第2講 植物的人工繁殖課件

上節(jié)課回顧兩個思考題1.什么是細(xì)胞工程？2.細(xì)胞工程包含哪幾個主要研究內(nèi)容第2講植物的人工繁殖第2講植物的人工繁殖例子1：蘭花組織培養(yǎng)名貴蘭花——達摩蘭：以禪宗“一花開五葉，結(jié)果自然成”的詩意命名。在臺灣，早期達摩量少，求種者多，非常昂貴；有人曾以一盆爪藝達摩交換臺中市一棟高樓。蘭花是第一個組織培養(yǎng)成功產(chǎn)業(yè)化的植物。珍稀而名貴的達摩蘭等名貴蘭花，如今已成市井之花。一株不過百元。第2講植物的人工繁殖例子2：土豆："第二面包"，"植物之王”，熱量低于谷類糧食，是理想的減肥食物，和玉米、小麥、水稻、燕麥被稱為世界五大糧食作物。欣賞一個視頻：脫毒植物的培育問題：1.傳統(tǒng)途徑存在的問題？為什么要采用組織培養(yǎng)？2.什么是組織培養(yǎng)？原理是什么？3.優(yōu)點與應(yīng)用有哪些？第2講植物的人工繁殖本節(jié)主要內(nèi)容1。組織培養(yǎng)再生植物2。人工種子本節(jié)重要問題1。細(xì)胞全能性、細(xì)胞分化與脫分化2。激素在細(xì)胞分化中的調(diào)節(jié)作用3。植物經(jīng)組織培養(yǎng)的再生途徑第2講植物的人工繁殖一理論知識回顧——生殖、細(xì)胞全能性、細(xì)胞分化、脫分化第2講植物的人工繁殖1.有性生殖（Sexualreproduction）：是兩個配子融合為一，成為合子或受精卵，再發(fā)育成為新一代個體的生殖方式。2.無性生殖（Asexualreproduction）：不涉及性別、沒有配子參與、沒有受精過程的生殖都屬于無性生殖（Asexualreproduction）。許多高等植物的營養(yǎng)器官（例如根、莖、葉等），在脫離母體后能發(fā)育成完整的植株，這種繁殖方式也稱為營養(yǎng)生殖。第2講植物的人工繁殖?3.細(xì)胞全能性(totipotency)：是指分化細(xì)胞保留著全部的核基因組，具有生物個體生長、發(fā)育所需要的全部遺傳信息，具有發(fā)育成完整個體的潛能。?細(xì)胞全能性學(xué)說：1902年，德國植物學(xué)家哈伯蘭德(Haberlandt)提出了細(xì)胞全能性學(xué)說，預(yù)言植物細(xì)胞具有全能性。?植物細(xì)胞全能性：細(xì)胞全能性首先在植物中被證實，1958年，史都華德（Steward）等利用胡蘿卜根韌皮部組織培養(yǎng)出了完整的新植株，證明高度分化的植物營養(yǎng)組織仍保持著發(fā)育成完整植株的能力，能以無性繁殖方式繁殖后代。?動物細(xì)胞全能性：動物細(xì)胞核移植實驗證明，胚胎細(xì)胞及高度分化的體細(xì)胞具有全能性。1997年克隆羊多莉的誕生為揭示動物細(xì)胞全能性做出了重大貢獻。第2講植物的人工繁殖?4.細(xì)胞分化（Differentiation）：是指細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生差異的過程，包括時間上和空間上的分化。?時間上的分化：是指一個細(xì)胞在不同的發(fā)育階段可以形成不同的形態(tài)和功能；?空間上的分化：是指同一種細(xì)胞由于所處的環(huán)境或部位不同可以形成不同的形態(tài)和功能。細(xì)胞分化能力的強弱稱為發(fā)育潛能。?形態(tài)發(fā)生（Morphogenesis）：是指通過細(xì)胞增殖、分化和行為塑造組織、器官和個體形態(tài)的過程。細(xì)胞分化與形態(tài)發(fā)生是相互聯(lián)系在一起的。?細(xì)胞分化的實質(zhì)：是基因的差異表達（Differentialexpression），是奢侈基因按照一定順序表達的結(jié)果。第2講植物的人工繁殖?奢侈基因（Luxurygene）：又稱組織特異性基因（Tissue-specificgene），是在各種組織中進行不同的選擇性表達的基因，與各類細(xì)胞的特殊性有直接關(guān)系。?持家基因（House-keepinggene）：是維持細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)和最低限度功能所不可少的基因，例如：編碼組蛋白、核糖體蛋白、線粒體蛋白、糖酵解酶等基因。這類基因在所有類型的細(xì)胞中都表達。第2講植物的人工繁殖?5.脫分化（Dedifferentiation）：又稱去分化，是指分化細(xì)胞失去特有的結(jié)構(gòu)和功能變?yōu)榫哂形捶只?xì)胞特性的過程，即分化的細(xì)胞在適當(dāng)條件下轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝誀顟B(tài)而重新獲得分裂能力的過程。?脫分化后的植物細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞分裂，產(chǎn)生無組織結(jié)構(gòu)、無明顯極性的松散的細(xì)胞團，稱之為愈傷組織（Callus）。?需要采用人工誘導(dǎo)技術(shù)誘導(dǎo)體細(xì)胞的脫分化。不同生物的細(xì)胞脫分化能力不同，決定了組織培養(yǎng)再生的難易。第2講植物的人工繁殖第2講植物的人工繁殖植物人工繁殖技術(shù)目地：為克服自然有性生殖的不足，滿足對優(yōu)良植物的大量需求手段：通過無性繁殖技術(shù)實現(xiàn)植物快速繁殖。第2講植物的人工繁殖植物人工繁殖的方法：組織培養(yǎng)、人工種子、胚胎培養(yǎng)等第2講植物的人工繁殖一、植物組織培養(yǎng)再生植物植物組織培養(yǎng)（Planttissueculture）是將植物器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體等外植體材料無菌條件下培養(yǎng)在人工培養(yǎng)基上，在適當(dāng)條件下誘發(fā)長成完整植株的一種技術(shù)。第2講植物的人工繁殖上節(jié)課預(yù)習(xí)思考題：為什么植物組織培養(yǎng)能實現(xiàn)植物大規(guī)模繁殖？與傳統(tǒng)繁殖途徑的優(yōu)點在哪里？第2講植物的人工繁殖（一）植物組織培養(yǎng)的優(yōu)點?1.周期短，便于人工控制培養(yǎng)條件。繁殖速度快，經(jīng)濟效益高。?2.占用空間小，不受地區(qū)、季節(jié)限制。?3.繁殖珍稀、瀕危苗木和突變體，是優(yōu)良品種培育的有效途徑。?4.利于保持原來品種的特性。第2講植物的人工繁殖（二）植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用1.無性系快速繁殖：例如一株蘭花一年可以繁殖到400萬株。2.種苗脫毒：可以有效地培育出大量的無病毒種苗。已經(jīng)取得成功的有馬鈴薯、草莓、香蕉等。3.新品種選育

（1）

利用培養(yǎng)變異，篩選優(yōu)良突變體。

植物離體培養(yǎng)，能夠明顯提高突變率，并且會有各種各樣的生理和形態(tài)突變，如株高、花色、植株形態(tài)、生育期、耐性等等?？梢詮闹羞x擇優(yōu)良突變體，培育新品種。

（2）利用遠(yuǎn)緣雜交幼胚培養(yǎng)，獲得雜種植株，克服其雜交不親和性。

有些植物遠(yuǎn)緣雜交，能正常受精，但受精胚往往敗育。此種情況下，可以將幼胚在敗育前進行離體培養(yǎng)，以獲得緣遠(yuǎn)雜種植株。

（3）利用細(xì)胞融合技術(shù)，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性。

野生種往往有許多優(yōu)良性狀，如抗干旱、抗病蟲害、耐澇、耐瘠薄、耐鹽堿、抗凍等特性。但大部分野生種與栽培種雜交不親和，嚴(yán)重影響了野生種優(yōu)良遺傳基因的應(yīng)用。利用細(xì)胞融合，可以克服這種雜交不親和性，獲得體細(xì)胞雜種，使野生種的利用成為可能。

（4）倍性育種第2講植物的人工繁殖4.離體種質(zhì)保存

隨著地球不斷開發(fā)、生態(tài)環(huán)境破壞，種植資源日趨枯竭，大量有用基因損失。利用組織培養(yǎng)法，低溫保存（-196℃）或試管保存，為保存和搶救瀕臨滅絕的生物帶來希望。

5.在遺傳、生理生化和病理等研究上的應(yīng)用。如光合作用、植物營養(yǎng)問題、植物抗病性等等。第2講植物的人工繁殖（三）植物組織培養(yǎng)技術(shù)1.生物條件外植體（Explant）主要指用于離體培養(yǎng)的植物或組織切段。因素：不同植物品種同一品種不同取材部位、發(fā)育階段。一般：生長點、幼嫩組織第2講植物的人工繁殖2.物理條件：培養(yǎng)環(huán)境、組織培養(yǎng)室無菌環(huán)境，人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。需要一定的設(shè)備、器材和用具。第2講植物的人工繁殖?3.化學(xué)條件：培養(yǎng)基?（1）無機鹽?培養(yǎng)基中無機鹽的濃度通常在25mmol/L左右。?根據(jù)添加量多少分為大量元素（濃度大于0.5mmol/L）和微量元素(濃度低于0.5mmol/L)。?大量元素：主要有氮、硫、磷、鉀、鈣、鎂。氮、硫、磷是蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸和酶的主要成分。?微量元素：主要包括鐵、錳、銅、鋅、氯、硼、鉬等。這些微量元素對于蛋白或酶的生物活性十分重要，并參與生物過程的調(diào)節(jié)第2講植物的人工繁殖（2）有機物常用的有機物：糖類、氨基酸、維生素、醇類等。?糖類：是離體培養(yǎng)的植物細(xì)胞所必需的，既可以作為碳源，又可以維持滲透壓。最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。蔗糖使用濃度在2%—3%。?氨基酸：是很好的有機氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用。培養(yǎng)基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。通常采用蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物（包括酪蛋白水解物）、谷氨酰胺或氨基酸混合物。第2講植物的人工繁殖?維生素：以各種輔酶的形式參與多種代謝活動，對生長、分化等有很好的促進作用。雖然大多數(shù)的植物細(xì)胞在培養(yǎng)中都能合成所必需的維生素，但在數(shù)量上不足，通常需加入一至數(shù)種維生素。常用的維生素包括：鹽酸硫胺素（Thiamine,VB1）、鹽酸吡哆醇Pyridoxin,VB6）、Vc（抗壞血酸）、有時還使用生物素、葉酸、VB12等。VB1對愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有重要作用，VB6能促進根的生長。Vc有防止組織變褐的作用。?肌醇：對糖類的相互轉(zhuǎn)化有促進作用。能促進愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進作用，對細(xì)胞壁的形成也有作用。?腺嘌呤：是合成細(xì)胞分裂素的前體物質(zhì)之一。添加腺嘌呤能促進細(xì)胞合成分裂素，有利于細(xì)胞的分裂和分化，促進芽的形成。第2講植物的人工繁殖植物激素(Phytohormone)：是植物自然狀態(tài)下產(chǎn)生的、對生長發(fā)育有顯著作用的微量有機物。能影響生長和分化。?在個體發(fā)育中，不論是種子發(fā)芽、營養(yǎng)生長、繁殖器官形成以至整個成熟過程，主要由激素控制。?植物體內(nèi)的激素與細(xì)胞內(nèi)某種稱為激素受體的蛋白質(zhì)結(jié)合后，影響DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，并對特殊酶的合成起調(diào)控作用，從而表現(xiàn)出調(diào)節(jié)代謝的功能。第2講植物的人工繁殖生長素(auxin)生長素是由色氨酸通過一系列中間產(chǎn)物形成的。?在植物組織培養(yǎng)中，生長素主要用來刺激細(xì)胞分裂和誘導(dǎo)根的分化。?常用的生長素有：吲哚乙酸（IAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）等。IAA活力較弱。NAA起動能力要比IAA高出3-4倍。IBA是促進發(fā)根能力較強的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。NAA和IBA廣泛用于生根，并與細(xì)胞分裂素互作促進芽的增殖和生長。2，4-D起動能力比IAA高10倍，特別在促進愈傷組織的形成上活力最高，但它強烈抑制芽的形成。第2講植物的人工繁殖細(xì)胞分裂素（Cytokinin）?細(xì)胞分裂素大多是嘌呤族衍生物，自然狀態(tài)下分裂素主要在根中形成，莖端、萌發(fā)中的種子、發(fā)育中的果實和種子也能合成分裂素。?分裂素的生理作用主要是誘導(dǎo)芽的分化促進側(cè)芽萌發(fā)生長、促進細(xì)胞分裂與擴大。多用于誘導(dǎo)不定芽的分化和莖、苗的增殖，而在生根培養(yǎng)時使用較少或用量較低。?主要有激動素（KT）、6-芐基腺嘌呤（BA）和玉米素（ZT）等。其中最常用的是6-芐基腺嘌呤。第2講植物的人工繁殖激素配比第2講植物的人工繁殖（4）培養(yǎng)基及分類第2講植物的人工繁殖幾種常用的培養(yǎng)基組分MSB5SHN6大量元素mg/Lmmol/Lmg/Lmmol/Lmg/Lmmol/Lmg/Lmmol/LNH4NO3KNO3CaCl2·2H2OMgSO4·7H2OKH2PO4NaH2PO4·H2O(NH4)2SO4KCl1650190044037017020．618．83．01.51.25250015025015013425001.12.025002004001257502546919.02830166185400463281752.946.6微量元素mg/Lμmol/Lmg/Lμmol/Lmg/Lμmol/Lmg/Lμmol/LKIH2BO3MnSO4·H2OZnSO4·7H2ONaMoO4·7H2OCuSO4·5H2OCoCl2·6H2OFeSO4·7H2ONa2-EDTA0.836．215.68．60.250.0250.02527.837．35.010092.5301.001100100753.0102.0250.0250.02527.837.34.550607.0010.110010005.0101.00.250.0215206.080603.51.00.855550.81.63.31.527.837.34.82619.55.2100100蔗糖（g/L）30203050pH值5．75.55.85.8第2講植物的人工繁殖培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基母液的配制

①大量元素母液：即是含有N、P、S、K、Ca、Mg、Na等大量元素的無機鹽混合液。由于各組分的含量較高，一般配制成10倍濃度的母液。在使用時，每配制成1000mL培養(yǎng)液，吸取100mL母液。在配制母液時，要先將各個組分單獨溶解，然后按照一定的順序一邊攪拌，一邊混合，特別要注意將鈣離子（Ca++）與硫酸根、磷酸根離子錯開，以免生成硫酸鈣或磷酸鈣沉淀。②微量元素母液：即含有B、Mn、Zn、Co、Cu、Mo、I等微量元素的無機鹽混合液。由于各組分的含量低，一般配制成100倍濃度的母液。在使用時，每配制1000mL培養(yǎng)液，吸取10mL母液。第2講植物的人工繁殖③鐵鹽母液：由于鐵離子與其他無機元素混在一起放置時，容易生成沉淀，所以鐵鹽必須單獨配制成鐵鹽母液。鐵鹽一般采用螯合鐵（Fe-EDTA）。通常配制成100倍（或者200倍）濃度的鐵鹽母液，在使用時，每配制1000mL培養(yǎng)液，吸取10mL（或者5mL）鐵鹽母液。④維生素母液：是各種維生素和某些氨基酸的混合液。一般配制成100倍濃度的母液。在使用時，每配制1000mL培養(yǎng)液，吸取10mL母液。第2講植物的人工繁殖⑤植物激素母液：各種植物激素單獨配制成母液。一般濃度為100mg/L。使用時根據(jù)需要取用。由于大多數(shù)植物激素難溶于水，需要先溶于有機溶劑或者酸、堿溶液中，再加水定容到一定的濃度。它們的配制方法如下：2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)母液：稱取2,4-D10mg，加入2mL95%乙醇，稍加熱使之完全溶解，（或者用2mL1mol/L的NaOH溶解后）加蒸餾水定容至100mL。IAA（吲哚乙酸）母液：稱取IAA10mg，溶于2mL95%乙醇中，再用蒸餾水定容至100mL。IBA（吲哚丁酸），GA（赤霉酸）母液的配制方法與此相同。NAA（萘乙酸）母液：稱取NAA10mg，用2mL熱水溶解后，定容至100mL。KT（激動素）母液：稱取KT10mg，溶于2mL1mol/L的HCl中，用蒸餾水定容至100mL。BA（芐基腺嘌呤）母液的配制方法與此相同。玉米素母液：稱取玉米素10mg，溶于2mL95%的乙醇中，再加熱水定容至100mL。第2講植物的人工繁殖4、植物組織培養(yǎng)的基本步驟（1）培養(yǎng)材料的采集植物具有全能性的細(xì)胞：受精卵；發(fā)育中的分生組織細(xì)胞；雌雄配子及單倍體細(xì)胞。用哪一部分器官最適于作為組培的材料來源；器官的生理狀態(tài)和年齡；取材季節(jié)、離體材料的大小、取得離體材料的植株質(zhì)量等?？焖俜敝常撼Ｓ们o尖（長度0.5cm）；脫毒苗：莖尖分生組織（長度小于0.1mm）；第2講植物的人工繁殖（2）培養(yǎng)材料的消毒①先將材料用自來水洗干凈，最后一遍用蒸餾水沖洗，再用無菌紗布或吸水紙將材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小塊。②在無菌環(huán)境中將材料放入70%的酒精中浸泡30-60s。③再將材料移入漂白粉飽和液或0.01%升汞中消毒。④無菌水沖洗3~4次。第2講植物的人工繁殖常用的消毒劑：下表列出了目前常用的滅菌消毒劑。其使用濃度和處理時間，應(yīng)根據(jù)外植體的情況及其對滅菌劑的敏感性而定。消毒劑使用濃度（%）去除消毒劑難易消毒時間（min）滅菌效果次氯酸鈉次氯酸鈣漂白粉升汞酒精過氧化氫溴水硝酸銀抗生素25~10飽和溶液0.1~170~7510~121~214~50mg/L易易易較難易最易易較難中5~305~305~302~100.2~25~152~105~3030~60很好很好很好最好好好很好好較好第2講植物的人工繁殖（3）制備外植體

接種時外植體的大小和形狀取決于實驗?zāi)康模ㄇo、葉、根、花、果實、種子或其中某種組織切塊０.5cm，莖尖、胚、胚乳按組織單位切離）（4）接種和培養(yǎng)接種封口溫度增殖：新梢形成后，繼代，把新梢分株或切段轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中進行增殖。第2講植物的人工繁殖（5）根的誘導(dǎo)

生根是獲得完整植株的一個關(guān)鍵。通過腋芽、不定芽、愈傷組織途徑產(chǎn)生的芽長成試管苗，必須誘導(dǎo)生根才能移植。

促使試管苗生根的方法通常有兩種：

一種是在固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。當(dāng)試管苗長到2～3厘米高時，將它從基部切下，轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上生根（生根培養(yǎng)基一般要求降低礦物營養(yǎng)的濃度，提高生長素的濃度，具體應(yīng)根據(jù)植物不同而定）。

另一種是浸泡的方法，將切下的無根試管苗泡在含有高濃度生長素溶液中，生長素濃度為100毫克/升左右，浸泡時間從幾小時到1天，然后取出接種于不加任何激素的MS培養(yǎng)基上或者扦插在人工基質(zhì)上，十天左右即可生根。

第2講植物的人工繁殖

（6）煉苗和移栽

試管苗的生長環(huán)境

無菌異養(yǎng)弱光恒溫

第2講植物的人工繁殖蘆薈的植物組織培養(yǎng)過程

12345

6789

1011

第2講植物的人工繁殖5、植物組織培養(yǎng)再生植株的途徑第2講植物的人工繁殖以胡蘿卜為例第2講植物的人工繁殖器官發(fā)生途徑第2講植物的人工繁殖第2講植物的人工繁殖體細(xì)胞胚發(fā)生途徑體細(xì)胞胚（Somaticembryo）又叫胚狀體，是指離體培養(yǎng)條件下沒有經(jīng)過受精過程而形成的胚胎類似物。?體細(xì)胞胚發(fā)生途徑：是指體細(xì)胞在離體培養(yǎng)過程中經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程。體細(xì)胞胚起源于非合子細(xì)