(高清版)GBT 41727-2022 農(nóng)用微生物菌劑功能評價技術規(guī)程

農(nóng)用微生物菌劑功能評價技術規(guī)程2022-10-12發(fā)布I本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由中國石油和化學工業(yè)聯(lián)合會提出。本文件由全國肥料和土壤調理劑標準化技術委員會(SAC/TC105)歸口。本文件起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所、上海化工院檢測有限公司。本文件主要起草人：關大偉、李俊、姜昕、馬鳴超、曹鳳明、李力、楊小紅、陳慧君、楊一、葛一凡、馮瑞華。1農(nóng)用微生物菌劑功能評價技術規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了農(nóng)用微生物菌劑功能評價的菌劑樣品要求、評價內容、評價程序、評價項目與測定方法、結果判定和評價報告格式。本文件適用于農(nóng)用微生物菌劑的功能評價。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB5009.268食品安全國家標準食品中多元素的測定GB20287農(nóng)用微生物菌劑GB/T32951有機肥料中土霉素、四環(huán)素、金霉素與強力霉素的含量測定高效液相色譜法GB/T40226環(huán)境微生物宏基因組檢測高通量測序法GB/T41728微生物肥料質量安全評價通用準則NY/T295中性土壤陽離子交換量和交換性鹽基的測定NY/T395農(nóng)田土壤環(huán)境質量監(jiān)測技術規(guī)范NY/T525有機肥料NY/T1121.1土壤檢測第1部分：土壤樣品的采集、處理和貯存NY/T1121.2土壤檢測第2部分：土壤pH的測定NY/T1121.4土壤檢測第4部分：土壤容重的測定NY/T1121.5土壤檢測第5部分：石灰性土壤陽離子交換量的測定NY/T1121.6土壤檢測第6部分：土壤有機質的測定NY/T1121.16土壤檢測第16部分：土壤水溶性鹽總量的測定NY/T1121.19土壤檢測第19部分：土壤水穩(wěn)性大團聚體組成的測定NY/T1536微生物肥料田間試驗技術規(guī)程及肥效評價指南NY/T1735根瘤菌生產(chǎn)菌株質量評價技術規(guī)范NY/T1736微生物肥料菌種鑒定技術規(guī)范NY/T1847微生物肥料生產(chǎn)菌株質量評價通用技術要求NY/T2272土壤調理劑鈣、鎂、NY/T2321微生物肥料產(chǎn)品檢驗規(guī)程NY/T2722秸稈腐熟菌劑腐解效果評價技術規(guī)程NY/T3082水果、蔬菜及其制品中葉綠素含量的測定分光光度法NY/T3442畜禽糞便堆肥技術規(guī)范NY/T3606地理標志農(nóng)產(chǎn)品品質鑒定與質量控制技術規(guī)范谷物類23術語和定義下列術語和定義適用于本文件。目標微生物(有效菌)經(jīng)過工業(yè)化生產(chǎn)擴繁后加工而成的活菌制劑。注1:農(nóng)用微生物菌劑具有直接或間接改良土壤、恢復地力，維持根際微生物區(qū)系平衡，降解有毒、有害物質的作用；應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，通過其中所含微生物的生命活動，增加植物養(yǎng)分的供應量或促進植物生長、改善農(nóng)產(chǎn)品品質及農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境。注2:依據(jù)菌劑產(chǎn)品中特定的微生物種類或作用機理可分為根瘤菌菌劑、光合細菌菌劑、菌根菌菌劑、溶磷類菌劑、硅酸鹽菌劑、植物促生菌劑、土壤修復菌劑、有機物料腐熟劑以及提高作物抗逆性菌劑等。用于吸附目的微生物，并且適宜其存活，對人、動植物和環(huán)境安全的固體物料。菌劑功能評價functionalevaluationformicrobialinoculant對農(nóng)用微生物菌劑進行分析、測定和評估以確定其價值或者狀態(tài)特性的過程。注：包括菌劑產(chǎn)品應用后對營養(yǎng)元素、作物、土壤、有機物料等產(chǎn)生的特定效應。4菌劑樣品要求4.1具有菌種鑒定資質或專業(yè)權威單位按照NY/T1736要求出具菌劑生產(chǎn)所用的菌種鑒定報告，且菌種的安全性符合GB/T41728的要求。4.2具有同批次的樣品檢測報告，其檢測方法和質量安全指標應符合NY/T2321、GB20287等相關標準的要求。4.3添加載體的樣品，應提供載體的配方及其物理、化學性質等資料。5評價內容5.1對作物提供和活化養(yǎng)分效果的評價。5.2對作物生長、產(chǎn)量、品質、抗逆性5.3對土壤改良和修復效果的評價。5.4對有機物料資源腐解轉化效果的評價。6評價程序6.1根據(jù)菌劑產(chǎn)品特性，制定功能評價方案，選用相應的評價項目及方法。6.2采用菌株功能評價、產(chǎn)品功能評價等方式綜合評價農(nóng)用微生物菌劑功能。菌株功能評價依據(jù)NY/T1847和本文件的要求開展，出具并提交菌株功能評價報告。產(chǎn)品功能評價應開展田間小區(qū)試驗，田間小區(qū)試驗按照NY/T1536規(guī)定實施，出具并提交產(chǎn)品功能評價報告。36.3添加載體的產(chǎn)品應開展載體功能評價，評價項目與該產(chǎn)品功能評價一致。7評價項目與測定方法評價項目與測定方法見表1。表1評價項目與測定方法評價內容評價項目測定方法提供和活化養(yǎng)分功能固氮能力按照NY/T1735的規(guī)定執(zhí)行溶磷能力按照NY/T1847和NY/T2272的規(guī)定執(zhí)行解鉀能力活化中量元素和硅元素能力活化微量元素能力按照GB5009.268的規(guī)定執(zhí)行促進作物生長、提高作物產(chǎn)量、品質、抗逆性功能作物生長評價項目包括葉綠素含量、植株干重、根干重、根冠比等葉綠素含量測定的取樣方法按照附錄A中A.2的規(guī)定執(zhí)行，其測定方法按照NY/T3082的規(guī)定執(zhí)行；植株干重、根干重、根冠比的測定方法按照附錄A的規(guī)定執(zhí)行作物產(chǎn)量按照NY/T1536的規(guī)定執(zhí)行品質評價項目依據(jù)NY/T1536和NY/T3606規(guī)定的作物種類的特征進行選用按照NY/T1536和NY/T3606的規(guī)定執(zhí)行按照NY/T1536的規(guī)定執(zhí)行土壤改良功能土壤容重按照NY/T1121.4的規(guī)定執(zhí)行按照NY/T1121.2的規(guī)定執(zhí)行土壤水穩(wěn)性大團聚體按照NY/T1121.19的規(guī)定執(zhí)行土壤陽離子交換量按照NY/T295或NY/T1121.5的規(guī)定執(zhí)行土壤鹽分含量按照NY/T1121.16的規(guī)定執(zhí)行土壤有機質含量按照NY/T1121.6的規(guī)定執(zhí)行土壤脲酶活力按照附錄B的規(guī)定執(zhí)行土壤過氧化氫酶活力按照附錄C的規(guī)定執(zhí)行土壤蔗糖酶活力按照附錄D的規(guī)定執(zhí)行土壤纖維素酶活力按照附錄E的規(guī)定執(zhí)行土壤微生物種群結構與數(shù)量按照GB/T40226的規(guī)定執(zhí)行土壤修復功能土壤中農(nóng)藥殘留量和重金屬含量按照NY/T395的規(guī)定執(zhí)行土壤中抗生素含量按照GB/T32951的規(guī)定執(zhí)行土壤有益微生物種群結構與數(shù)量按照GB/T40226的規(guī)定執(zhí)行4表1評價項目與測定方法(續(xù))評價內容評價項目測定方法有機物料腐熟功能纖維素酶活力、木聚糖酶活力、蛋白酶活力按照NY/T1847的規(guī)定執(zhí)行有機物料堆體腐熟溫度升到55℃所需時間、堆溫不低于55℃的時間按照NY/T3442的規(guī)定執(zhí)行有機物料腐熟后的種子發(fā)芽指數(shù)按照NY/T525的規(guī)定執(zhí)行有機物料失重率和秸稈斷裂拉力按照NY/T2722的規(guī)定執(zhí)行8結果判定和評價報告格式8.1結果判定農(nóng)用微生物菌劑功能評價項目測定結果符合相應標準規(guī)定，或經(jīng)統(tǒng)計分析達到顯著差異，判定該產(chǎn)品具有相應的功能。8.2評價報告格式農(nóng)用微生物菌劑功能評價匯總報告編寫格式參見附錄F。單項評價結果報告按照相應標準要求的格式撰寫，并作為匯總報告的支撐依據(jù)。5(規(guī)范性)農(nóng)用微生物菌劑促進作物生長的測定A.1田間試驗采用田間試驗方式進行菌劑促進作物生長的評價，試驗設計、試驗地選擇、試驗地處理、試驗作物品種選擇、田間管理按NY/T1536的規(guī)定執(zhí)行。A.2田間取樣在試驗作物營養(yǎng)生長最旺盛時期，每個小區(qū)連續(xù)取長勢一致的代表性植株5株～10株，包括植株的地上和地下部分。A.3.1電子天平：感量0.01g。A.3.2鼓風干燥箱。A.4參數(shù)測定A.4.1植株干重將植株地上部分放入80℃烘箱中烘干至恒重，測定其質量(m、),單位為克(g),保留一位小數(shù)。A.4.2根干重將植株根系剪下，用緩速水流反復沖洗，直至沖洗干凈。然后將其放入80℃烘箱中烘干至恒重，測定其質量(m),單位為克(g),保留一位小數(shù)。A.4.3根冠比根冠比(K)按式(A.1)計算：式中：m,——根干重，單位為克(g);m、——植株干重，單位為克(g)。A.4.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析每個小區(qū)各參數(shù)的測定結果以植株測定值的算術平均值表示。每個處理各參數(shù)的測定結果以其小區(qū)測定值的算術平均值表示。比較分析不同處理對各參數(shù)影響的平均表現(xiàn)。采用t檢驗或最小顯著性差異法，比較處理間各參數(shù)的差異顯著性。6(規(guī)范性)土壤脲酶活力的測定苯酚鈉-次氯酸鈉比色法B.1原理以尿素為基質，根據(jù)酶促產(chǎn)物氨與苯酚和次氯酸鈉作用生成藍色的靛酚，來測定脲酶活力。以1g干土24h水解尿素產(chǎn)生1mgNH?-N為1個酶活力單位，單位以U表示。B.2試劑和溶液配制除非另有說明，在分析中僅使用確認為分析純的試劑和蒸餾水或去離子水或相當純度的水。B.2.1甲苯。B.2.2尿素溶液(0.1g/mL):稱取10.0g尿素，用水溶解后定容至100mL。B.2.3檸檬酸鹽緩沖溶液(pH=6.7):184.0g檸檬酸(C?H?O?)和147.5g氫氧化鉀(KOH)分別溶于水中，然后將兩溶液混合，用0.1g/mLNaOH溶液將pH調至6.7,用水稀釋定容至1000mL。B.2.4苯酚鈉溶液(1.35mol/L):62.5g苯酚(C?H?OH)溶于少量乙醇，加入2.0mL甲醇和18.5mL丙酮后，用乙醇定容至100mL(A液);27.0g氫氧化鈉(NaOH)定容至100mL水中(B液);將A液、B液各取20.0mL混合，用水定容至100mL。B.2.5次氯酸鈉溶液[w(Cl)=0.9%]:稱取9.0g次氯酸鈉溶液[w(Cl)=10%],加入91.0g水后B.2.6氮標準溶液(0.1mg/mL):稱取0.4717g硫酸銨[(NH?)?SO?]溶于水后定容至1000mL,得到氮含量0.1mg/mL的標準溶液。B.2.7氮標準工作溶液(0.01mg/mL):吸取10.0mL氮標準溶液定容至100mL。B.3儀器B.3.2紫外可見分光光度計。B.3.3恒溫培養(yǎng)箱。B.4樣品采集與制備按照NY/T1121.1規(guī)定采集土壤樣品、制備試樣，風干樣品粉碎粒度應通過1mm孔徑篩。B.5分析測定警示——整個分析操作過程應在指定區(qū)域內進行。該區(qū)域應避光(直射陽光),具備相對獨立的操作臺和廢棄物存放裝置。在整個試驗過程中，操作者應按照接觸劇毒物的要求采取相應的保護措施。B.5.1標準曲線繪制分別取0mL、1.0mL、3.0mL、5.0mL、7.0mL、9.0mL、11.0mL、13.0mL氮標準工作溶液，移于50mL容量瓶中，然后加水至20mL,再加入4.0mL苯酚鈉溶液和3.0mL次氯酸鈉溶液，邊加邊搖勻，顯色20min后用水定容至50mL,配成質量濃度為0mg/mL、0.0002mg/mL、0.0006mg/mL、0.0010mg/mL、0.0014mg/mL、0.0018mg/mL、0.0022mg/mL和0.0026mg/mL氮系列標準溶液。1h內，以0mg/mL氮標準溶液為空白調零，在578nm波長處測定氮系列標準溶液吸光度。以吸7GB/T41727—2022光度值為橫坐標，對應的氮質量濃度為縱坐標，繪制標準曲線。B.5.2樣品測定稱取土壤樣品5.0g(精確到0.0001g),放入50mL錐形瓶中，加1.0mL甲苯，搖勻后靜置15min,再加入10.0mL尿素溶液和20.0mL檸檬酸鹽緩沖溶液，搖勻后置入37℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結束后過濾，取1.0mL濾液加入到50mL容量瓶中，再加4.0mL苯酚鈉溶液和3.0mL次氯酸鈉溶液，邊加邊搖勻。顯色20min后，用水定容至50mL。1h內，以0mg/mL氮標準溶液為空白調零，在578nm波長處測定樣品吸光度。如果樣品吸光度超過標準曲線的最大值，可增加分取倍數(shù)或減少土樣稱樣量。B.5.3無尿素空白試驗每個樣品應做無尿素空白試驗，即不加尿素溶液，以等體積的水代替尿素溶液，其他操作與B.5.2相同。B.5.4無土空白試驗每次測定應做無土空白試驗，不加土樣，其他操作與B.5.2相同。B.6結果計算土壤脲酶活力X?,單位為U,按式(B.1)計算：……(B.1)式中：pi——樣品吸光度由標準曲線求得NH?-N質量濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL);p?——無尿素空白吸光度由標準曲線求得NH?-N質量濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL);ps——無土空白吸光度由標準曲線求得NH?-N質量濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL);V——顯色液體積，單位為毫升(mL);D——分取倍數(shù)，浸出液體積/吸取濾液體積；24——時間換算系數(shù)；m——土壤樣品質量，單位為克(g);t——反應時間，單位為小時(h)。測定結果用兩次平行測定的算術平均值表示，所得結果應保留兩位小數(shù)。B.7精密度在同一實驗室，由同一操作者使用相同設備，按相同的測試方法，并在短時間內對同一被測對象相互獨立進行測試，獲得的兩次獨立測試結果的絕對差值不大于這兩個測定值的算術平均值的20%,以大于這兩個測定值的算術平均值的20%的情況不超過5%為前提。8GB/T41727—2022(規(guī)范性)土壤過氧化氫酶活力的測定高錳酸鉀滴定法C.1原理土壤過氧化氫酶能酶促過氧化氫分解水和氧氣。通過加入定量的過氧化氫與土壤作用一段時間后，用高錳酸鉀滴定酶促反應中剩余過氧化氫的量，加入量與剩余量之差即為與酶反應的量，以此來測定過氧化氫酶的活力。過氧化氫酶活力以1g干土1h內消耗的1mL0.02mol/LKMnO?為1個酶活力單位，單位以U表示。反應式為：2KMnO?+5H?O?+3H?SO?==2MnSO?+K?SO?+8H?O+5O?C.2試劑和溶液配制除非另有說明，在分析中僅使用確認為分析純的試劑和蒸餾水或去離子水或相當純度的水。C.2.1甲苯。貯存。C.2.3高錳酸鉀溶液(0.02mol/L):稱取1.70g高錳酸鉀，加水溶解后定容至500mL,避光保存，使用時用草酸標準溶液標定。C.2.4草酸標準溶液(0.1mol/L):稱取優(yōu)級純草酸(H?C?O?·2H?O)3.334g,用水溶解后定容至250mL。C.2.5過氧化氫溶液(w=3%):稱取10.0g過氧化氫溶液(w=30%),加90.0g水后混勻，置于冰箱貯存。C.3儀器C.3.1電子天平：感量0.0001g和感量0.001g。C.4樣品采集與制備按照NY/T1121.1規(guī)定采集土壤樣品、制備試樣，風干樣品粉碎粒度應通過1mm孔徑篩。C.5分析測定警示——整個分析操作過程應在指定區(qū)域內進行。該區(qū)域應避光(直射陽光),具備相對獨立的操作臺和廢棄物存放裝置。在整個試驗過程中，操作者應按照接觸劇毒物的要求采取相應的保護措施。C.5.1高錳酸鉀溶液標定吸取草酸標準溶液10.0mL加入150mL錐形瓶中，用高錳酸鉀溶液滴定至淡粉紅色終點。根據(jù)高錳酸鉀溶液的消耗量按式(C.1)計算其濃度：式中：c——高錳酸鉀溶液標定濃度，單位為摩爾每升(mol/L);V?——吸取草酸標準溶液的體積，單位為毫升(mL);9GB/T41727—2022c?——草酸標準溶液的濃度，單位為摩爾每升(mol/L);V?——滴定時消耗高錳酸鉀溶液的體積，單位為毫升(mL)。C.5.2樣品測定稱取土壤樣品5.0g(精確到0.0001g),放入100mL錐形瓶中，加入1mL甲苯，搖勻后于4℃冰箱中放置30min。取出后立刻加入冰箱貯存的過氧化氫溶液25.0mL,充分混勻后，再置于冰箱中放置1h。取出后立刻加入冰箱貯存的硫酸溶液25.0mL,搖勻后過濾。取1mL濾液于三角瓶，加入5.0mL蒸餾水和5.0mL硫酸溶液，用高錳酸鉀溶液滴定至淡粉紅色終點。C.5.3無土空白試驗每次測定應做無土空白試驗，不加土樣，其他操作與C.5.2相同。C.6結果計算土壤過氧化氫酶活力X?,單位為U,按式(C.2)計算：……(C.2)式中：V?——無土空白消耗過氧化氫溶液的體積，單位為毫升(mL);V?——土樣消耗過氧化氫溶液的體積，單位為毫升(mL);D——分取倍數(shù)，浸出液體積/吸取濾液體積；c——高錳酸鉀溶液標定濃度，單位為摩爾每升(mol/L);m——土壤樣品質量，單位為克(g);c?——高錳酸鉀溶液理論濃度，值為0.02mol/L;t——反應時間，單位為小時(h)。測定結果用兩次平行測定的算術平均值表示，所得結果應保留兩位小數(shù)。C.7精密度在同一實驗室，由同一操作者使用相同設備，按相同的測試方法，并在短時間內對同一被測對象相互獨立進行測試，獲得的兩次獨立測試結果的絕對差值不大于這兩個測定值的算術平均值的20%,以大于這兩個測定值的算術平均值的20%的情況不超過5%為前提。(規(guī)范性)土壤蔗糖酶活力的測定3,5-二硝基水楊酸比色法D.1原理蔗糖酶酶解蔗糖所生成的還原糖與3,5-二硝基水楊酸反應而生成橙色的3-氨基-5-硝基水楊酸，其顏色深度與還原糖含量相關，因而可用測定還原糖含量來表示蔗糖酶活力。土壤蔗糖酶活力以1g干土24h生成1mg葡萄糖為1個酶活力單位，單位以U表示。D.2試劑和溶液配制除非另有說明，在分析中僅使用確認為分析純的試劑和蒸餾水或去離子水或相當純度的水。D.2.1甲苯。D.2.2蔗糖溶液(0.08g/mL):稱取蔗糖(Ci?H??Oμ)8.0g,加水溶解定容至100mL。D.2.6葡萄糖溶液(1mg/mL):稱取80℃干燥至恒重的葡萄糖0.1g(精確到0.0001g)于燒杯中，用水溶解后，定容至100mL,搖勻后于4℃冰箱中保存，保存期7d。若該溶液出現(xiàn)混濁或絮狀物，應重新配制。D.2.83,5-二硝基水楊酸試劑(DNS試劑):稱取3,5-二硝基水楊酸6.3g于500mL燒杯中，用少量水溶解后，加入氫氧化鈉溶液262mL,再將其倒入500mL含有185.0g酒石酸鉀鈉(NaKC?H?O?)的熱水溶液中，然后加入5.0g結晶苯酚(C?H?OH)、5.0g無水亞硫酸鈉(Na?SO?),攪拌至溶解，冷卻后用水定容1000mL。儲存于棕色瓶中，室溫放置7d后使用，有效期6個月。D.3儀器D.3.2紫外可見分光光度計。D.4樣品采集與制備按照NY/T1121.1規(guī)定采集土壤樣品、制備試樣，風干樣品粉碎粒度應通過1mm孔徑篩。D.5分析測定警示——整個分析操作過程應在指定區(qū)域內進行。該區(qū)域應避光(直射陽光),具備相對獨立的操作臺和廢棄物存放裝置。在整個試驗過程中，操作者應按照接觸劇毒物的要求采取相應的保護措施。D.5.1標準曲線繪制分別吸取1mg/mL的葡萄糖溶液0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL于20mL具塞刻度管中，再補加蒸餾水至1.0mL,加DNS試劑3.0mL混勻，于沸水浴中準確反應5min(從水重新沸騰時算起),取出立即冷水浴冷卻至室溫后，用蒸餾水定容至20mL,配成質量濃度為0mg/mL、0.005mg/mL、0.010mg/mL、0.015mg/mL、0.020mg/mL、0.025mg/mL葡萄糖系列標準溶液。以0mg/mL葡萄糖標準溶液為空白調零，在波長540nm處測定葡萄糖系列標準溶液吸光度。以吸光度值為橫坐標，對應的葡萄糖質量濃度為縱坐標，繪制標準曲線。D.5.2樣品測定稱取土壤樣品5.0g(精確到0.0001g),置于50mL錐形瓶中，加1.0mL甲苯，搖勻后靜置15min后，再加入15.0mL蔗糖溶液和5.0mLpH5.5磷酸緩沖液。搖勻混合物后，放入恒溫培養(yǎng)箱中，在37℃下培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結束后取出，迅速過濾。吸取濾液1.0mL,加入到20mL具塞刻度管中，加3.0mLDNS試劑，于沸水浴中準確反應5min(從水重新沸騰時算起),加熱后取出立即冷水浴冷卻至室溫，用水定容至20mL。以0mg/mL葡萄糖標準溶液為空白調零，在540nm處測定樣品吸光度。如果樣品吸光度超過標準曲線的最大值，可稀釋濾液或減少土樣稱樣量。D.5.3無蔗糖空白試驗每個樣品應做無蔗糖空白試驗，不加蔗糖溶液，以等體積的蒸餾水代替蔗糖溶液，其他操作與D.5.2相同。D.5.4無土空白試驗每次測定應做無土空白試驗，不加土樣，其他操作與D.5.2相同。D.6結果計算土壤蔗糖酶活力X?,單位為U,按式(D.1)計算：p?——樣品吸光度由標準曲線求得葡萄糖質量濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL);ps——無蔗糖空白吸光度由標準曲線求得葡萄糖質量濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL);ps——無土空白吸光度由標準曲線求得葡萄糖質量濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL);V——顯色液體積，單位為毫升(mL);D——分取倍數(shù)，浸出液體積/吸取濾液體積；24——時間換算系數(shù)；m——土壤樣品質量，單位為克(g);t——反應時間，單位為小時(h)。測定結果用兩次平行測定的算術平均值表示，所得結果應保留兩位小數(shù)。D.7精密度在同一實驗室，由同一操作者使用相同設備，按相同的測試方法，并在短時間內對同一被測對象相互獨立進行測試，獲得的兩次獨立測試結果的絕對差值不大于這兩個測定值的算術平均值的20%,以大于這兩個測定值的算術平均值的20%的情況不超過5%為前提。(規(guī)范性)土壤纖維素酶活力的測定3,5-二硝基水楊酸比色法E.1原理纖維素酶解所生成的還原糖與3,5-二硝基水楊酸反應生成橙色的3-氨基-5-硝基水楊酸。顏色深度與還原糖量相關，因而可通過測定還原糖量來表示纖維素酶的活力。纖維素酶活力以1g干土72h生成1mg葡萄糖為1個酶活力單位，單位以U表示。E.2試劑和溶液配制除非另有說明，在分析中僅使用確認為分析純的試劑和蒸餾水或去離子水或相當純度的水。E.2.1甲苯。E.2.2醋酸溶液(0.2mol/L):量取11.55mL冰醋酸(p=1.05g/mL),用水定容至1000mL。E.2.3醋酸鈉溶液(0.2mol/L):稱取醋酸鈉(C?H?O?Na)16.4g(或三水合醋酸鈉C?H?O?Na·3H?O27.22g),用水溶解后定容1000mL。E.2.4醋酸鹽緩沖液(pH5.5):取醋酸溶液11.0mL和醋酸鈉溶液88.0mL,混勻即成pH5.5醋酸鹽緩沖液。E.2.5羧甲基纖維素溶液(5mg/mL):稱取羧甲基纖維素鈉0.5g,加入適量的pH5.5醋酸鹽緩沖液，加熱溶解后移入100mL容量瓶中，用pH5.5醋酸鹽緩沖液定容至100mL。E.2.63,5-二硝基水楊酸試劑(DNS試劑):配制方法見D.2.8。E.2.7葡萄糖溶液(1mg/mL):配制方法見D.2.6。E.3儀器E.3.1電子天平：感量0.0001g和感量0.01g。E.3.2紫外可見分光光度計。E.3.3恒溫培養(yǎng)箱。E.4樣品采集與制備按照NY/T1121.1規(guī)定采集土壤樣品、制備試樣，風干樣品粉碎粒度應通過1mm孔徑篩。E.5分析測定警示——整個分析操作過程應在指定區(qū)域內進行。該區(qū)域應避光(直射陽光),具備相對獨立的操作臺和廢棄物存放裝置。在整個試驗過程中，操作者應按照接觸劇毒物的要求采取相應的保護措施。E.5.1標準曲線繪制分別吸取1mg/mL的葡萄糖溶液0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL于20mL具塞刻度管中，再補加蒸餾水至1.0mL,加DNS試劑3.0mL混勻，于沸水浴中準確反應5min(從水重新沸騰時算起),取出立即冷水浴冷卻至室溫后，用水定容至20mL,配成質量濃度為0mg/mL、0.005mg/mL、0.010mg/mL、0.015mg/mL、0.020mg/mL、0.025mg/mL葡萄糖系列標準溶液。以0mg/mL葡萄糖標準溶液為空白調零，在波長540nm處測定葡萄糖系列標準溶液吸光度。以吸光度值為橫坐標，對應的葡萄糖質量濃度為縱坐標，繪制標準曲線。GB/T41727—2022E.5.2樣品測定稱取土壤樣品5.0g(精確到0.0001g),置于50mL錐形瓶中，加入1.5mL甲苯，搖勻后放置15min,再加5