敏感，可以用于梯度洗脫；ELSD要求流動(dòng)相要蒸發(fā)掉，因此不能使用不易揮發(fā)的物質(zhì)來調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值。HPLC方法開發(fā)——流動(dòng)相的選擇13.各種檢測器對(duì)流動(dòng)相的特殊要求13.3MSD由于鹽對(duì)質(zhì)譜的損傷很大