GB-T殼聚糖含量測(cè)定 高效液相色譜法征求意見(jiàn)稿

ICS07.080

A21

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—201X

殼聚糖含量測(cè)定高效液相色譜法

Determinationofchitosancontent—Highperformanceliquid

chromatography

（征求意見(jiàn)稿）

201X-XX-XX發(fā)布201X-XX-XX實(shí)施

國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局

中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)

1

2

殼聚糖含量測(cè)定高效液相色譜法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了殼聚糖含量測(cè)定高效液相色譜法的原理、試劑或材料、儀器設(shè)備、測(cè)定步驟和結(jié)

果計(jì)算。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于殼聚糖含量的測(cè)定。

本方法檢出限為0.30mg/mL，定量限為0.45mg/mL。

2規(guī)范性引用文件

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T20365硫酸軟骨素和鹽酸氨基葡萄糖含量的測(cè)定

GB/T601化學(xué)試劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備

GB/T603化學(xué)試劑試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備

3術(shù)語(yǔ)與定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

殼聚糖chitosan

幾丁質(zhì)脫去N-乙酰基55%以上的物質(zhì)。

4原理

殼聚糖原料乙?；玫郊讱に兀謩e降解殼聚糖原料和合成后得到的甲殼素，得到含有氨基葡

萄糖鹽酸鹽的樣品溶液，采用高效液相色譜法檢測(cè)氨基葡萄糖鹽酸鹽含量，分別計(jì)算殼聚糖純度

（X）和甲殼素純度（Y），Y與X比值得到比例系數(shù)，通過(guò)比例系數(shù)計(jì)算殼聚糖含量。

5試劑或材料

除非另有規(guī)定，所有試劑均為分析純。

5.1水：GB/T6682一級(jí)。

5.2乙腈：色譜純。

5.3鹽酸：質(zhì)量分?jǐn)?shù)36%~38%。

5.4氮?dú)猓杭兌取?9.9%。

5.5氨基葡萄糖鹽酸鹽：純度≥99%。

5.6甲殼素：純度≥99%。

3

5.7乙腈-水溶液

精密量取800mL乙腈和200mL水，混合均勻。

5.80.1mol/L碳酸鈉溶液

精密稱(chēng)取2.65g無(wú)水碳酸鈉，加水溶解并轉(zhuǎn)移至250ml容量瓶，定容至刻度，搖勻。

5.9鹽酸溶液

精密量取4.2ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36%~38%的鹽酸，加水稀釋定容至500ml容量瓶中，搖勻。

5.10氫氧化鈉溶液

精密稱(chēng)取2g氫氧化鈉，加水溶解并轉(zhuǎn)移至500ml容量瓶，定容至刻度，搖勻。

5.11甲基橙指示劑

精密稱(chēng)取0.02g甲基橙，加水溶解并轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶，定容至刻度，搖勻。

5.12亞甲基藍(lán)指示劑

精密稱(chēng)取0.1g亞甲基藍(lán)，溶于乙醇并轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶，定容至刻度，搖勻。

5.13甲基橙-亞甲基藍(lán)指示劑

取甲基橙指示劑和亞甲基藍(lán)指示劑各50ml，混合搖勻。

6儀器設(shè)備

6.1高效液相色譜儀：配有蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。

6.2色譜柱：250mm×4.6mm，5μm。

6.3無(wú)菌注射器。

6.4有機(jī)相微孔濾膜：0.45μm。

6.5電子分析天平：感量：0.1mg、0.001mg。

6.6集熱式磁力恒溫?cái)嚢杵鳌?/p>

6.7恒溫磁力攪拌器。

6.8旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

6.9冷凍干燥機(jī)。

8測(cè)定步驟

7.1樣品處理

固體樣品：用“四分法”縮分至約50g樣品，混勻，備用。

液體樣品：將試樣冷凍干燥或烘干成固體，研磨成粉末，裝入樣品瓶中，混勻，備用。

7.2測(cè)定

7.2.1色譜條件

a)檢測(cè)器：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD檢測(cè)條件：T為60℃，高純N2流速1.5L/min）；

4

b)色譜柱：ZORBAXNH2(250mm×4.6mm，5μm)；

c)流動(dòng)相：乙腈-水（80:20，V/V）；

d)流速：1.0mL/min；

e)進(jìn)樣量：20μL；

f)柱溫：30℃。

7.2.2氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

精密稱(chēng)定氨基葡萄糖鹽酸鹽206.6mg（精確到0.1mg），置于小燒杯中，加少量水溶解并轉(zhuǎn)移

至50mL容量瓶中，清洗轉(zhuǎn)移三次，定容，搖勻，配制成濃度為4.132mg/mL的氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)

準(zhǔn)品溶液，4℃低溫保存，備用。

7.2.3氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

取氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，精密量定，置于容量瓶中，加水定容，搖勻，配制成濃

度為3.5122mg/mL的氨基葡萄糖鹽酸鹽溶液，取適量此氨基葡萄糖鹽酸鹽溶液進(jìn)一步稀釋?zhuān)来?/p>

得到一系列梯度濃度為3.0164、2.4792、2.066、1.4875、1.033、0.4958mg/mL的氨基葡萄糖鹽酸

鹽稀釋溶液，按照色譜分析條件進(jìn)樣，HPLC測(cè)定其峰面積，并以縱坐標(biāo)峰面積積分值Y對(duì)橫坐標(biāo)

氨基葡萄糖鹽酸鹽濃度X作線(xiàn)性回歸方程，得到氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

7.2.4酸堿濃度的標(biāo)定

準(zhǔn)確量取10mL鹽酸溶液于小燒杯中，加入2~3滴甲基橙指示劑，用0.1mol/L的碳酸鈉溶液

進(jìn)行滴定，指示劑由紅色變?yōu)辄S色，停止滴定，記錄消耗的碳酸鈉溶液的體積，計(jì)算鹽酸溶液的濃

度。

準(zhǔn)確量取10mL氫氧化鈉溶液于小燒杯中，加入2~3滴甲基橙指示劑，用上述已標(biāo)定濃度的鹽

酸溶液進(jìn)行滴定，指示劑由黃色變?yōu)槌壬?，停止滴定，記錄消耗的鹽酸溶液體積，計(jì)算氫氧化鈉溶

液的溶度。

7.2.5殼聚糖脫乙酰度測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取殼聚糖樣品0.2g于小燒杯中，加入30ml標(biāo)定的鹽酸溶液，并置于恒溫磁力攪拌器上

攪拌至溶解，加入2~3滴甲基橙-亞甲基藍(lán)指示劑，用標(biāo)定的氫氧化鈉溶液滴定樣品溶液中過(guò)量的

鹽酸，當(dāng)指示劑顏色由紫色變?yōu)榈G色，停止滴定，記錄消耗的氫氧化鈉溶液體積，計(jì)算殼聚糖的

脫乙酰度。

7.2.6甲殼素樣品制備

5

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.3g殼聚糖樣品置于250mL圓底燒瓶中，加入100mL甲醇溶液，1.5mL乙酸酐，置于

恒溫磁力攪拌器上室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮回收甲醇，濃縮液置于

冷凍干燥儀上干燥得甲殼素樣品。按照此步驟，分別對(duì)不同脫乙酰度的殼聚糖進(jìn)行乙?；幚怼?/p>

7.2.7甲殼素/殼聚糖降解與樣品溶液的配制

精密稱(chēng)取甲殼素/殼聚糖50mg，置于50mL圓底燒瓶中，分別加入3.0mL鹽酸和0.5mL水，并

置于集熱式磁力恒溫?cái)嚢杵髦刑荻壬郎亟到猓?5℃反應(yīng)1.5h，75℃反應(yīng)1.5h，100℃反應(yīng)3~4h。反

應(yīng)結(jié)束后，去除剩余鹽酸，加少量水溶解，并轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，洗滌三次，定容，搖勻。按

照上述方法，依次對(duì)不同脫乙酰度的殼聚糖進(jìn)行降解得到一系列樣品溶液，4℃低溫保存，備用。

7.2.8樣品溶液中氨基葡萄糖鹽酸鹽含量測(cè)定

用無(wú)菌注射器取上述8.6降解樣品溶液適量，過(guò)0.45μm有機(jī)相微孔濾膜，按照色譜分析條件，

進(jìn)樣分析，測(cè)定其峰面積積分值，計(jì)算降解樣品溶液中氨基葡萄糖鹽酸鹽的含量。

7.2.9樣品溶液中的單糖含量測(cè)定

精密稱(chēng)取1.0g殼聚糖樣品，加10mL水充分溶解，過(guò)濾，濾液中滴加1~2滴鹽酸，過(guò)0.45μm

有機(jī)相微孔濾膜，按照色譜分析條件，進(jìn)樣分析，測(cè)定其峰面積積分值，計(jì)算樣品溶液中單糖含量。

7.2.10標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

以峰面積積分值mAu為縱坐標(biāo)Y，以氨基葡萄糖鹽酸鹽濃度Ce（mg/mL）為橫坐標(biāo)X作標(biāo)準(zhǔn)

曲線(xiàn)，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

8結(jié)果計(jì)算

殼聚糖含量按公式（1）計(jì)算：

………………..……….…………（1）

?1×50×??

?3=?1?1×(1??2)×100%??1

w3——?dú)ぞ厶呛浚?）；

c1——由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得的氨基葡萄糖鹽酸鹽的濃度（mg/mL）；

50——樣品溶液體積（mL）；

Mi—