眼科光學(xué) 接觸鏡和接觸鏡護(hù)理產(chǎn)品 接觸鏡結(jié)合接觸鏡護(hù)理液評(píng)價(jià)接觸鏡和護(hù)理液相互作用的細(xì)胞毒性試驗(yàn) 征求意見(jiàn)稿

1GB/TXXXXX—XXXX眼科光學(xué)接觸鏡和接觸鏡護(hù)理產(chǎn)品基于接觸鏡結(jié)合接觸鏡護(hù)理液評(píng)價(jià)其相互作用的細(xì)胞毒性試驗(yàn)本文件規(guī)定了用于評(píng)價(jià)接觸鏡與接觸鏡護(hù)理液相互作用可產(chǎn)生的潛在細(xì)胞毒性作用的一種體外試驗(yàn)方法。本文件適用于接觸鏡與接觸鏡護(hù)理液產(chǎn)品。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。ISO18369-1眼科光學(xué)接觸鏡第1部分：詞匯、分類系統(tǒng)和推薦的標(biāo)識(shí)規(guī)范（Ophthalmicoptics—Contactlenses—Part1:Vocabulary,classificationsystemandrecommendationsforlabellingspecifications）注：GB/T11417.1-2012眼科光學(xué)3術(shù)語(yǔ)和定義ISO18369-1界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1室溫roomtemperature室溫定義為18℃~25℃。4原理接觸鏡護(hù)理液中的化學(xué)物質(zhì)可能通過(guò)直接接觸或通過(guò)接觸鏡間接接觸眼部組織而引起細(xì)胞毒性反應(yīng)。接觸鏡對(duì)護(hù)理產(chǎn)品防腐劑或其他溶液成分的吸收以及這些化學(xué)物質(zhì)隨后在眼部環(huán)境中的釋放可能損害眼部的生物相容性。在設(shè)計(jì)試驗(yàn)時(shí)宜考慮接觸鏡護(hù)理產(chǎn)品和各種接觸鏡材料之間的潛在相互作用，以全面評(píng)價(jià)某種新型接觸鏡或接觸鏡護(hù)理產(chǎn)品的潛在細(xì)胞毒性。5接觸鏡結(jié)合接觸鏡護(hù)理液的直接接觸細(xì)胞毒性試驗(yàn)5.1通則2GB/TXXXXX—XXXX以下方案描述了評(píng)價(jià)浸泡在接觸鏡護(hù)理液中的接觸鏡潛在細(xì)胞毒性的試驗(yàn)方法。細(xì)胞毒性可能來(lái)自于接觸鏡和接觸鏡護(hù)理液的相互作用。除日拋型接觸鏡外，應(yīng)評(píng)價(jià)新型接觸鏡與市售代表性多功能護(hù)理液的潛在相互作用產(chǎn)生細(xì)胞毒性的可能性。為了評(píng)價(jià)新型接觸鏡護(hù)理液，應(yīng)評(píng)價(jià)新型接觸鏡護(hù)理液與代表性接觸鏡的潛在相互作用產(chǎn)生細(xì)胞毒性的可能性。5.2試驗(yàn)步驟5.2.1基本步驟將測(cè)試的接觸鏡置于裝有約10mL接觸鏡護(hù)理液的無(wú)菌相容容器中，在室溫下孵育24h±2h。同樣，在室溫下，在相同類型的容器中，將接觸鏡在約10mL的杜氏磷酸鹽緩沖液（DPBS）中孵育24h±2h，以制備用含有Ca2+和Mg2+的DPBS處理過(guò)的對(duì)照接觸鏡（“接觸鏡對(duì)照”）。本文件中，相容容器是指幾乎不吸收消毒劑和/或防腐劑的容器。用接觸鏡護(hù)理產(chǎn)品潤(rùn)洗容器可減少容器的吸收。浸泡24h±2h后，可以風(fēng)車(chē)方式切割接觸鏡（大約在接觸鏡的1/3～1/2處切3～4刀）并立即用于細(xì)胞毒性試驗(yàn)。如果不切開(kāi)接觸鏡，應(yīng)以凹入的方式置于細(xì)胞上。將每片接觸鏡置于直徑為60mm的組織培養(yǎng)板中細(xì)胞表面的中心，該培養(yǎng)板中含有近匯合單層L-929細(xì)胞，培養(yǎng)于含5%胎牛血清（FBS）的1.6mL最低限量基本培養(yǎng)基（MEM）中。同樣，將陰性和陽(yáng)性對(duì)照置于含有近匯合單層L-929細(xì)胞的直徑為60mm的組織培養(yǎng)板中，培養(yǎng)于含5%FBS的1.6mLMEM中。將組織培養(yǎng)板在37℃±1℃,5%±1％二氧化碳（CO2）培養(yǎng)24h±2h。培養(yǎng)結(jié)束后，將接觸鏡和對(duì)照組從每個(gè)培養(yǎng)板中取出，用臺(tái)盼藍(lán)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，以方便觀察死亡或受損細(xì)胞。細(xì)胞毒性的評(píng)估是通過(guò)評(píng)價(jià)測(cè)試材料和對(duì)照材料周?chē)?xì)胞在肉眼和顯微鏡下（100倍）是否有任何異常的細(xì)胞形態(tài)以及裂解，并確定裂解區(qū)（若有）。5.2.2材料5.2.2.1細(xì)胞系L-929細(xì)胞【NCTC克隆929：CCL1，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，美國(guó)弗吉尼亞州馬納薩斯；ECACCNo.88102702或等同物，歐洲認(rèn)證細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，英國(guó)威爾特郡索爾茲伯里，郵編SP40JG】。細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)不含支原體。用于試驗(yàn)的細(xì)胞的傳代數(shù)宜在10～30代以內(nèi)。5.2.2.2技術(shù)設(shè)備5.2.2.2.1培養(yǎng)箱，37℃±1℃,濕化，5%±1％二氧化碳（CO2）/空氣。5.2.2.2.2層流柜：生物安全標(biāo)準(zhǔn)。5.2.2.2.3水浴，37℃。5.2.2.2.4倒置相差顯微鏡。5.2.2.2.5實(shí)驗(yàn)室噴燈。5.2.2.2.6離心機(jī)。5.2.2.2.7實(shí)驗(yàn)室天平。5.2.2.2.8細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或血細(xì)胞計(jì)數(shù)器。5.2.2.2.9組織培養(yǎng)瓶和直徑60mm的組織培養(yǎng)板。3GB/TXXXXX—XXXX5.2.2.2.10移液器。5.2.2.2.11移液管。5.2.2.3化學(xué)物、培養(yǎng)基和血清5.2.2.3.1依格爾最低限量基本培養(yǎng)基（MEM）。5.2.2.3.2胎牛血清（FBS）。5.2.2.3.3胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）溶液。5.2.2.3.4含有Ca2+和Mg2+的杜氏磷酸鹽緩沖液（DPBS）。5.2.2.3.5青霉素/鏈霉素溶液。5.2.2.3.6臺(tái)盼藍(lán)。5.2.3測(cè)試樣品的制備接觸鏡宜用鑷子無(wú)菌拿取。在室溫下，將每個(gè)接觸鏡單獨(dú)浸泡于裝有約10mL適當(dāng)?shù)慕佑|鏡護(hù)理液的無(wú)菌相容容器中24h±2h，并輕輕攪拌（在振蕩器上以約50r/min的速度持續(xù)攪拌）。宜遵循無(wú)菌操作流程。每個(gè)接觸鏡在浸泡24h后可立即以風(fēng)車(chē)方式切割（在接觸鏡的1/3～1/2處切3～4刀）。以垂直方式取接觸鏡，并將其邊緣輕敲在無(wú)菌紗布上以去除多余的液體并立即用于細(xì)胞毒性試驗(yàn)。如果接觸鏡沒(méi)有被切割，應(yīng)以凹入的方式置于細(xì)胞上。細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法見(jiàn)5.2.4.3。5.2.4方法5.2.4.1通則細(xì)胞宜使用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行維持和培養(yǎng)。5.2.4.2試驗(yàn)質(zhì)量檢查：陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和接觸鏡對(duì)照5.2.4.2.1通用要求每組試驗(yàn)都應(yīng)包括陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和接觸鏡對(duì)照。5.2.4.2.2陽(yáng)性對(duì)照推薦使用乳膠手套作為陽(yáng)性對(duì)照。應(yīng)在每個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組織培養(yǎng)板中的細(xì)胞上放置一塊1cm×1cm的陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行試驗(yàn)。也可以使用其他經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的陽(yáng)性對(duì)照。5.2.4.2.3陰性對(duì)照推薦使用高密度聚乙烯（HDPE厚度0.5mm）作為陰性對(duì)照。應(yīng)在每個(gè)陰性對(duì)照組織培養(yǎng)板中的細(xì)胞上放置一塊1cm×1cm的陰性對(duì)照進(jìn)行試驗(yàn)。也可以使用其他經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的陰性對(duì)照。5.2.4.2.4接觸鏡對(duì)照應(yīng)將浸泡在DPBS中的被測(cè)接觸鏡作為接觸鏡對(duì)照。接觸鏡宜用鑷子無(wú)菌拿取。在室溫下，將每個(gè)接觸鏡單獨(dú)浸泡在裝有約10mLDPBS溶液的無(wú)菌相容容器中24h±2h，并輕輕攪拌（在振蕩器上以約50r/min的速度持續(xù)攪拌）。宜遵循無(wú)菌操作程序。每個(gè)接觸鏡在浸泡24h±2h后可立即以風(fēng)車(chē)方式切割（在接觸鏡的1/3～1/2處切3～4刀）。以垂直方式取接觸鏡，并將其邊緣輕敲在無(wú)菌紗布上以去除多余的液體并立即用于細(xì)胞毒性試驗(yàn)。如果鏡片沒(méi)有被切割，它應(yīng)以凹入的方式置于細(xì)胞上。細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法見(jiàn)5.2.4.3。4GB/TXXXXX—XXXX5.2.4.2.5試驗(yàn)可接受標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)滿足以下試驗(yàn)可接受標(biāo)準(zhǔn)，則試驗(yàn)有效：a)陰性對(duì)照在所有四個(gè)孔板中的等級(jí)應(yīng)≤1。b)接觸鏡對(duì)照在所有四個(gè)孔板中的等級(jí)應(yīng)≤1。c)陽(yáng)性對(duì)照在所有四個(gè)孔板中的等級(jí)應(yīng)≥3。對(duì)反應(yīng)等級(jí)的描述見(jiàn)表1。5.2.4.3試驗(yàn)步驟5.2.4.3.1將L-929細(xì)胞以每板約6×105個(gè)細(xì)胞的密度接種到直徑60mm的組織培養(yǎng)板中，置于6mL含5％FBS的MEM培養(yǎng)基中，在37℃±1℃、5%±1％CO2環(huán)境下培養(yǎng)約24h，以在使用前獲得近匯合單層細(xì)胞。如果MEM培養(yǎng)基中使用了抗生素，宜記錄在工作表中。5.2.4.3.2開(kāi)始試驗(yàn)前，在顯微鏡下（100倍）驗(yàn)證培養(yǎng)物的近匯合（約80和形態(tài)。每個(gè)測(cè)試材料和對(duì)照材料都應(yīng)在四份培養(yǎng)物中培養(yǎng)（即帶有細(xì)胞的4個(gè)60mm培養(yǎng)板）。每個(gè)板中應(yīng)只放置一個(gè)測(cè)試材料/對(duì)照材料。5.2.4.3.3將每個(gè)板中的培養(yǎng)基丟棄并用1.6mLMEM代替。5.2.4.3.4將測(cè)試材料/對(duì)照材料放在指定培養(yǎng)板中細(xì)胞表面的中心。將已在10mL接觸鏡護(hù)理液中浸泡24h±2h并可按照5.2.3中所述以風(fēng)車(chē)方式切割的接觸鏡，放置在四個(gè)60mm“待測(cè)樣品”組織培養(yǎng)板上的細(xì)胞表面中心。將1cm×1cm的乳膠（陽(yáng)性對(duì)照）放置在四個(gè)60mm“陽(yáng)性對(duì)照”組織培養(yǎng)板的細(xì)胞表面中心。將1cm×1cm的HDPE（陰性對(duì)照）放置在四個(gè)60mm“陰性對(duì)照”組織培養(yǎng)板的細(xì)胞表面中心。將已在10mLDPBS溶液中浸泡24h±2h并可按照5.2.4.2.4中所述以風(fēng)車(chē)方式切割的接觸鏡，放置在四個(gè)60mm“接觸鏡對(duì)照”組織培養(yǎng)板的細(xì)胞表面中心。為了幫助評(píng)估測(cè)試材料/對(duì)照材料的移動(dòng)情況，宜在每個(gè)板的底部在測(cè)試材料/對(duì)照材料的大致中心位置用一個(gè)點(diǎn)來(lái)標(biāo)記。5.2.4.3.5培養(yǎng)板在37℃±1℃,5%±1％CO2條件下培養(yǎng)24h±2h。在處理過(guò)程中宜格外小心，盡量減少接觸鏡的移動(dòng)，因?yàn)榭赡軙?huì)對(duì)細(xì)胞造成物理?yè)p傷。此外，如果接觸鏡沒(méi)有留在原位，則難以準(zhǔn)確測(cè)量接觸鏡周?chē)姆磻?yīng)區(qū)。5.2.4.3.6培養(yǎng)結(jié)束后，從每個(gè)板中取出接觸鏡和對(duì)照材料，并用1.6mL含0.4％臺(tái)盼藍(lán)的DPBS替換每個(gè)板中的培養(yǎng)基以染色死細(xì)胞。為了便于測(cè)量樣品以外的裂解區(qū)域，在從板中取出測(cè)試材料和對(duì)照材料之前，宜在板底部標(biāo)記測(cè)試材料和對(duì)照材料邊緣的位置。5.2.4.3.7在室溫下將細(xì)胞暴露在臺(tái)盼藍(lán)溶液中約2min。5.2.4.3.8去除臺(tái)盼藍(lán)溶液并用1.6mLDPBS沖洗細(xì)胞。5.2.4.3.9用肉眼和顯微鏡（100倍）檢查細(xì)胞是否有異常的細(xì)胞形態(tài)及測(cè)試材料和對(duì)照材料周?chē)牧呀馇闆r，并確定裂解區(qū)域（若有）。臺(tái)盼藍(lán)有助于觀察死亡或受損細(xì)胞；膜損傷和死細(xì)胞會(huì)吸收臺(tái)盼藍(lán)，因?yàn)樗且环N排斥染料。與陰性對(duì)照和接觸鏡對(duì)照板上的細(xì)胞相比，死亡或膜受損的細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色。5.2.4.3.10使用表1中描述的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估細(xì)胞毒性。如果觀察結(jié)果大于2級(jí)，則被認(rèn)為是具有細(xì)胞毒性作用。附錄A用于指導(dǎo)如何測(cè)量細(xì)胞裂解區(qū)。表1反應(yīng)性等級(jí)5GB/TXXXXX—XXXX0無(wú)123表1反應(yīng)性等級(jí)（續(xù)）46結(jié)果評(píng)估應(yīng)由有能力根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)做出判定的人員進(jìn)行結(jié)果的總體評(píng)估。任何細(xì)胞毒性作用都可能引起關(guān)注。然而，該結(jié)果主要是表明潛在的體內(nèi)毒性，不能僅根據(jù)細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)確定該器械不適于特定的臨床應(yīng)用。細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)應(yīng)根據(jù)其他生物相容性數(shù)據(jù)和產(chǎn)品的預(yù)期用途進(jìn)行評(píng)估。7試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)至少包括以下信息：a)試驗(yàn)機(jī)構(gòu)名稱和地址；b)試驗(yàn)操作者姓名；c)試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束日期；d)遵守適用的良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范的聲明；e)測(cè)試材料和所有對(duì)照材料的名稱和完整描述；f)細(xì)胞系、傳代數(shù)和細(xì)胞來(lái)源；g)培養(yǎng)基、血清和抗生素（如添加）的公司名稱和批號(hào)；h)試驗(yàn)方法；i)細(xì)胞反應(yīng)和其他觀察結(jié)果；j)結(jié)果評(píng)估所需的任何其他相關(guān)數(shù)據(jù)。6GB/TXXXXX—XXXX（規(guī)范性）接觸鏡結(jié)合接觸鏡護(hù)理液的直接接觸細(xì)胞毒性試驗(yàn)中的細(xì)胞裂解區(qū)域測(cè)量A.1培養(yǎng)板布局圖A.1描述了培養(yǎng)板的布局。其中較大的圓圈描繪了直徑為60mm的孔板。例如，假設(shè)置于孔板上的樣品的直徑約為10mm（圖A.1中的小圓圈這使得從樣品的邊緣到孔板的邊緣在任何方向都有約25mm的長(zhǎng)度。裂解區(qū)域定義為超出樣品（小圓圈）區(qū)域外的細(xì)胞裂解，如圖A.1中的對(duì)角線C所示。因此，裂解區(qū)域不宜超過(guò)25mm?？梢詮臉悠愤吘壍搅呀膺吘夁M(jìn)行多次測(cè)量，以確保用于評(píng)價(jià)的裂解區(qū)域是準(zhǔn)確的。如果裂解似乎僅在一個(gè)方向上超出接觸鏡之外（例如，如果接觸鏡在培養(yǎng)過(guò)程中移位或培養(yǎng)板略微傾斜），宜在四個(gè)方向上分別進(jìn)行測(cè)量，并宜使用這些測(cè)量值的平均值來(lái)確定等級(jí)。標(biāo)引序號(hào)說(shuō)明：A——60mm直徑孔板的水平線；B——置于孔板的約10mm舉例樣品的垂直線；C——顯示從10mm樣品邊緣到60mm直徑孔板邊緣距離為約25mm的對(duì)角線。圖A.1培養(yǎng)板布局A.20～2級(jí)——0級(jí)：無(wú)反應(yīng)性?？装逯袥](méi)有細(xì)胞裂解或毒性的證據(jù)?！?級(jí)：輕微反應(yīng)性。在放置樣品的區(qū)域（圖A.1中的小圓圈）下方有一些（部分）細(xì)胞裂解或毒性的證據(jù)?！?級(jí)：輕度反應(yīng)性。在放置樣品的區(qū)域（圖A.1中的小圓圈）下方有全部（完全）細(xì)胞裂解或毒性的證據(jù)。在確定1級(jí)或2級(jí)時(shí)，該毒性應(yīng)僅出現(xiàn)在樣品（圖A.1中的小圓圈）下方。這也表明沒(méi)有裂解區(qū)(0mm)。A.33級(jí)和4級(jí)一旦裂解超出了樣品放置在孔板中的區(qū)域（超出圖A.1和圖A.2中的小圓圈進(jìn)入大圓圈區(qū)域就會(huì)存在一個(gè)裂解區(qū)域。不超過(guò)10mm的裂解區(qū)域?yàn)?級(jí)（圖A.2中左上角的對(duì)角線A代表10mm）。大于10mm的裂解區(qū)域?yàn)?級(jí)（超出圖A.2中左上角的對(duì)角線A）?？赡艿淖畲罅呀鈪^(qū)域約為25mm（圖A.2中右上角的對(duì)角線B）。7GB/TXXXXX—XXXX標(biāo)引序號(hào)說(shuō)明：A——10mm裂解區(qū)域的對(duì)角線；B——最大可能裂解區(qū)域約為25mm的對(duì)角線。圖A.23級(jí)和4級(jí)的示意圖8GB/TXXXXX—XXXX參考文獻(xiàn)[1]ISO10993-1Biologicalevaluationofmedicaldevices—Part1:Evaluationandtestingw