Red同源重組技術(shù)研究進(jìn)展

Red同源重組技術(shù)研究進(jìn)展一、本文概述同源重組（HomologousRecombination，HR）是一種在生物學(xué)領(lǐng)域中重要的遺傳機(jī)制，涉及到DNA雙鏈斷裂的修復(fù)過程。近年來，隨著分子生物學(xué)和基因編輯技術(shù)的飛速發(fā)展，Red同源重組技術(shù)因其高效、精確的特性，在基因功能研究、疾病治療以及生物工程等領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。本文旨在全面綜述Red同源重組技術(shù)的研究進(jìn)展，探討其在不同應(yīng)用領(lǐng)域中的最新發(fā)展和挑戰(zhàn)，以期為進(jìn)一步推動(dòng)Red同源重組技術(shù)的發(fā)展提供參考。本文首先簡(jiǎn)要介紹了同源重組的基本概念、原理及其在生物學(xué)中的重要性。隨后，重點(diǎn)回顧了Red同源重組技術(shù)的發(fā)展歷程，包括其起源、技術(shù)原理、關(guān)鍵組件以及實(shí)驗(yàn)操作等方面。在此基礎(chǔ)上，文章對(duì)Red同源重組技術(shù)在基因功能研究、疾病治療、生物工程等領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了深入探討，總結(jié)了該技術(shù)在這些領(lǐng)域中的優(yōu)勢(shì)和局限性。本文還對(duì)Red同源重組技術(shù)的未來發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望，包括新技術(shù)的研發(fā)、應(yīng)用領(lǐng)域的拓展以及潛在的風(fēng)險(xiǎn)和挑戰(zhàn)等。通過對(duì)Red同源重組技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行全面綜述，本文旨在為相關(guān)領(lǐng)域的學(xué)者和研究人員提供一個(gè)全面的參考平臺(tái)，促進(jìn)Red同源重組技術(shù)在不同領(lǐng)域中的應(yīng)用和發(fā)展。本文也希望能夠引起更多研究者關(guān)注Red同源重組技術(shù)，共同推動(dòng)其在生命科學(xué)領(lǐng)域中的創(chuàng)新和發(fā)展。二、Red同源重組技術(shù)的歷史與發(fā)展Red同源重組技術(shù)，以其精準(zhǔn)、高效的基因編輯能力，在生命科學(xué)領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。該技術(shù)源于20世紀(jì)80年代，當(dāng)時(shí)科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了一種名為Red的細(xì)菌基因，具有在DNA雙鏈上產(chǎn)生雙鏈斷裂的能力。隨后的研究進(jìn)一步揭示了Red基因家族中的Exo、Beta和Gam蛋白在DNA修復(fù)和重組中的關(guān)鍵作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，研究者們開始嘗試?yán)肦ed同源重組系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯。1998年，研究者首次實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中通過Red同源重組技術(shù)進(jìn)行的基因敲除，這一突破為后續(xù)的基因編輯研究奠定了基礎(chǔ)。進(jìn)入21世紀(jì)，Red同源重組技術(shù)得到了更為廣泛的應(yīng)用，不僅在大腸桿菌中，還在其他多種細(xì)菌、酵母甚至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中都實(shí)現(xiàn)了高效的基因編輯。近年來，隨著CRISPR-Cas9等新型基因編輯技術(shù)的興起，Red同源重組技術(shù)面臨了一定的挑戰(zhàn)。然而，由于其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如能夠在不進(jìn)行DNA切割的情況下實(shí)現(xiàn)基因的精確替換，Red同源重組技術(shù)仍在許多領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。特別是在那些需要保持基因組完整性的研究中，Red同源重組技術(shù)展現(xiàn)出了巨大的潛力。未來，隨著基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，Red同源重組技術(shù)有望在更多領(lǐng)域得到應(yīng)用。對(duì)于Red同源重組機(jī)制的深入研究，也將為開發(fā)更為高效、安全的基因編輯工具提供重要參考。三、Red同源重組技術(shù)的核心組件與機(jī)制Red同源重組技術(shù)，作為一種強(qiáng)大的基因編輯工具，其核心組件與機(jī)制的研究一直是分子生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。Red同源重組系統(tǒng)主要由兩部分組成：Redα、Redβ蛋白以及一個(gè)外源性的單鏈DNA（ssDNA）模板。Redα和Redβ是來源于λ噬菌體的兩種蛋白，它們能夠形成一個(gè)復(fù)合物，特異性地結(jié)合到雙鏈DNA（dsDNA）上的特定序列，即“重組位點(diǎn)”。當(dāng)這個(gè)復(fù)合物遇到與其結(jié)合的ssDNA模板時(shí)，便啟動(dòng)同源重組過程。在這個(gè)過程中，Redα和Redβ蛋白幫助ssDNA模板與dsDNA上的同源序列進(jìn)行配對(duì)，并催化兩者之間的交換，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的精確編輯。值得一提的是，Red同源重組技術(shù)具有高度的特異性和效率。由于Redα、Redβ蛋白與ssDNA模板之間的相互作用非常精確，因此只有在目標(biāo)基因序列與ssDNA模板完全匹配的情況下，重組過程才會(huì)發(fā)生。由于Red同源重組不需要DNA復(fù)制或修復(fù)過程，因此其編輯效率遠(yuǎn)高于其他基因編輯技術(shù)。近年來，隨著對(duì)Red同源重組技術(shù)核心組件與機(jī)制的深入研究，科研人員不僅提高了該技術(shù)的編輯效率，還拓展了其應(yīng)用范圍。例如，通過優(yōu)化Redα、Redβ蛋白的表達(dá)條件和ssDNA模板的設(shè)計(jì)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)更復(fù)雜基因組的精確編輯。Red同源重組技術(shù)也被應(yīng)用于基因治療、基因功能研究等多個(gè)領(lǐng)域，展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。Red同源重組技術(shù)的核心組件與機(jī)制是其在基因編輯領(lǐng)域發(fā)揮巨大作用的關(guān)鍵。隨著研究的深入和技術(shù)的優(yōu)化，Red同源重組技術(shù)有望在更多領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，為人類健康和生命科學(xué)的發(fā)展做出更大貢獻(xiàn)。四、Red同源重組技術(shù)在基因組編輯中的應(yīng)用近年來，Red同源重組技術(shù)已成為基因組編輯領(lǐng)域的重要工具之一，其在各個(gè)研究領(lǐng)域中均展現(xiàn)出了巨大的潛力和應(yīng)用價(jià)值。Red同源重組技術(shù)以其高效、精確的特點(diǎn)，在基因功能研究、基因治療以及生物工程等領(lǐng)域中發(fā)揮著越來越重要的作用。在基因功能研究方面，Red同源重組技術(shù)可以用于構(gòu)建基因敲除或敲入模型，從而研究特定基因在生物體中的功能。通過精確的基因編輯，科學(xué)家們可以深入了解基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制、蛋白質(zhì)的功能以及基因與疾病之間的關(guān)聯(lián)。這為揭示生命科學(xué)的奧秘提供了強(qiáng)有力的手段。在基因治療領(lǐng)域，Red同源重組技術(shù)也展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景?；蛑委熤荚谕ㄟ^修復(fù)或替換缺陷基因來治療遺傳性疾病。Red同源重組技術(shù)可以精確地定位到病變基因并對(duì)其進(jìn)行修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)遺傳性疾病的有效治療。該技術(shù)還可以用于構(gòu)建個(gè)性化的基因治療方案，根據(jù)患者的具體情況進(jìn)行精準(zhǔn)治療，提高治療效果和安全性。在生物工程領(lǐng)域，Red同源重組技術(shù)也發(fā)揮著重要作用。通過精確的基因編輯，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物體的遺傳改造，從而優(yōu)化其生產(chǎn)性能、提高抗病能力或創(chuàng)造新的生物資源。這對(duì)于農(nóng)業(yè)、工業(yè)以及醫(yī)藥等領(lǐng)域的發(fā)展具有重要意義。Red同源重組技術(shù)在基因組編輯中的應(yīng)用已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)展，并在各個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛力。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，相信Red同源重組技術(shù)將在未來的基因組編輯領(lǐng)域中發(fā)揮更加重要的作用，為人類健康和科技進(jìn)步做出更大的貢獻(xiàn)。五、Red同源重組技術(shù)的優(yōu)化與改進(jìn)Red同源重組技術(shù)自其誕生以來，已經(jīng)在多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出強(qiáng)大的應(yīng)用潛力。然而，為了更好地滿足科研和實(shí)際應(yīng)用的需求，對(duì)Red同源重組技術(shù)的優(yōu)化與改進(jìn)成為了研究的熱點(diǎn)。在Red同源重組技術(shù)的優(yōu)化方面，研究者們針對(duì)重組效率、特異性、安全性等方面進(jìn)行了大量的探索。通過改進(jìn)Red重組酶的表達(dá)調(diào)控，優(yōu)化Red重組酶與DNA底物的相互作用，可以顯著提高Red同源重組的效率。同時(shí)，通過對(duì)Red重組酶進(jìn)行基因改造，可以進(jìn)一步提高其特異性和穩(wěn)定性，減少非特異性重組的發(fā)生。在Red同源重組技術(shù)的改進(jìn)方面，研究者們致力于拓展其應(yīng)用范圍和提高其易用性。一方面，通過將Red同源重組技術(shù)與其他基因編輯技術(shù)相結(jié)合，如CRISPR-Cas9系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜基因組的精準(zhǔn)編輯。另一方面，通過開發(fā)新型的Red同源重組載體和簡(jiǎn)化操作流程，可以降低技術(shù)難度，提高實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。隨著生物信息學(xué)和合成生物學(xué)的發(fā)展，研究者們還可以通過計(jì)算機(jī)模擬和預(yù)測(cè)Red同源重組過程，為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供更為精確的理論指導(dǎo)。利用合成生物學(xué)的方法，可以構(gòu)建更為復(fù)雜和高效的Red同源重組系統(tǒng)，以滿足不同領(lǐng)域的研究需求。Red同源重組技術(shù)的優(yōu)化與改進(jìn)是一個(gè)持續(xù)的過程。通過不斷探索和創(chuàng)新，我們有望將Red同源重組技術(shù)發(fā)展成為一種更為高效、精準(zhǔn)和安全的基因編輯工具，為生命科學(xué)研究和實(shí)際應(yīng)用提供更為強(qiáng)大的支持。六、Red同源重組技術(shù)在其他領(lǐng)域的應(yīng)用隨著Red同源重組技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，其應(yīng)用領(lǐng)域也日益廣泛。除了上述的生物醫(yī)藥領(lǐng)域，該技術(shù)還在其他多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，Red同源重組技術(shù)為作物遺傳改良提供了新的手段。通過精確編輯作物的基因組，可以定向改良作物的性狀，如提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)、增強(qiáng)抗逆性等。該技術(shù)還可以用于創(chuàng)制抗病、抗蟲、抗除草劑等優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因作物，為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支持。在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域，Red同源重組技術(shù)可用于環(huán)境污染物的生物修復(fù)。通過編輯特定微生物的基因組，可以提高其降解有毒有害物質(zhì)的能力，從而加速環(huán)境污染的治理和修復(fù)。該技術(shù)還可用于構(gòu)建高效的環(huán)境監(jiān)測(cè)體系，提高環(huán)境監(jiān)測(cè)的準(zhǔn)確性和效率。在工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，Red同源重組技術(shù)為工業(yè)微生物的遺傳改良和代謝工程提供了新的途徑。通過編輯工業(yè)微生物的基因組，可以優(yōu)化其代謝途徑，提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量。該技術(shù)還可以用于構(gòu)建高效的生物催化劑和生物傳感器，推動(dòng)工業(yè)生物技術(shù)的創(chuàng)新和發(fā)展。在生物能源領(lǐng)域，Red同源重組技術(shù)可用于提高生物能源作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。通過編輯生物能源作物的基因組，可以優(yōu)化其生長(zhǎng)和代謝過程，提高生物能源的生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)性。該技術(shù)還可以用于構(gòu)建高效的生物能源轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，推動(dòng)生物能源產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。Red同源重組技術(shù)在多個(gè)領(lǐng)域都展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和創(chuàng)新，相信Red同源重組技術(shù)將在未來發(fā)揮更加重要的作用，為人類社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展做出更大的貢獻(xiàn)。七、總結(jié)與展望隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，Red同源重組技術(shù)作為一種強(qiáng)大的基因編輯工具，在生命科學(xué)研究中展現(xiàn)出了巨大的潛力和應(yīng)用價(jià)值。本文綜述了Red同源重組技術(shù)的原理、發(fā)展歷程、應(yīng)用領(lǐng)域以及面臨的挑戰(zhàn)。通過深入了解Red系統(tǒng)的分子機(jī)制，我們發(fā)現(xiàn)它在基因組編輯、基因治療以及遺傳病研究等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，Red同源重組技術(shù)仍面臨一些挑戰(zhàn)和限制。例如，同源臂長(zhǎng)度的選擇、重組效率的提高、非特異性重組的避免等問題需要進(jìn)一步研究和解決。Red系統(tǒng)在不同物種和細(xì)胞類型中的適用性也需要進(jìn)一步驗(yàn)證和優(yōu)化。展望未來，我們期待Red同源重組技術(shù)在以下幾個(gè)方面取得突破：通過改進(jìn)重組效率和特異性，提高Red系統(tǒng)在基因編輯中的應(yīng)用效果；拓展Red系統(tǒng)的應(yīng)用范圍，使其能夠適用于更多的物種和細(xì)胞類型；探索Red系統(tǒng)在基因治療和遺傳病治療等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展貢獻(xiàn)力量。Red同源重組技術(shù)作為一種強(qiáng)大的基因編輯工具，在生命科學(xué)研究中具有重要的地位和作用。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和優(yōu)化，我們有理由相信Red系統(tǒng)將在未來為生命科學(xué)領(lǐng)域帶來更多的驚喜和突破。參考資料：隨著生命科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，基因編輯技術(shù)已經(jīng)成為研究基因功能和遺傳疾病的重要工具。其中，同源重組技術(shù)（Homologousrecombination）是一種精確編輯基因組的手段，而RedET技術(shù)則是近年來發(fā)展起來的一種基于同源重組的基因編輯方法。本文將介紹RedET技術(shù)的原理及其在微生物基因組挖掘中的應(yīng)用進(jìn)展。RedET技術(shù)是基于同源重組原理，利用細(xì)菌的Red同源重組系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯。該技術(shù)包括三個(gè)主要步驟：DNA的引入、同源臂的構(gòu)建和同源重組。通過轉(zhuǎn)座子或噬菌體等載體將含有目的基因和同源臂的DNA片段引入細(xì)胞中。然后，同源臂與細(xì)胞基因組中的同源序列進(jìn)行配對(duì)，啟動(dòng)同源重組過程。通過同源重組將目的基因整合到細(xì)胞基因組中，實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)編輯或敲除。利用RedET技術(shù)可以方便地實(shí)現(xiàn)基因敲除，從而研究基因的功能。通過構(gòu)建含有同源臂的敲除載體，將目的基因替換為抗生素抗性基因或其他標(biāo)記基因，實(shí)現(xiàn)基因的敲除。這種方法可以用于細(xì)菌、酵母等微生物的基因敲除和功能驗(yàn)證。通過RedET技術(shù)可以在基因組的特定位置插入標(biāo)簽序列，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的定位和跟蹤。例如，在細(xì)菌膜蛋白的研究中，可以通過RedET技術(shù)將熒光蛋白標(biāo)簽插入膜蛋白基因中，觀察蛋白質(zhì)在細(xì)胞膜上的定位和運(yùn)動(dòng)。RedET技術(shù)可以用于構(gòu)建基因組編輯文庫(kù)，從而實(shí)現(xiàn)代謝工程的優(yōu)化。通過在基因組中引入多個(gè)突變，可以篩選出具有優(yōu)良性能的突變體，優(yōu)化微生物的代謝途徑和生產(chǎn)能力。例如，在酵母中利用RedET技術(shù)構(gòu)建了多個(gè)突變文庫(kù)，用于篩選具有優(yōu)良發(fā)酵性能的突變體。除了基因敲除和定點(diǎn)編輯外，RedET技術(shù)還可以用于基因組大片段刪除和染色體重構(gòu)。通過構(gòu)建含有大片段同源臂的DNA片段，可以實(shí)現(xiàn)染色體上大片段的刪除和重構(gòu)，從而研究染色體結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。隨著生命科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，RedET技術(shù)作為一種高效的基因編輯手段，在微生物基因組挖掘中具有廣泛的應(yīng)用前景。未來，隨著技術(shù)的不斷完善和創(chuàng)新，RedET技術(shù)有望在更多領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，為生命科學(xué)研究提供更多可能性。我們也應(yīng)該關(guān)注技術(shù)的倫理和社會(huì)影響，確保技術(shù)的合理應(yīng)用和發(fā)展。大腸桿菌，作為最常用的基因工程模式生物，其基因敲除技術(shù)對(duì)于研究基因功能及其相互作用至關(guān)重要。近年來，Red兩步同源重組法在大腸桿菌基因敲除中得到了廣泛應(yīng)用，本文將就其應(yīng)用進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹。Red兩步同源重組法是一種高效的基因敲除技術(shù)，主要利用了同源重組的原理。該方法分為兩個(gè)步驟，首先是通過同源重組將含目的基因的DNA片段替換掉靶基因，然后在第二個(gè)步驟中，利用相同的同源序列，將含抗生素抗性基因的DNA片段插入到靶基因的位置。這一方法具有高效、精確、簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，適用于大多數(shù)大腸桿菌基因敲除的需求。選擇一個(gè)與目的基因具有高度同源性的DNA片段，將其與載體相連，通過電轉(zhuǎn)技術(shù)導(dǎo)入到大腸桿菌中。在第一次篩選中，利用同源重組的原理，將含目的基因的DNA片段與靶基因進(jìn)行替換。這一步的篩選主要基于抗生素抗性標(biāo)記和重組酶的活性。通過這一步，大部分目的基因已經(jīng)被敲除。在第二步中，將含有抗性基因的DNA片段導(dǎo)入大腸桿菌中，利用同源重組的原理，將抗性基因插入到靶基因的位置。這一步的篩選主要基于抗性基因的表達(dá)和重組酶的活性。通過這一步，抗性基因被引入到靶基因的位置，完成了大腸桿菌基因的敲除。在使用Red兩步同源重組法進(jìn)行大腸桿菌基因敲除時(shí)，務(wù)必確保所使用的DNA片段與目的基因具有高度同源性，以避免不必要的突變。在第一步和第二步之間，需要確保大腸桿菌在非選擇壓力下生長(zhǎng)，以防止目的基因的反彈。在進(jìn)行基因敲除時(shí)，需要使用有效的電轉(zhuǎn)技術(shù)，以確保DNA片段能夠成功導(dǎo)入到大腸桿菌中。在篩選過程中，需要使用適當(dāng)?shù)目股睾蜐舛?，以確保篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性。在整個(gè)過程中，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，包括溫度、pH、離子濃度等，以避免不必要的誤差。Red兩步同源重組法是一種高效、精確、簡(jiǎn)單的大腸桿菌基因敲除技術(shù)，適用于大多數(shù)大腸桿菌基因敲除的需求。在使用該方法時(shí)，需要注意確保所使用的DNA片段與目的基因具有高度同源性，選擇適當(dāng)?shù)目股睾蜐舛冗M(jìn)行篩選，并嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件。通過這些措施，可以確保基因敲除結(jié)果的準(zhǔn)確性。未來隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，我們有理由相信Red兩步同源重組法將在大腸桿菌基因敲除領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。同源重組（HomologousRecombination）是指發(fā)生在非姐妹染色單體（non-sisterchromatid）之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內(nèi)的重新組合。同源重組需要一系列的蛋白質(zhì)催化，如原核生物細(xì)胞內(nèi)的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物細(xì)胞內(nèi)的RadMre11-Rad50等等。同源重組反應(yīng)通常根據(jù)交叉分子或Holliday結(jié)構(gòu)（HollidayJunctureStructure）的形成和拆分分為三個(gè)階段，即前聯(lián)會(huì)體階段、聯(lián)會(huì)體形成和Holliday結(jié)構(gòu)的拆分。同源重組反應(yīng)嚴(yán)格依賴DNA分子之間的同源性，100%重組的DNA分子之間的重組常見于非姐妹染色體之間的同源重組，稱為HomologousRecombination，而小于100%同源性的DNA分子之間或分子之內(nèi)的重組，則被稱為HemologousRecombination。后者可被負(fù)責(zé)堿基錯(cuò)配對(duì)的蛋白如原核細(xì)胞內(nèi)的MutS或真核生物細(xì)胞內(nèi)的MSH2-3等蛋白質(zhì)“編輯”。同源重組可以雙向交換DNA分子，也可以單向轉(zhuǎn)移DNA分子，后者又被稱為基因轉(zhuǎn)換（GeneConversion）。由于同源重組嚴(yán)格依賴分子之間的同源性，因此，原核生物的同源重組通常發(fā)生在DNA復(fù)制過程中，而真核生物的同源重組則常見于細(xì)胞周期的S期之后?；蚯贸╣eneknockout），是指對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將該基因去除，或用其它順序相近基因取代，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，推測(cè)相應(yīng)基因的功能。這與早期生理學(xué)研究中常用的切除部分-觀察整體-推測(cè)功能的三部曲思想相似?；蚯贸芍兄鼓骋换虻谋磉_(dá)外，還包括引入新基因及引入定點(diǎn)突變。既可以是用突變基因或其它基因敲除相應(yīng)的正常基因，也可以用正?；蚯贸鄳?yīng)的突變基因?；蚯贸?0年代后半期應(yīng)用DNA同源重組原理發(fā)展起來的一門新技術(shù)。80年代初，胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。1985年，首次證實(shí)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的理論基礎(chǔ)。到1987年，Thompson首次建立了完整的ES細(xì)胞基因敲除的小鼠模型。此后的幾年中，基因敲除技術(shù)得到了進(jìn)一步的發(fā)展和完善。（4）將擊中細(xì)胞轉(zhuǎn)入胚胎使其生長(zhǎng)成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行形態(tài)觀察及分子生物學(xué)檢測(cè)。基因敲除的靶細(xì)胞目前最常用的是小鼠ES細(xì)胞。基因敲除的技術(shù)路線雖不復(fù)雜，但由于高等真核細(xì)胞內(nèi)外源DNA與靶細(xì)胞DNA序列自然發(fā)生同源重組的機(jī)率非常低，約為百萬分之一，要把基因敲除成功的細(xì)胞篩選出來是一件非常困難的工作。因此，同源重組的篩選和檢測(cè)就成了基因敲除技術(shù)所要解決的關(guān)鍵問題。目前已有多種篩選方法，其中1988年猶它大學(xué)的Capecchi教授的研究組發(fā)展的"正負(fù)雙向選擇系統(tǒng)"適用范圍寬且效率較高。同源重組(homologousrecombination)是將外源基因定位導(dǎo)入受體細(xì)胞染色體上的方法，因?yàn)樵谠撟挥信c導(dǎo)入基因同源的序列，通過單一或雙交換，新基因片段可替換有缺陷的基因片段，達(dá)到修正缺陷基因的目的。位點(diǎn)特異性重組是發(fā)生在兩條DNA鏈特異位點(diǎn)上的重組，重組的發(fā)生需一段同源序列即特異性位點(diǎn)(又稱附著點(diǎn)；attachmentsite，att)和位點(diǎn)特異性的蛋白因子即重組酶參與催化。重組酶僅能催化特異性位點(diǎn)間的重組，因而重組具有特異性和高度保守性。根據(jù)氨基酸序列相似性和催化機(jī)制的差異，位點(diǎn)特異性重組酶主要分為兩大家族，即整合酶系和解離酶/轉(zhuǎn)化酶系，這兩個(gè)家族相隔很遠(yuǎn)。整合酶家族催化重組的機(jī)制是進(jìn)行酪氨酸介導(dǎo)的鏈交換，該家族包含有Cre/loxP、FLP/FRT等已經(jīng)研究得比較清楚并廣泛應(yīng)用的重組酶系統(tǒng)。解離酶/轉(zhuǎn)化酶家族催化機(jī)制是由絲氨酸介導(dǎo)的，當(dāng)酶和DNA之間形成含磷的絲氨酸連接時(shí)，連接處DNA的4條鏈發(fā)生協(xié)調(diào)的交錯(cuò)斷裂，然后重新結(jié)合，完成同源重組。該家族成員包括來自于鏈霉菌噬菌體的φC31整合酶、lactococcal噬菌體的TP901—1整合酶、放線菌噬菌體的R4整合酶等。中C31整合酶(φC31—int)能夠有效介導(dǎo)噬菌體基因組中attP位點(diǎn)與細(xì)菌宿主染色體上attB位點(diǎn)間的重組反應(yīng)，將外源基因整合到基因組中，使轉(zhuǎn)基因的持續(xù)、高效表達(dá)，為非病毒載體轉(zhuǎn)移系統(tǒng)在遺傳病基因治療的應(yīng)用開辟了新的途徑。日本理化研究所發(fā)表新聞公報(bào)說，該所研究人員發(fā)現(xiàn)酵母線粒體中的DNA（脫氧核糖核酸）在一定條件下進(jìn)行同源重組時(shí)，不像以前認(rèn)為的那樣需要DNA形成超螺旋。這一發(fā)現(xiàn)將為抗衰老等方面的生物醫(yī)學(xué)研究提供新線索。新聞公報(bào)說，記錄生命遺傳信息的DNA呈穩(wěn)定的雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)，但在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和重組等過程中，DNA鏈會(huì)出現(xiàn)一種超螺旋現(xiàn)象，這類似于螺旋狀的電話線在受到外力時(shí)可能出現(xiàn)復(fù)雜的螺旋狀態(tài)。理化研究所的凌楓和柴田武彥等研究人員在酵母線粒體DNA的同源重組實(shí)驗(yàn)中，使用經(jīng)過高度純化的酶“Mhr1”進(jìn)行催化，發(fā)現(xiàn)這種條件下的DNA同源重組不需要形成超螺旋，而是通過一種名為“三鏈體”的中間體進(jìn)行。凌楓對(duì)記者說，曾有研究證明“Mhr1”酶在抑制線粒體異質(zhì)性上發(fā)揮著關(guān)鍵作用，此次研究揭示了其催化的反應(yīng)機(jī)制核心。由于線粒體異質(zhì)性與衰老等生理過程密切相關(guān)，理化研究所的這項(xiàng)研究為抗衰老等方面的生物醫(yī)學(xué)研究提供了新線