GB-T殼聚糖含量測定 高效液相色譜法征求意見稿

ICS07.080

A21

中華人民共和國國家標準

GB/TXXXXX—201X

殼聚糖含量測定高效液相色譜法

Determinationofchitosancontent—Highperformanceliquid

chromatography

（征求意見稿）

201X-XX-XX發(fā)布201X-XX-XX實施

國家市場監(jiān)督管理總局

中國國家標準化管理委員會

1

2

殼聚糖含量測定高效液相色譜法

1范圍

本標準規(guī)定了殼聚糖含量測定高效液相色譜法的原理、試劑或材料、儀器設備、測定步驟和結

果計算。

本標準適用于殼聚糖含量的測定。

本方法檢出限為0.30mg/mL，定量限為0.45mg/mL。

2規(guī)范性引用文件

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB/T20365硫酸軟骨素和鹽酸氨基葡萄糖含量的測定

GB/T601化學試劑標準滴定溶液的制備

GB/T603化學試劑試驗方法中所用制劑及制品的制備

3術語與定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

殼聚糖chitosan

幾丁質脫去N-乙酰基55%以上的物質。

4原理

殼聚糖原料乙酰化得到甲殼素，分別降解殼聚糖原料和合成后得到的甲殼素，得到含有氨基葡

萄糖鹽酸鹽的樣品溶液，采用高效液相色譜法檢測氨基葡萄糖鹽酸鹽含量，分別計算殼聚糖純度

（X）和甲殼素純度（Y），Y與X比值得到比例系數，通過比例系數計算殼聚糖含量。

5試劑或材料

除非另有規(guī)定，所有試劑均為分析純。

5.1水：GB/T6682一級。

5.2乙腈：色譜純。

5.3鹽酸：質量分數36%~38%。

5.4氮氣：純度≥99.9%。

5.5氨基葡萄糖鹽酸鹽：純度≥99%。

5.6甲殼素：純度≥99%。

3

5.7乙腈-水溶液

精密量取800mL乙腈和200mL水，混合均勻。

5.80.1mol/L碳酸鈉溶液

精密稱取2.65g無水碳酸鈉，加水溶解并轉移至250ml容量瓶，定容至刻度，搖勻。

5.9鹽酸溶液

精密量取4.2ml質量分數為36%~38%的鹽酸，加水稀釋定容至500ml容量瓶中，搖勻。

5.10氫氧化鈉溶液

精密稱取2g氫氧化鈉，加水溶解并轉移至500ml容量瓶，定容至刻度，搖勻。

5.11甲基橙指示劑

精密稱取0.02g甲基橙，加水溶解并轉移至100ml容量瓶，定容至刻度，搖勻。

5.12亞甲基藍指示劑

精密稱取0.1g亞甲基藍，溶于乙醇并轉移至100ml容量瓶，定容至刻度，搖勻。

5.13甲基橙-亞甲基藍指示劑

取甲基橙指示劑和亞甲基藍指示劑各50ml，混合搖勻。

6儀器設備

6.1高效液相色譜儀：配有蒸發(fā)光散射檢測器。

6.2色譜柱：250mm×4.6mm，5μm。

6.3無菌注射器。

6.4有機相微孔濾膜：0.45μm。

6.5電子分析天平：感量：0.1mg、0.001mg。

6.6集熱式磁力恒溫攪拌器。

6.7恒溫磁力攪拌器。

6.8旋轉蒸發(fā)儀。

6.9冷凍干燥機。

8測定步驟

7.1樣品處理

固體樣品：用“四分法”縮分至約50g樣品，混勻，備用。

液體樣品：將試樣冷凍干燥或烘干成固體，研磨成粉末，裝入樣品瓶中，混勻，備用。

7.2測定

7.2.1色譜條件

a)檢測器：蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD檢測條件：T為60℃，高純N2流速1.5L/min）；

4

b)色譜柱：ZORBAXNH2(250mm×4.6mm，5μm)；

c)流動相：乙腈-水（80:20，V/V）；

d)流速：1.0mL/min；

e)進樣量：20μL；

f)柱溫：30℃。

7.2.2氨基葡萄糖鹽酸鹽標準品溶液配制

精密稱定氨基葡萄糖鹽酸鹽206.6mg（精確到0.1mg），置于小燒杯中，加少量水溶解并轉移

至50mL容量瓶中，清洗轉移三次，定容，搖勻，配制成濃度為4.132mg/mL的氨基葡萄糖鹽酸鹽標

準品溶液，4℃低溫保存，備用。

7.2.3氨基葡萄糖鹽酸鹽標準曲線的繪制

取氨基葡萄糖鹽酸鹽標準品溶液適量，精密量定，置于容量瓶中，加水定容，搖勻，配制成濃

度為3.5122mg/mL的氨基葡萄糖鹽酸鹽溶液，取適量此氨基葡萄糖鹽酸鹽溶液進一步稀釋，依次

得到一系列梯度濃度為3.0164、2.4792、2.066、1.4875、1.033、0.4958mg/mL的氨基葡萄糖鹽酸

鹽稀釋溶液，按照色譜分析條件進樣，HPLC測定其峰面積，并以縱坐標峰面積積分值Y對橫坐標

氨基葡萄糖鹽酸鹽濃度X作線性回歸方程，得到氨基葡萄糖鹽酸鹽標準曲線。

7.2.4酸堿濃度的標定

準確量取10mL鹽酸溶液于小燒杯中，加入2~3滴甲基橙指示劑，用0.1mol/L的碳酸鈉溶液

進行滴定，指示劑由紅色變?yōu)辄S色，停止滴定，記錄消耗的碳酸鈉溶液的體積，計算鹽酸溶液的濃

度。

準確量取10mL氫氧化鈉溶液于小燒杯中，加入2~3滴甲基橙指示劑，用上述已標定濃度的鹽

酸溶液進行滴定，指示劑由黃色變?yōu)槌壬?，停止滴定，記錄消耗的鹽酸溶液體積，計算氫氧化鈉溶

液的溶度。

7.2.5殼聚糖脫乙酰度測定

準確稱取殼聚糖樣品0.2g于小燒杯中，加入30ml標定的鹽酸溶液，并置于恒溫磁力攪拌器上

攪拌至溶解，加入2~3滴甲基橙-亞甲基藍指示劑，用標定的氫氧化鈉溶液滴定樣品溶液中過量的

鹽酸，當指示劑顏色由紫色變?yōu)榈G色，停止滴定，記錄消耗的氫氧化鈉溶液體積，計算殼聚糖的

脫乙酰度。

7.2.6甲殼素樣品制備

5

準確稱取1.3g殼聚糖樣品置于250mL圓底燒瓶中，加入100mL甲醇溶液，1.5mL乙酸酐，置于

恒溫磁力攪拌器上室溫攪拌反應24h，反應結束后，用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮回收甲醇，濃縮液置于

冷凍干燥儀上干燥得甲殼素樣品。按照此步驟，分別對不同脫乙酰度的殼聚糖進行乙酰化處理。

7.2.7甲殼素/殼聚糖降解與樣品溶液的配制

精密稱取甲殼素/殼聚糖50mg，置于50mL圓底燒瓶中，分別加入3.0mL鹽酸和0.5mL水，并

置于集熱式磁力恒溫攪拌器中梯度升溫降解，55℃反應1.5h，75℃反應1.5h，100℃反應3~4h。反

應結束后，去除剩余鹽酸，加少量水溶解，并轉移至50mL容量瓶中，洗滌三次，定容，搖勻。按

照上述方法，依次對不同脫乙酰度的殼聚糖進行降解得到一系列樣品溶液，4℃低溫保存，備用。

7.2.8樣品溶液中氨基葡萄糖鹽酸鹽含量測定

用無菌注射器取上述8.6降解樣品溶液適量，過0.45μm有機相微孔濾膜，按照色譜分析條件，

進樣分析，測定其峰面積積分值，計算降解樣品溶液中氨基葡萄糖鹽酸鹽的含量。

7.2.9樣品溶液中的單糖含量測定

精密稱取1.0g殼聚糖樣品，加10mL水充分溶解，過濾，濾液中滴加1~2滴鹽酸，過0.45μm

有機相微孔濾膜，按照色譜分析條件，進樣分析，測定其峰面積積分值，計算樣品溶液中單糖含量。

7.2.10標準曲線繪制

以峰面積積分值mAu為縱坐標Y，以氨基葡萄糖鹽酸鹽濃度Ce（mg/mL）為橫坐標X作標準

曲線，求回歸方程和相關系數。

8結果計算

殼聚糖含量按公式（1）計算：

………………..……….…………（1）

?1×50×??

?3=?1?1×(1??2)×100%??1

w3——殼聚糖含量（%）；

c1——由標準曲線查得的氨基葡萄糖鹽酸鹽的濃度（mg/mL）；

50——樣品溶液體積（mL）；

Mi—