細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)技術(shù)

關(guān)于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)技術(shù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：皮下移植瘤模型原位移植瘤模型腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)體外實(shí)驗(yàn)第2頁,共35頁，2024年2月25日，星期天腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)常用研究方法Textinhere侵襲實(shí)驗(yàn)趨化運(yùn)動(dòng)劃痕實(shí)驗(yàn)第3頁,共35頁，2024年2月25日，星期天

實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞劃痕法是測定了腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)特性的方法之一。在體外培養(yǎng)的單層細(xì)胞上，劃痕致傷，然后在加入藥物等實(shí)驗(yàn)條件下觀察其對腫瘤細(xì)胞遷移的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)（傷口愈合實(shí)驗(yàn)，ScratchAssay）第4頁,共35頁，2024年2月25日，星期天操作步驟1．先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻的劃橫線，大約每隔0.5~1cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過3條線。第5頁,共35頁，2024年2月25日，星期天操作步驟2.在孔中加入約5×105個(gè)細(xì)胞，具體數(shù)量因細(xì)胞種類不同而不同，接種原則為過夜后融合率達(dá)到100%；3.用10mltip槍頭用力均勻地在培養(yǎng)皿中劃痕，PBS洗滌2次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。

第6頁,共35頁，2024年2月25日，星期天操作步驟4．放入37℃

5%

CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3h測量一次細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的距離，拍照(具體時(shí)間依實(shí)驗(yàn)需要而定)。第7頁,共35頁，2024年2月25日，星期天操作步驟

5.數(shù)據(jù)處理：每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的距離長度-0時(shí)距離=每個(gè)時(shí)間長度細(xì)胞整體遷移的距離，求出均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，時(shí)間為橫軸，遷移距離為縱軸（單位mm）作圖，并比較初始0時(shí)與實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對照組的照片。第8頁,共35頁，2024年2月25日，星期天注意事項(xiàng)

1.在用PBS緩沖液沖洗時(shí)，注意貼壁慢慢加入，以免沖散單層貼壁細(xì)胞，影響實(shí)驗(yàn)拍照結(jié)果。2.一般做劃痕實(shí)驗(yàn)，都是無血清或者低血清（<2%）否則細(xì)胞增殖就不能忽略。

3.按照6孔板背后畫線的垂直方向劃痕，可以形成若干交叉點(diǎn)，作為固定的檢測點(diǎn)，以解決了前后觀察時(shí)位置不固定的問題。4.實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)注意細(xì)胞生長狀況，選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。對不同的細(xì)胞要觀察細(xì)胞的貼壁率等，確定實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞的接種數(shù)量和培養(yǎng)時(shí)間，保證培養(yǎng)終止時(shí)密度適當(dāng)。

第9頁,共35頁，2024年2月25日，星期天第10頁,共35頁，2024年2月25日，星期天第11頁,共35頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共35頁，2024年2月25日，星期天第13頁,共35頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)原理

趨化運(yùn)動(dòng)是指細(xì)胞能夠感受到外界化學(xué)物質(zhì)的濃度梯度，并沿著濃度梯度的方向所做的定向運(yùn)動(dòng)。趨化運(yùn)動(dòng)是一個(gè)非常保守的過程，對于生物體的生存、生命的繁衍等具有重要的意義。趨化運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)（ChemotaxisAssay）第14頁,共35頁，2024年2月25日，星期天微孔小室中的趨化實(shí)驗(yàn)

微孔小室中的趨化實(shí)驗(yàn)是根據(jù)靶細(xì)胞（單核巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞或淋巴細(xì)胞等）能夠趨化性主動(dòng)遷移，穿過一定孔徑的濾膜而設(shè)計(jì)的。

濾膜（聚碳酸脂膜）將小室分隔成上下兩部分。靶細(xì)胞在上面，趨化因子在下面，趨化因子通過濾膜形成梯度，細(xì)胞則沿著梯度穿過膜孔，黏附在膜的下面，計(jì)數(shù)濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)即可測出趨化因子的趨化能力。第15頁,共35頁，2024年2月25日，星期天第16頁,共35頁，2024年2月25日，星期天BoydenChamber裝置第17頁,共35頁，2024年2月25日，星期天第18頁,共35頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)步驟1.在冰盒內(nèi)將趨化因子由高濃度向低濃度稀釋，將不同濃度的趨化因子置于趨化小室的下室，30ml/孔，每個(gè)濃度加3個(gè)孔，其中只加BM的孔為陰性對照；2.取對數(shù)生長期細(xì)胞，0.1%BM重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml；3.加樣：下室加不同濃度的趨化因子，將膜輕輕對折后展平，光面朝下毛面朝上，依次蓋上膠墊和上室將螺絲對稱擰上擰緊;在上室中加入細(xì)胞，50ml/孔，每個(gè)濃度加3個(gè)孔；第19頁,共35頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)步驟4.將趨化小室在37℃，5%CO2的孵化箱中孵育3h；5.在膜的兩端加上夾子，毛面在PBS液面上蘸取，光面禁止碰到液體。毛面在架子上摩擦，再蘸取PBS，反復(fù)3次后再蘸取一次，晾干；6.固定,染色第20頁,共35頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)步驟7.取載玻片，剪角放在右上角，滴一滴石蠟，蓋玻片封片；8.顯微鏡觀察計(jì)數(shù)，每孔至少3個(gè)隨機(jī)視野，3個(gè)孔的數(shù)值取平均值;作柱狀圖，縱軸趨化指數(shù)或細(xì)胞數(shù)，橫軸組別；9.趨化指數(shù)(ChemotaxisIndex)=隨著趨化誘導(dǎo)因子的濃度梯度而遷移的細(xì)胞數(shù)目/用培養(yǎng)基做對照的遷移細(xì)胞數(shù)目第21頁,共35頁，2024年2月25日，星期天注意事項(xiàng)1.膜，膠墊，上下小室之間防止有氣泡產(chǎn)生；2.放膜時(shí)要對準(zhǔn)位置，過多調(diào)整位置，易發(fā)生交叉污染。3.槍垂直，槍尖伸入孔中下大概4/5處，迅速加樣，不要遲疑，打出液體的過程槍逐漸抬起，液體全部打出時(shí)槍尖離開液面。4.洗膜時(shí)注意，不要把細(xì)胞面與非細(xì)胞面弄反。第22頁,共35頁，2024年2月25日，星期天第23頁,共35頁，2024年2月25日，星期天第24頁,共35頁，2024年2月25日，星期天第25頁,共35頁，2024年2月25日，星期天第26頁,共35頁，2024年2月25日，星期天腫瘤細(xì)胞侵襲試驗(yàn)MatrigelInvassionAssayTranswell系統(tǒng)Transwell小室0.4um孔徑聚碳酯膜的掃描電鏡第27頁,共35頁，2024年2月25日，星期天原理

人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel，是一種細(xì)胞外基質(zhì)，4℃時(shí)是液體，在37℃

會(huì)逐漸凝固成膠狀。主要成分為層黏連蛋白和Ⅳ型膠原，能在培養(yǎng)基中重建形成膜結(jié)構(gòu)，這種膜結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似。第28頁,共35頁，2024年2月25日，星期天濾膜孔徑一般為8mm，而且膜孔都被Matrigel覆蓋，細(xì)胞不能自由穿過，必須分泌水解酶，并通過變形運(yùn)動(dòng)才能穿過這種鋪有Martrigel的濾膜，這與體內(nèi)情況較為相似。原理Transwell

電鏡圖片第29頁,共35頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)1.無菌條件下Matrigel于冰浴融化，用PBS（或DMEMonly培養(yǎng)基）稀釋成1mg/ml濃度，-20°C凍存?zhèn)溆茫?.取出已稀釋好的Matrigel，冰浴融化，以50ml的體積鋪于Tramwell小室（24孔板）聚碳酸酯膜上（注意：體積不可太大，以剛把聚碳酸酯膜浸濕為最好），37°C放置lh，使Matrigel聚合成凝膠（注意：加基質(zhì)膠時(shí)最好將24孔板放置在冰盒上，確保膠完全覆蓋孔底，不要有氣泡）；第30頁,共35頁，2024年2月25日，星期天3.每孔加入200ml1640（或DMEM）培養(yǎng)基使膠重構(gòu)；4.在Transwell下室中加入趨化因子或10%FBS培養(yǎng)基600ml/孔；5.在上室孔中準(zhǔn)確加入細(xì)胞l×105

個(gè)/孔，細(xì)胞懸液體積200ml，置于5%CO2

培養(yǎng)箱于37°C培養(yǎng)24h（注意：細(xì)胞量和時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件摸索）；6.待培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后，棄去上室液體，小心取出上室，用濕棉簽擦去膜上未穿過膜的細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)①Transwell小室②上層培養(yǎng)液③細(xì)胞④基質(zhì)膠⑤下層培養(yǎng)液⑥細(xì)胞培養(yǎng)板

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)示意圖第31頁,共35頁，2024年2月25日，星期天7.4%中性甲醛固定10分鐘，Giemsa染色10分鐘，PBS洗滌3次，干燥，取下微孔濾膜，倒置顯微鏡下直接觀察穿過膜的細(xì)胞(200×)；8.每張膜中央部分和周圍部分各隨機(jī)取3個(gè)視