基因綜合項目工程原理

基因工程原理內(nèi)容提綱基因工程又稱基因操作、重組DNA技術(shù)，是P.Berg等于1972年創(chuàng)立?；蚬こ碳夹g(shù)涉及基本過程涉及“切、連、轉(zhuǎn)、選”。該技術(shù)有兩個基本特點∶分子水平上操作和細(xì)胞水平上表達(dá)?；蚬こ讨惺褂酶鞣N工具酶，涉及限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和其她某些參加DNA合成與修飾酶類。限制性內(nèi)切核酸酶是基因工程中最重要工具酶，屬于水解酶類。依照限制性內(nèi)切核酸酶作用特點，被分為三大類。Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶是基因工程中最慣用酶，該類酶分子量小，專一性強(qiáng),切割方式有平切和交錯切，作用時需要Mg++作輔助因子，但不需要ATP和SAM。第一種被分離Ⅱ類酶是HindⅡ。連接酶是一類用于核酸分子連接形成磷酸二酯鍵核酸酶，有DNA連接酶和RNA連接酶之分?；蚬こ讨惺褂眠B接酶來自于原核生物，有兩種類型DNA連接酶∶E.coliDNA連接酶和T4-DNA連接酶。基因工程中使用重要是T4DNA連接酶，它是從T4噬菌體感染E.coli中分離一種單鏈多肽酶，既能進(jìn)行粘性末端連接又能進(jìn)行平末端連接。載體是能將分離或合成基因?qū)爰?xì)胞DNA分子，有三種重要類型∶質(zhì)粒DNA、病毒DNA、科斯質(zhì)粒，在這三種類型基本上，依照不同目，浮現(xiàn)了各種類型改造載體。DNA重組連接辦法大體分為四種：粘性末端連接、平末端連接、同聚物接尾連接、接頭連接法。粘性末端連接法是最慣用DNA連接辦法,是指具備相似粘性末端兩個雙鏈DNA分子在DNA連接酶作用下，連接成為一種雜合雙鏈DNA。平末端連接是指在T4DNA連接酶作用下，將兩個具備平末端雙鏈DNA分子連接成雜種DNA分子。同聚物加尾連接就是運用末端轉(zhuǎn)移酶在載體及外源雙鏈DNA3'端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端，外源DNA和載體DNA分子要分別加上不同寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC)，然后在DNA連接酶作用下，連接成為重組DNA。這種辦法可合用于任何來源DNA片段，但辦法較繁，需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端轉(zhuǎn)移酶等協(xié)同作用。將人工合成或來源于既有質(zhì)粒一小段DNA分子(在這一小段DNA分子上有某種限制性內(nèi)切酶辨認(rèn)序列)，加到載體或外源DNA分子上，然后通過酶切制造黏性末端辦法稱為接頭連接法?；蛭膸旆譃榛蚪M文庫、cDNA文庫等，是指在一種載體群體中，隨機(jī)地收集著某畢生物DNA各種克隆片段，抱負(fù)地包括著該物種所有遺傳信息。DNA重組分子在體外構(gòu)建完畢后，必要導(dǎo)入特定受體細(xì)胞，使之無性繁殖并高效表達(dá)外源基因或直接變化其遺傳性狀，這個導(dǎo)入過程及操作統(tǒng)稱為重組DNA分子轉(zhuǎn)化。當(dāng)前慣用誘導(dǎo)感受態(tài)轉(zhuǎn)化辦法是CaCl2法（圖3-20），此外也可以用基因槍等辦法轉(zhuǎn)化外源DNA。重組體篩選有遺傳學(xué)辦法、核酸雜交篩選法等?；蚬こ碳夹g(shù)是當(dāng)代生物技術(shù)核心，當(dāng)前在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)療中已經(jīng)顯示了巨大應(yīng)用前景，并形成了一大批生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)?；蚬こ淌且苑肿舆z傳學(xué)為理論基本，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)當(dāng)代辦法為手段，將不同來源基因(DNA分子)，按預(yù)先設(shè)計藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以變化生物原有遺傳特性，獲得新品種，生產(chǎn)新產(chǎn)品；或是研究基因構(gòu)造和功能，揭示生命活動規(guī)律?；蚬こ碳夹g(shù)誕生于20世紀(jì)70年代初，它是一門嶄新生物技術(shù)科學(xué)，它創(chuàng)立和發(fā)展使生命科學(xué)產(chǎn)生了一次重大奔騰，證明并實現(xiàn)了基因可操作性，使人類從簡樸地運用天然生物資源走向定向改造和創(chuàng)造具備新品質(zhì)生物資源時代?；蚬こ碳夹g(shù)誕生至今已經(jīng)獲得了輝煌成就，成為當(dāng)今生命科學(xué)研究領(lǐng)域中最有生命力和最引人注當(dāng)前沿學(xué)科之一，基因工程也是當(dāng)今新產(chǎn)業(yè)革命一種重要構(gòu)成某些。第一節(jié)基因工程技術(shù)誕生基因工程又稱基因操作(genemanipulation)，重組DNA(recombinantDNA)技術(shù)，是70年代發(fā)展起來遺傳學(xué)一種分支學(xué)科。一、基因工程技術(shù)誕生1972年，P..Berg等在PNAS上刊登了題為∶“將新遺傳信息插入SV40病毒DNA生物化學(xué)辦法：具有λ噬菌體基因和E.coli半乳糖操縱子環(huán)狀SV40DNA”，標(biāo)志著基因工程技術(shù)誕生。SV40病毒是猿猴病毒，是一種直徑為450球形病毒，分子量為28×106道爾頓。SV40DNA是環(huán)狀雙鏈構(gòu)造，全長5243個堿基對，編碼三個衣殼蛋白VP1、VP2、VP3和一種T抗原。SV40DNA上有一種限制性內(nèi)切酶E.coRⅠ切點。Berg等一方面用化學(xué)辦法構(gòu)建了一種二聚體環(huán)狀SV40DNA(圖3-1)。圖3-1重組SV40二聚體構(gòu)建(引自Berget.al,1972)當(dāng)時所用連接辦法是同聚物譜尾法，重組體鑒定重要是通過電子顯微鏡比較分子量大小。當(dāng)獲得二聚體SV40DNA后，Berg等就證明了環(huán)狀DNA被內(nèi)切酶切成線性DNA后可以重新環(huán)化，并且可以同此外分子重組。于是她們進(jìn)行第二步實驗就是從λdvgalDNA中制備具有E.coli半乳糖操縱子DNA，用上述同樣辦法進(jìn)行重組連接，并獲得成功。Berg等工作是人類第一次在體外給遺傳物質(zhì)動手術(shù)，標(biāo)志著一種新時代到來，為此她獲得了1980年諾貝爾化學(xué)獎。二、基因操作基本過程和特點基因工程操作可用圖3-2表達(dá)∶圖3-2基因工程基本過程(引自O(shè)ld&Primrose,1980)它所涉及過程可用“分(合成)、切、連、轉(zhuǎn)、選、鑒”六個字表達(dá)。分(合成)∶指DNA制備，涉及從生物體中分離或人工合成。分離制備或合成制備DNA辦法均有諸各種。切∶即在體外將DNA進(jìn)行切割，使之片段化或線性化。連∶即在體外將不同來源DNA分子重新連接起來，構(gòu)建重組DNA分子。轉(zhuǎn)∶即將重組連接DNA分子通過一定辦法重新送入或細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)。選∶從轉(zhuǎn)化全群體中將所需要目克隆挑選出來；鑒∶就是進(jìn)行對篩選出來重組體進(jìn)行鑒定，由于有些重組體并非是所需要，必須通過度析鑒定?；蚬こ逃袃蓚€基本特點∶分子水平上操作和細(xì)胞水平上表達(dá)。遺傳重組是生物進(jìn)化推動力，自然界中發(fā)生遺傳重組重要是靠有性生殖?；蚬こ碳夹g(shù)誕生使人們可以在試管里進(jìn)行分子水平上操作，構(gòu)建在生物體內(nèi)難以進(jìn)行重組，然后將重組遺傳物質(zhì)引入相應(yīng)宿主細(xì)胞，讓其在宿主細(xì)胞中進(jìn)行工作。這事實上是進(jìn)行無性繁殖，即克隆，因此基因工程普通有稱為基因克隆。第二節(jié)限制性內(nèi)切核酸酶外科醫(yī)生給患者動手術(shù)需要手術(shù)刀，基因工程師們給DNA分子(基因)動手術(shù)需要分子手術(shù)刀，這就是工具酶。基因工程中使用工具酶諸多，涉及限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和其她某些參加DNA合成與修飾酶類，最重要是限制性內(nèi)切核酸酶?；蚬こ躺习涯切┚邆浔嬲J(rèn)雙鏈DNA分子中某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈構(gòu)造核酸內(nèi)切酶統(tǒng)稱為限制性內(nèi)切核酸酶。一、限制性內(nèi)切核酸酶發(fā)現(xiàn)1952年Luria、Human在T偶數(shù)噬菌體、1953年weigle、Bertani在λ噬菌體對大腸桿菌感染實驗中發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌限制和修飾現(xiàn)象。正是對限制和修飾現(xiàn)象進(jìn)一步研究，導(dǎo)致限制性內(nèi)切核酸酶發(fā)現(xiàn)。噬菌體在某一特定細(xì)菌宿主中生長能力，取決于它最后在其中繁殖細(xì)菌是什么菌株。例如，將A噬菌體從一株大腸桿菌轉(zhuǎn)移到此外一株，其生長效率往往會削弱，對這兩個菌株滴定度可差好幾種數(shù)量級。第二個菌株釋放噬菌體能百分之百再感染同類菌株，但是若先將它們感染本來宿主菌，再將釋放子代噬菌體重新感染第二個菌株時，感染率要大大下降。此種現(xiàn)象即為宿主控制限制作用(host—Controlledrestriction)。用放射性同位素標(biāo)記噬菌體進(jìn)行實驗成果表白，在受感染宿主細(xì)胞中，噬菌體生長限制伴有噬菌體DNA迅速降解，然而，用作繁殖噬菌體感染宿主菌株并不導(dǎo)致類似噬菌體DNA降解。如果某一細(xì)菌細(xì)胞具備一種能選取性降解來自侵染病毒(或其她來源)核酸酶，那么，它必要能將這種外來DNA同它自己DNA區(qū)別開來，之因此可以如此，乃是通過稍為宿主控制修飾作用(host-controlledmodification)。因而，限制(restriction)作用是指細(xì)菌限制性核酸酶對DNA分解作用，限制普通是指對外源DNA侵入限制。修飾(modification)作用是指細(xì)菌修飾酶對于DNA堿基構(gòu)造變化作用(如甲基化)，經(jīng)修飾酶作用后DNA可免遭其自身所具備限制酶分解。到20世紀(jì)60年代中期，科學(xué)家推測細(xì)菌中有限制－修飾系統(tǒng)(restriction—modificationsystem．R-Msystem)。該系統(tǒng)中有作用于同一DNA兩種酶，即分解DNA限制酶和變化DNA堿基構(gòu)造使其免遭限制酶分解修飾酶，并且，這兩種酶作用于同一DNA相似部位。普通說來，不同種細(xì)菌或不同種細(xì)菌菌株具備不同限制酶和修飾酶構(gòu)成限制-修飾系統(tǒng)。1968年，Meselson從E．coliK株中分離出了第一種限制酶EcoK，同年Linn和Aeber從E．coliB株中分離到限制酶EcoB。遺憾是，由于EcoK和EcoB這兩種酶辨認(rèn)和切割位點不夠?qū)Ｒ?，在基因工程中意義不大。1970年，Smith和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離到一種限制性酶，可以特異性地切割DNA，這個酶日后命名為HindⅡ，這是第一種分離到Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶。由于此類酶辨認(rèn)序列和切割位點特異性很強(qiáng)，對于分離特定DNA片段就具備特別意義。二、限制性內(nèi)切核酸酶命名和分類（一）限制性內(nèi)切核酸酶命名按照國際命名法，限制性內(nèi)切核酸酶屬于水解酶類。由于限制性酶數(shù)量眾多，并且越來越多，并且在同一種菌中發(fā)現(xiàn)幾種酶。為了避免混淆，1973年Smith和Nathans對內(nèi)切酶命名提出建議，1980年，Roberts對限制性酶命名進(jìn)行分類和系統(tǒng)化。限制性酶采用三字母命名原則，即屬名+種名+株名個一種首字母，再加上序號，將限制性內(nèi)切核酸酶命名要點列于表3-1。表3-1限制性內(nèi)切核酸酶命名要點條目要點基本原則3-4個字母構(gòu)成，方式是:屬名+種名+株名+序號首字母取屬名第一種字母，且大寫第二字母取種名第一種字母，小寫第三字母①取種名第二個字母，小寫；②若種名有詞頭，且已命名過內(nèi)切酶，則取詞頭后第一字母代替第四字母若有株名，株名則作為第四字母，與否大小寫，依照本來狀況而定順序號若在同一菌株中分離了幾種限制性內(nèi)切核酸酶，則按先后順序冠以I、II、III,.....等如：EcoK：Escherichiacoli

K(大腸桿菌K株)（二）限制性內(nèi)切核酸酶分類限制性內(nèi)切核酸酶作用特點，將它們分為三大類。1.I類限制性內(nèi)切核酸酶I類限制性內(nèi)切核酸酶分子量較大，普通在30萬道爾頓以上，普通由三個不同亞基所構(gòu)成。例如限制性酶EcoB是由R(135kD)，M(62kD)和S(55kD)三種亞基構(gòu)成復(fù)合酶，這三個亞基分別由不同基因編碼。全酶總分子量為449kD,共5個亞基，其中R亞基和M亞基各兩分子。Ⅰ類酶不但是一種核酸內(nèi)切酶，同步在酶分子上還具備甲基化酶和ATPase活性，因此是具備各種酶活性復(fù)合酶類。作用時除了需要Mg++作輔助因子外，還規(guī)定ATP和S腺苷甲硫氨酸(SAM)存在。Ⅰ類酶具備特異辨認(rèn)序列，大概15個堿基對。Ⅰ類酶雖然可以在一定序列上辨認(rèn)DNA分子，并能同DNA分子作用，因其辨認(rèn)DNA后，要朝一種方向或兩個方向移動一段距離(普通為1000個堿基左右)，并且要形成一種環(huán)才干切割DNA(圖3-3)，因此辨認(rèn)位點和切割位點不一致，產(chǎn)生片段較大。圖3-3I類酶作用方式(引自Lewin,1997)2.Ⅲ類限制性內(nèi)切核酸酶Ⅲ類限制性內(nèi)切核酸酶也是基因工程中不慣用酶，分子量和亞基構(gòu)成類似于Ⅰ類酶，作用方式基本同Ⅱ類酶。如EcoP1是由兩個亞基構(gòu)成，一種亞基(M亞基)負(fù)責(zé)位點辨認(rèn)和修飾。另一種亞基(R亞基)具備核酸酶活性(圖3-5)。切割DNA時需要ATP,Mg2+,也能被SAM激活，但并非必須。圖3-4Ⅲ類限制性內(nèi)切核酸酶(引自Lewin,1997)3.Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶此類酶分子量較小.普通在2-4萬道爾頓，普通由2-4個相似亞基所構(gòu)成。它們作用底物為雙鏈DNA，很少數(shù)Ⅱ類酶也可作用于單鏈DNA，或DNA/RNA雜種雙鏈。此類酶專一性強(qiáng)，它不但對酶切點鄰近兩個堿基有嚴(yán)格規(guī)定，并且對更遠(yuǎn)堿基也有規(guī)定，因而，Ⅱ類酶既具備切割位點專一性，也具備辨認(rèn)位點專一性，普通在辨認(rèn)序列內(nèi)切割。切割方式有平切和交錯切，產(chǎn)生平末端DNA片段或具備突出粘性末端DNA片段(5'或3'粘性末端)。作用時需要Mg++作輔助因子，但不需要ATP和SAM。Ⅱ類酶與相應(yīng)甲基化酶在蛋白亞基上尚未發(fā)既有什么關(guān)系，第一種被分離Ⅱ類酶是HindⅡ。三.Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶性質(zhì)1.辨認(rèn)序列特異性在3類限制性內(nèi)切核酸酶中，Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶特異性最強(qiáng)。大多數(shù)Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶辨認(rèn)序列是回文序列。如BamHI和BglI都是辨認(rèn)六個堿基DNA序列(圖3-5)，都是完全回文序列。這段序列有兩個基本特性，第一是可以中在間劃一種對稱軸，兩側(cè)序列兩兩對稱互補(bǔ)配對，第二個特點是兩條互補(bǔ)鏈5’到3’序列構(gòu)成相似，即將一條鏈旋轉(zhuǎn)1800，則兩條鏈重疊。圖3-5Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶辨認(rèn)回文序列（引自D.Voet&VoteJ.G.1995）2.限制性內(nèi)切核酸酶切割頻率與速度切割頻率是指限制性內(nèi)切核酸酶在某DNA分子中預(yù)測切點數(shù)。由于DNA是由四種類型單核苷酸構(gòu)成，假定DNA堿基構(gòu)成是均以，而限制性內(nèi)切核酸酶辨認(rèn)位點是隨機(jī)分布，那么對于任何一種限制性內(nèi)切核酸酶切割頻率，理論上應(yīng)為1/4n，n表達(dá)該限制性內(nèi)切核酸酶辨認(rèn)堿基數(shù)。如辨認(rèn)4個堿基限制性內(nèi)切核酸酶，其切割頻率應(yīng)為每256個堿基有一種辨認(rèn)序列和切點(1/44=1/256)，辨認(rèn)5個堿基限制性內(nèi)切核酸酶，其切割頻率應(yīng)為每1024個堿基有一種辨認(rèn)序列和切點，余下類推。事實上因DNA分布是不均一,且有大量重復(fù)序列,加上內(nèi)切酶切點具備GC傾向,因此實際頻率偏低。猶如是辨認(rèn)6個堿基限制性內(nèi)切核酸酶，切割頻率相差很大∶EcoRI4000;BamHI:6000;SalI:8000;HpaII:200。依照限制性內(nèi)切酶切割DNA所產(chǎn)生產(chǎn)物末端，發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶對DNA切割有兩種方式，即平切和交錯切。所謂平切，就是限制性內(nèi)切酶在DNA雙鏈相似位置切割DNA分子，這樣產(chǎn)生末端就是平末端。交錯切就是限制性內(nèi)切酶在DNA雙鏈不同位置切割DNA，產(chǎn)生DNA片段末端不是平齊(圖3-6)。圖3-6平末端與黏性末端(Hartl,1991)Ⅱ類限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)物有平末端和粘性末端(cohesiveend)。粘性末端是指DNA分子兩端具備彼此互補(bǔ)一段突出單鏈某些，這一小段單鏈某些和同一分子另一端或其他分子末端單鏈某些如果互補(bǔ)話，則能通過互補(bǔ)堿基之間配對，形成雙鏈。并在DNA連接酶作用下，使同一DNA分子兩端連接成環(huán)狀,或使兩個分子連成一大線狀分子。不同限制性內(nèi)切酶切割DNA產(chǎn)生三種不同類型末端(表3-3)。表3-3某些限制性內(nèi)切酶及產(chǎn)生末端5'-粘性末端3'粘性末端平末端酶辨認(rèn)序列酶辨認(rèn)序列酶辨認(rèn)序列TaqIT/CGAPstICTGCA/GAluIAG/CTClaIAT/CGATSacIGAGCT/CFnuDⅡCG/CGMboI/GATCSphIGCATG/CDpnIGA/TCBglⅡA/GATCTBdeIGGCGC/CHaeⅢGG/CCBamHIG/GATCCApaIGGGCC/CPvuⅡCAG/CTGBclIT/GATCAKpnIGGTAC/CSmaICCC/GGCHindⅢA/AGCTT

NaeIGCC/GGCNcoIC/CATGG

HpaIGTT/AACXmaIC/CCGGG

NruITCG/CGAXhoIC/TCGAG

BalITGG/CCAEcoRIG/AATTC

MstITGC/GCASalIG/TCGAC

MhaⅢTTT/AAAXbaIT/CTAGA

EcoRⅤGAT/ATC基因分子手術(shù)是相稱復(fù)雜過程，除了需要限制性內(nèi)切酶外，還需要其她某些工具酶涉及連接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸酶、末端修飾酶等，對DNA或RNA進(jìn)行各種各樣修飾。其中最重要是連接酶。第三節(jié)基因工程載體載體(vector，vehicle)本意就是媒介體，基因工程上載體是能將分離或合成基因?qū)爰?xì)胞DNA分子，稱為克隆載體?；蚬こ讨杏腥N重要類型載體∶質(zhì)粒DNA、病毒DNA、科斯質(zhì)粒，其中質(zhì)粒DNA是最慣用載體，但運載能力低，柯斯質(zhì)粒是質(zhì)粒和λ噬菌體DNA結(jié)合體，運載能力最高(圖3-7)。在這三種類型基本上，依照不同目，浮現(xiàn)了各種類型改造載體。圖3-7三種類型載體(引自Greene,1998)一、質(zhì)粒載體質(zhì)粒(plasmid)是染色體以外遺傳物質(zhì)，它是雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子，其大小可從1kb到200kb左右，可以在宿主內(nèi)運用宿主酶系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)制。質(zhì)粒是基因工程重要載體。(一)質(zhì)粒概念1946—1947年間，Lederberg和Tatum發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌接合現(xiàn)象，這是細(xì)菌有性繁殖方式。此后不久，便弄清了這種接合是兩種不同交配型(接合型)，遺傳信息總是從供體(雄性)轉(zhuǎn)移到受體(雌性)。當(dāng)兩種不同交配型細(xì)菌互相辨認(rèn)和接合后來，雄性細(xì)胞致育因子，通過細(xì)胞表面構(gòu)造傳遞到雌性細(xì)胞，這種致育因子日后稱為F因子。1952年，Lederberg指出，細(xì)菌F因子與高等生物細(xì)胞質(zhì)中染色體外遺傳單元極為相似，并正式提出了“質(zhì)?！边@一名稱，以區(qū)別于染色體遺傳單元。普通來講，質(zhì)粒是細(xì)胞中可以獨立復(fù)制復(fù)制子，并在細(xì)胞分裂時能穩(wěn)定傳遞給子代細(xì)胞。雖然質(zhì)粒對細(xì)胞生存沒有影響，但質(zhì)粒DNA上也有某些編碼基因，賦予宿主細(xì)胞某些特性。自發(fā)現(xiàn)能賦予細(xì)菌性別特性F因子后來，又在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了一種可以編碼抗菌物質(zhì)——大腸桿菌素Col質(zhì)粒，涉及ColB，ColV，ColE等。由這些因子產(chǎn)生抗菌物質(zhì)稱細(xì)菌素(bacleriocin)，是細(xì)菌所合成一種蛋白質(zhì)，對于同種或近緣種具備毒性。合成細(xì)菌素能力和對于細(xì)菌素抗性，都由染色體外遺傳因子所控制。在1959一1960年間，日本科學(xué)家在研究用強(qiáng)效抗生素治療菌痢患者時，發(fā)現(xiàn)病原菌志賀氏菌具有使其同步能抗幾種抗生素基因，并且，這種抗藥性基因能以和F因子非常相似方式轉(zhuǎn)移給其她腸道細(xì)菌，這就是抗藥因子(R因子)?？顾幰蜃?resistancefactor)事實上是控制細(xì)菌抗藥性一種質(zhì)粒，能在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移，由抗藥性轉(zhuǎn)移因子和抗藥性基因兩某些構(gòu)成。每個抗藥因子上常具備幾種抗藥性基因。（二）質(zhì)粒DNA基本性質(zhì)大多數(shù)質(zhì)粒DNA是是環(huán)狀雙鏈DNA分子。如果兩條鏈都是完整環(huán)，這種質(zhì)粒DNA分子稱為共價閉合環(huán)狀DNA(covalentlyclosedcircular，CCCDNA)。CCCDNA有兩種構(gòu)型，超螺旋DNA(supercoliedDNA，SCDNA)和松弛DNA(RelaxedDNA),分別是由DNA促旋酶(DNAgyrase)和拓樸異構(gòu)酶(topoisomerase)作用成果。如果質(zhì)粒DNA中有一條鏈?zhǔn)遣煌暾?，那么這種DNA分子就稱為開環(huán)(opencircles,OCDNA)，開環(huán)DNA普通是由內(nèi)切酶或機(jī)械剪切導(dǎo)致圖3-8)。從細(xì)胞中分離質(zhì)粒DNA時，質(zhì)粒DNA經(jīng)常會轉(zhuǎn)變成超螺旋構(gòu)型。圖3-8質(zhì)粒DNA三種構(gòu)型(引自O(shè)ld&Primrose,1980)溴化乙啶(ethidiumbromide，EtBr)是一種扁平分子，可以插入到DNA分子堿基對之間，引起雙螺旋某些解旋，從而變化了DNA體積和密度。圖3-9相對分子質(zhì)量相似構(gòu)型不同質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳（引自O(shè)ld&Primrose，1980）由于不同構(gòu)型DNA插入EB量不同，它們在瓊脂糖凝膠電泳中遷移率也不同，CCCDNA泳動速度最快，OCDNA泳動速度最慢，LDNA居中(圖3-9)，因此很容易通過凝膠電泳和EB染色辦法將不同構(gòu)型DNA分別開來。（三）質(zhì)粒分類依照質(zhì)?？截悢?shù)將質(zhì)粒分為松弛型質(zhì)粒和嚴(yán)緊型質(zhì)粒。質(zhì)?？截悢?shù)(plasmidcopynumbers)是指細(xì)胞中單一質(zhì)粒份數(shù)同染色體數(shù)之比值,慣用質(zhì)粒數(shù)/每染色體來表達(dá)。不同質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)不同，

松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmid)復(fù)制只受自身遺傳構(gòu)造控制，而不受染色體復(fù)制機(jī)制制約，因而有較多拷貝數(shù)。普通可達(dá)10—15個/每染色體。并且可以在氯霉素作用下進(jìn)行擴(kuò)增，有質(zhì)粒擴(kuò)增后，可達(dá)到3000/每染色體(ColE1，可由24個達(dá)到1000至3000個)。此類質(zhì)粒多半是分子量較小，不具傳遞能力質(zhì)粒?；蚬こ讨惺褂枚嗍撬沙谛唾|(zhì)粒。嚴(yán)緊型質(zhì)粒(stringentplasmid)在寄主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制除了受自身復(fù)制機(jī)構(gòu)控制外，還受染色體嚴(yán)緊控制，因而拷貝數(shù)較少，普通只有1—2個/每染色體。這種質(zhì)粒普通不能用氯霉素進(jìn)行擴(kuò)增。嚴(yán)緊型質(zhì)粒多數(shù)是具備自我傳遞能力大質(zhì)粒。質(zhì)粒復(fù)制特性是受復(fù)制子控制?；蚬こ讨惺褂觅|(zhì)粒多數(shù)是松弛性質(zhì)粒載體。（四）載體條件就克隆一種基因(DNA片段)來說，最簡樸質(zhì)粒載體也必須涉及三個某些(圖3-10)∶復(fù)制區(qū)，具有復(fù)制起點；選取標(biāo)記，重要是抗性基因；克隆位點，便于外源DNA插入。就復(fù)制特性來講，規(guī)定載體必須有獨立復(fù)制起點，最佳是松弛型復(fù)制，這樣便于得到大量拷貝。有時需要有各種復(fù)制起點，可以在不同宿主細(xì)胞中復(fù)制，擴(kuò)大宿主范疇。具備適當(dāng)克隆位點，便于外源DNA插入。克隆位點事實上限制性酶切位點，最佳是具備各種限制性內(nèi)切酶單切點，這樣適應(yīng)性強(qiáng)，克隆以便，如果一種酶在載體上有各種切點，就會限制該切點使用。具備可檢測選取標(biāo)記，也是一種重要基本條件，這種選取標(biāo)記最佳是可以賦予宿主易于檢測表型。選取標(biāo)記就是常說報告基因(reportgenes)，涉及抗生素抗性標(biāo)記，以及某些生化表型標(biāo)記。此外，一種抱負(fù)質(zhì)粒載體必須具備低分子量，由于小分子質(zhì)粒DNA易于操作，不容易被損傷，也容易被分離純化。普通說小分子量質(zhì)粒分子拷貝數(shù)比較高，酶切位點也少。圖3-10質(zhì)粒載體基本構(gòu)造二、雜合載體除了質(zhì)粒載體外，噬菌體DNA也可作為載體，但是都是改造過，自然病毒DNA不能作為載體。當(dāng)前在基因工程中使用載體大多是質(zhì)粒和噬菌體雜合載體。（一）柯斯質(zhì)粒(cosmid)載體cosmid是英文cossite-carryingplasmid縮寫，本意是帶有粘性末端位點質(zhì)粒，因而，柯斯質(zhì)粒是人工建造具有λDNAcos序列和質(zhì)粒復(fù)制子特殊類型質(zhì)粒載體。柯斯質(zhì)粒構(gòu)建普通都是運用質(zhì)粒復(fù)制子、選取標(biāo)記，加上λcos位點序列及與包裝關(guān)于序列，構(gòu)建科斯質(zhì)?？梢暂^好地用于基因克隆(圖3-11)。圖3-11柯斯質(zhì)粒載體克隆(引自Lodishetal,1986)初期構(gòu)建科斯質(zhì)粒載體有某些局限性，如克隆位點較少，抗性標(biāo)記單一，容栽能力不大，日后進(jìn)行了某些改進(jìn)，克服了這些局限性?？滤官|(zhì)粒具備如下特點：具備質(zhì)粒復(fù)制子。當(dāng)前構(gòu)建柯斯質(zhì)粒大多具備pMB1復(fù)制子或ColE1復(fù)制子，因此進(jìn)入寄主細(xì)胞后可以象質(zhì)粒同樣進(jìn)行復(fù)制，并且可以被氯霉素擴(kuò)增。具備質(zhì)粒載體抗生素抗性基因選取標(biāo)記。如果在這些標(biāo)記中有克隆位點話可用插入失活法進(jìn)行篩選。例如上面構(gòu)建MuA-3就具備四環(huán)素抗性基因。具備λ噬菌體包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)特性。由于柯斯質(zhì)粒具備λDNAcos位點和相應(yīng)包裝序列，因而在克隆了恰當(dāng)大小外源DNA后來可以被包裝進(jìn)入噬菌體蛋白顆粒，并能進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)導(dǎo)能力比純質(zhì)粒大3個數(shù)量級。進(jìn)入寄主細(xì)胞后，又可以自我環(huán)化。但它不能同寄主染色體DNA整合，也不會產(chǎn)生子代噬菌體裂解寄主。溶載能力大。這是柯斯質(zhì)粒最大長處。被克隆DNA大小具備上限和下限，這是由于柯斯質(zhì)粒最后是被包裝到噬菌體顆粒，它最后大小應(yīng)在噬菌體基因組75%-105%之間。由于載體分子普通在5kb左右，因此克隆最大片段在45kb;如果載體分子量為15kb話，克隆最小片段為19kb。因而柯斯質(zhì)粒適合構(gòu)建真核生物基因庫，而不適合克隆原核生物基因。（二）pUC載體系列構(gòu)建美國加州大學(xué)Vieira和Messing運用pBR322和M13載體長處，構(gòu)建了一種更小載體，稱為pUC7（圖3-12），并在此基本上發(fā)展了pUC載體系列。圖3-12pUC載體構(gòu)建(引自Winnacker,1987)pUC載體具備諸多長處∶①多克隆位點；②松弛復(fù)制；③有氨芐青酶素抗性；④可通過化學(xué)顯色篩選。當(dāng)前最慣用pUC載體是pUC18(圖3-13),它分子量小，具備多克隆位點和易于選取分子標(biāo)記，并且是松弛型復(fù)制，在正常狀況下，它拷貝數(shù)可達(dá)上千個，因此不需要用氯霉素進(jìn)行擴(kuò)增。圖3-13pUC18質(zhì)粒載體圖譜二、基因文庫技術(shù)基因文庫(GeneLibrary)是指在一種載體群體中，隨機(jī)地收集著某畢生物DNA各種克隆片段，抱負(fù)地包括著該物種所有遺傳信息(圖3-18)。因而，基因文庫是人工構(gòu)建某畢生物基因“活期儲蓄所”，依照構(gòu)建辦法不同,分為基因組文庫、cDNA文庫等。依照基因庫含量,又分為全庫和特異性庫,全庫具有某畢生物所有遺傳信息,而特異性庫是不完整,如差示庫。初期將通過構(gòu)建基因文庫來篩選所需克隆辦法稱為鳥槍法。圖3-18基因文庫技術(shù)（J.J.Greene&RaoV.B.,1998）第三節(jié)體外重組一、體外重組辦法DNA重組連接辦法大體分為四種：粘性末端連接、平末端連接、同聚物接尾連接、接頭連接法。1.粘性末端連接法粘性末端連接(Cohesiveendligation)是指具備相似粘性末端兩個雙鏈DNA分子在DNA連接酶作用下，連接成為一種雜合雙鏈DNA(圖3-14)。粘性末端可由辨認(rèn)回文序列內(nèi)切酶所產(chǎn)生，或是用末端轉(zhuǎn)移酶來制備。凡是辨認(rèn)回文序列內(nèi)切酶切割DNA產(chǎn)生末端都是粘性末端，只有用同一種酶切割產(chǎn)生相似粘性末端才干通過末端單鏈堿基配對并在DNA連接酶作用下進(jìn)行連接。

圖3-14黏性末端連接法（引自Snyder&Champness，1977）粘性末端連接法是最慣用DNA連接辦法，酶切片段基本不需作什么解決就可以用于連接，既經(jīng)濟(jì)又省時。由于大多數(shù)限制性內(nèi)切酶都可以產(chǎn)生粘性末端，操作以便。此外,通過粘性末端連接重組體，其外源片段很容易回收，只要用本來酶切割重組體就可以了。此外，也可以通過雙酶切來獲得黏性末端，并可進(jìn)行定向重組連接（圖3-15）。圖3-15雙酶切進(jìn)行定向重組連接（引自Snyder&Champness，1977）平末端連接(bluntendligation)是指在T4DNA連接酶作用下(可加入適量RNA連接酶)，將兩個具備平末端雙鏈DNA分子連接成雜種DNA分子。平末端連接效率比粘性末端連接效率低得多,因此普通在連接反映體系中要適量添加增進(jìn)大分子凝聚凝聚劑,以提高平末端DNA連接效率。慣用是PEG8000，加入后，可以起到兩個作用：一是可將平末端連接效率提高1-3個數(shù)量級；二是變化連接產(chǎn)物分布，抑制分子內(nèi)連接，增進(jìn)分子間連接，得到連接產(chǎn)物重要是重組體。平末端連接不利之處是連接效率低，需要大量連接酶，有時為了提高連接效率，普通要補(bǔ)加RNA連接酶。連接后，緣由限制性內(nèi)切酶內(nèi)切酶切點要消失，因此不易回收插入外源DNA片段。3.同聚物加尾法所謂同聚物加尾(homopolymertailsjoining)連接就是運用末端轉(zhuǎn)移酶在載體及外源雙鏈DNA3'端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端，外源DNA和載體DNA分子要分別加上不同寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC)，然后在DNA連接酶作用下，連接成為重組DNA。這種辦法可合用于任何來源DNA片段，但辦法較繁，需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端轉(zhuǎn)移酶等協(xié)同作用（圖3-16）。同聚物接尾法事實上是一種人工粘性末端連接法，具備諸多長處:①一方面不易自身環(huán)化,這是由于同一種DNA兩端尾巴是相似，因此不存在自身環(huán)化。②由于載體和外源片段末端是互補(bǔ)粘性末端，因此連接效率較高。③用任何一種辦法制備DNA都可以用這種辦法進(jìn)行連接，因此是一種通用體外重組辦法。圖3-16同聚物尾連接法(引自O(shè)ld&Primrose,1980)1.基因組DNA文庫所謂基因組文庫(genomicDNALibrary)，就是用基因工程辦法,人工構(gòu)建具有某畢生物基因組DNA各種片段克隆群。普通以改造噬菌體DNA或柯斯質(zhì)粒作為載體，涉及下列過程(圖3-19)：①高分子量染色體DNA制備，②體外重組連接，③包裝蛋白制備，④重組體體外包裝，⑤將重組DNA導(dǎo)入寄主細(xì)胞，⑥篩選。建造基因組文庫不但可以大量擴(kuò)增含量很少單拷貝構(gòu)造基因，也可以克隆調(diào)控基因，有助于研究基因構(gòu)造、功能和調(diào)控機(jī)理?；蚪M文庫同遺傳學(xué)上所講基因庫是完全不同概念?；驇?genepool)是指在行有性生殖某一群體中，能進(jìn)行生殖個體所含總遺傳信息。在基因組文庫構(gòu)建中，由于使用載體不同，分為噬菌體載體和柯斯質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫、YAC文庫、BAC文庫。圖3-19基因組文庫技術(shù)(引自Griffithsetal.1996)2.cDNA文庫同mRNA互補(bǔ)DNA稱為cDNA。mRNA為模板合成cDNA可以用于基因克隆化，也可用這種辦法制備特異性雜交探針。cDNA文庫是以某畢生物總mRNA為模板，在無細(xì)胞系統(tǒng)中，在反向轉(zhuǎn)錄酶作用下，一方面合成一互補(bǔ)DNA，即第一鏈，破壞RMA模板后，再以第一鏈為模板合成第二鏈，得到雙鏈DNA稱為cDNA基因。選用適合載體，將合成cDNA基因重組導(dǎo)入寄主細(xì)胞，經(jīng)篩選得到cDNA基因克隆群稱為cDNA文庫(completementDNALibrary)(圖3-20)。由于cDNA技術(shù)合成是不含內(nèi)含子功能基因，因而是克隆真核生物基因一種通用辦法。圖3-20cDNA文庫構(gòu)建(引自O(shè)ld&Primrose,1980)由于細(xì)胞內(nèi)基因在表達(dá)時間上并非是統(tǒng)一,具備發(fā)育階段性和時間性,有些則需要特殊環(huán)境條件。因此,cDNA文庫是不也許構(gòu)建得十分全,也就是說任何一種cDNA文庫都不也許包括某畢生物所有編碼基因。因此在構(gòu)建cDNA文庫時應(yīng)依照研究目不同而選用不同生物材料作為RNA分離出發(fā)材料,有些甚至要通過特殊誘導(dǎo)解決以提高所需DNA豐度。第五節(jié)重組DNA轉(zhuǎn)移、篩選與鑒定轉(zhuǎn)化是基因工程操作中一項十分重要工作。DNA重組分子在體外構(gòu)建完畢后，必要導(dǎo)入特定受體細(xì)胞，使之無性繁殖并高效表達(dá)外源基因或直接變化其遺傳性狀，這個導(dǎo)入過程及操作統(tǒng)稱為重組DNA分子轉(zhuǎn)化(transformation)。重組體篩選有兩層涵義,一是將攜帶有外源插入DNA片段克隆挑選出來,二是將將攜帶有特定外源插入片段重組體挑選出來。鑒定則是對篩選重組體進(jìn)行最后鑒別。一、重組DNA轉(zhuǎn)化可以接受轉(zhuǎn)化作用細(xì)菌生理狀態(tài)叫感受態(tài)。細(xì)菌感受態(tài)是在恰當(dāng)生長條件下獲得一種生理特性。要強(qiáng)調(diào)是：感受態(tài)是關(guān)于轉(zhuǎn)化因子被吸取生理狀態(tài)，而不是關(guān)于轉(zhuǎn)化因子進(jìn)入細(xì)胞后能否被接受生理狀態(tài)。處在感受態(tài)受體細(xì)菌，其吸取轉(zhuǎn)化因子能力為普通細(xì)菌生理狀態(tài)千倍以上，并且不同細(xì)菌間感受態(tài)差別往往受自身遺傳特性、菌齡、生理培養(yǎng)條件等諸多因素影響。在自然條件下，大多數(shù)類型細(xì)菌不浮現(xiàn)感受態(tài)，也不發(fā)生轉(zhuǎn)化。然而可以通過某些化學(xué)誘導(dǎo)辦法來制備感受態(tài)，用這種辦法得到感受態(tài)就稱為人工誘導(dǎo)感受態(tài)細(xì)胞。當(dāng)前慣用誘導(dǎo)感受態(tài)轉(zhuǎn)化辦法是CaCl2法（圖3-21），此外也可以用基因槍等辦法轉(zhuǎn)化外源DNA。圖3-21鈣誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化二、重組體遺傳學(xué)篩選法所謂遺傳學(xué)辦法(geneticselection)重要是依照受體細(xì)胞接受了重組DNA分子后所發(fā)生遺傳表型變化直接選取重組體辦法。遺傳表型變化涉及抗藥性、缺陷基因功能互補(bǔ)表型及噬菌斑變化等。這些表型變化，有些是載體提供表型特性，有些則是插入序列提供表型特性。選取辦法重要是依照平板上可見表型變化，用于選取平板涉及普通抗生素平板、插入失活抗生素平板、插入表達(dá)抗生素平板、顯色平板等，由于這些辦法都是直接從平板上篩選,因此又稱為平板篩選法。（一）插入失活篩選法從原理上講，當(dāng)外源基因(或DNA片段)插入到某一基因內(nèi)位點后，使這個基因喪失了原有功能叫插入失活(insertionalinactivation)。圖3-22插入失活原理圖3-23聚合酶鏈反映（引自Watsonetal，1992）1.抗性基因插入失活篩選法依照抗生素抗性基因插入失活原理而設(shè)計插入失活法是重組體慣用篩選辦法。如非重組pBR322質(zhì)粒DNA上四環(huán)素和氨芐青霉素抗性基因都是正常，表型為AprTcr。帶有這種質(zhì)粒受體菌可以在加有四環(huán)素和氨芐青霉素雙抗性平板上生長。但是，如果在該質(zhì)粒四環(huán)素抗性基因內(nèi)插入外援片段，就會導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，變成AprTcs，攜帶這種質(zhì)粒宿主菌可以在氨芐青霉素平板上生長，而不能在四環(huán)素抗性平板上生長(圖3-22)。2.藍(lán)白斑篩選法依照抗生素抗性基因插入失活原理而設(shè)計插入失活法需要進(jìn)行菌落平板影印復(fù)制，才可以將所需重組體挑選出來，大大增長了篩選工作量。日后，人們設(shè)計了以β-半乳糖苷酶產(chǎn)生作為顏色篩選標(biāo)記載體，簡化了篩選程序，提高了敏捷度。此類載體系統(tǒng)涉及M13噬菌體、pUC質(zhì)粒系統(tǒng)、pEGM質(zhì)粒系統(tǒng)。它們共同特點是載體上攜帶一段細(xì)菌lacZ基因，它編碼β-半乳糖苷酶一段146個氨基酸α-肽，載體轉(zhuǎn)化受體菌為lacZΔM15基因型。這樣，載體同宿主通過互補(bǔ)，具備完整β-半乳糖苷酶活性。如果在載體lacZ基因中插入外源DNA，導(dǎo)致lacZ基因失活，不能合成α-肽，失去同宿主互補(bǔ)，不能形成有功能β-半乳糖苷酶，失去分解X-gal能力。在X-gal平板上，含陽性重組體細(xì)菌為物色菌落(質(zhì)粒載體)或無色噬菌斑(M13噬菌體載體)；非重組體轉(zhuǎn)化細(xì)菌為藍(lán)色菌落或藍(lán)色噬菌斑。顯色反映篩選辦法比較簡樸，但是β-半乳糖苷酶合成需要誘導(dǎo)。實驗中起誘導(dǎo)作用是安慰誘導(dǎo)物--IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)，作用底物是X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。普通是將X-gal和IPTG混合后，涂布在固體平板表面。(二)PCR法聚合酶鏈反映(polymerasechainreaction，PCR)是一種體外擴(kuò)增特定DNA序列新技術(shù)，這種DNA體外擴(kuò)增是通過同DNA雙鏈互補(bǔ)兩個引物在DNA聚合酶作用下，進(jìn)行引物延伸來完畢。在反映系統(tǒng)中，需要有：①模板(具有特定序列DNA分子)。②兩個寡聚核苷酸引物，這兩個引物可同雙鏈DNA分子互補(bǔ)鏈雜交，并且位于靶DNA欲擴(kuò)增區(qū)兩側(cè)。③耐熱DNA聚合酶。④4種脫氧核糖單核苷酸。然后通過不同溫度循環(huán)進(jìn)行DNA擴(kuò)增(圖3—23)。這一技術(shù)是KaryMullis在1985年創(chuàng)造，并于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎。PCR應(yīng)用十分廣泛，并且可通過菌液PcR進(jìn)行重組克隆迅速篩選?；巨k法是從抗性平板上挑取單菌落接種至250μLLB培養(yǎng)基中，200r/min振蕩培養(yǎng)8h后來，取1μL菌液進(jìn)行裂解制備模板進(jìn)行PCR篩選。（三）核酸雜交篩選法核酸雜交又叫分子雜交(molecularhybridization)，是鑒定和篩選重組體一種辦法。原理是：兩條具備堿基互補(bǔ)序列DNA分子變性后，在溶液中一起進(jìn)行復(fù)性時，可以形成雜種雙鏈DNA分子。同樣，一條DNA鏈與之具備互補(bǔ)堿基序列RNA鏈在一起復(fù)性時，也能形成雙鏈構(gòu)造(DNA-RNA雜交體)。雜交涉及下列過程：①DNA“熔解”，即變性，目是使雙螺旋解開成為單鏈，這可將DNA溶液溫度升高超過Tm值(解鏈溫度)即可；②退火，即DNA復(fù)性，將加熱過DNA溶液緩慢冷卻即可發(fā)生。雜交雙方是待測核苷酸序列及探針。待測核酸序列可以是克隆基因片段，也可以是未經(jīng)克隆基因組DNA或是細(xì)胞總RNA。核酸雜交辦法兩個特點是高度特異性及高度敏捷性。1.菌落雜交在大量篩選重組細(xì)菌細(xì)胞時，需要從中尋找出為數(shù)很少具有目序列細(xì)胞。此外.在運用插入失活、顯色反映等手段得到含重組質(zhì)粒細(xì)菌細(xì)胞后，還需要證明這些重組質(zhì)粒與否含所需要目序列。若將所得菌落逐個擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，然后用Southern雜交法固然可以鑒定重組質(zhì)粒，不但工作量大，又耗費財力，用菌落雜交(colonyhybridization)(圖3-24)，就以便得多。一方面要將轉(zhuǎn)化受體菌在適當(dāng)瓊脂平板上制成單菌落,然后將菌落復(fù)制到硝酸纖維素濾膜上，保存主平板,將硝酸纖維素濾膜上菌落進(jìn)行原位溶菌、原位釋放DNA、原位進(jìn)行DNA變性、中和洗滌后進(jìn)行原位固定。然后同特異探針進(jìn)行雜交,通過放射自顯影后,有雜交信號即為重組體,對照主平板則可將重組體選取出來。圖3-24菌落雜交基本過程(引自O(shè)ld&Primrose,1980)2.Southern雜交Southern雜交(Southernhybridization)是1975年Southern建立起來一種雜交辦法，屬固相-液相雜交。該法重要特點是運用可毛細(xì)現(xiàn)象將DNA轉(zhuǎn)移到固體支持物上,稱為Southern轉(zhuǎn)移或Southern印跡(Southernblotting)。它一方面用適當(dāng)限制性內(nèi)切酶將DNA切割后，進(jìn)行電泳分離后，運用干燥吸水紙產(chǎn)生毛細(xì)作用，使液體通過凝膠，從而使DNA片段由液流攜帶而從凝膠轉(zhuǎn)移并結(jié)合在固體支持物表面，然后進(jìn)行雜交(圖3-25)。圖3-25Southern雜交中DNA轉(zhuǎn)移(引自Albertsetal.)3.Northern雜交Northern雜交(NorthernHybridization)是分析RNA一種辦法,它基本原理是將RNA樣品通過變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離,再轉(zhuǎn)移到尼龍膜等固相膜載體上,用放射性同位素標(biāo)記DNA或RNA特異探針對固定于膜上mRNA進(jìn)行雜交,洗膜去除非特異性雜交信號,經(jīng)放射自顯影,對雜交信號進(jìn)行分析。將雜交mRNA分子在電泳中遷移位置與原則分子量分子進(jìn)行比較,即可懂得細(xì)胞中特定基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大小,對雜交信號強(qiáng)弱比較，可以懂得該基因表達(dá)mRNA強(qiáng)弱。這一技術(shù)應(yīng)用十分廣泛,慣用于基因表達(dá)調(diào)控、基因構(gòu)造與功能、遺傳變異及病理研究。重要用來檢測外源基因在受體細(xì)胞中與否轉(zhuǎn)錄成RNA。

Northern印跡原理同Southern印跡。但有兩點不同：其一是轉(zhuǎn)移對象不同，Northern印跡是將RNA變性及電泳分離后，將其轉(zhuǎn)移到固相支持物上過程。其二，雖然RNA電泳前不需向DNA那樣進(jìn)行酶切，但也需要變性。但是變性辦法是不同，它不能用堿變性，由于堿變性會導(dǎo)致RNA水解。

Northern雜交與Southern雜交重要區(qū)別是在變性劑存在下，用瓊脂糖進(jìn)行電泳分離RNA。變性劑作用是防止RNA二級構(gòu)造發(fā)夾環(huán)形成，保持其單鏈線性狀態(tài)。第六節(jié)生物技術(shù)及應(yīng)用基因工程技術(shù)發(fā)展推動了生物技術(shù)(biotec}lnokogy)發(fā)展，當(dāng)代生物技術(shù)作為一門綜合性學(xué)科，與當(dāng)代微生物學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和化學(xué)工程等多學(xué)科密切有關(guān)。生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)從20世紀(jì)80年代開始起步，通過發(fā)展，當(dāng)前在農(nóng)牧業(yè)、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)市場逐漸形成，其前景遼闊，將成為21世紀(jì)經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)。(一)細(xì)胞工程細(xì)胞工程(cellengineering)是運用細(xì)胞全能性，在細(xì)胞或細(xì)胞器水平上變化細(xì)胞某些遺傳特性，以改良其性狀、獲得有用基因產(chǎn)物或加速細(xì)胞及生物體繁殖綜合技術(shù)，可分為微生物細(xì)胞工程、植物細(xì)胞工程和動物細(xì)胞工程，是以細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為基本，通過細(xì)胞融合、細(xì)胞核移植、動物克隆、染色體工程和生物反映器來實現(xiàn)。1．細(xì)胞融合細(xì)胞融合(cellfusion)又稱體細(xì)胞雜交(somatichybridization)，是指兩個不同來源細(xì)胞，彼此融合成雜交細(xì)胞，使來自兩個親本細(xì)胞基因有也許都被表達(dá)，打破遠(yuǎn)緣生物不能雜交屏障，形成新物種或新品種技術(shù)。1975年，英國劍橋大學(xué)科學(xué)家科萊爾(G．Kohler)和米爾斯坦(C．Milstein)用細(xì)胞融合技術(shù)將能分泌抗體B淋巴細(xì)胞(綿羊紅細(xì)胞、免疫小鼠脾細(xì)胞)與具備無限生長能力腫瘤細(xì)胞(小鼠骨髓瘤細(xì)胞)融合，得到了既能持續(xù)產(chǎn)生單一抗體又能在體外無限繁殖雜合細(xì)胞(雜交瘤細(xì)胞，hybridomacell)(圖3—26)，通過細(xì)胞培養(yǎng)將雜合細(xì)胞克隆為單純細(xì)胞系(單克隆系)，由此類細(xì)胞系可獲得構(gòu)造和特性完全相似高純度抗體，即單克隆抗體(monoclonalantibody，McAb)。這一技術(shù)創(chuàng)立在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域獲得重大突破，兩位科學(xué)家因而榮獲1984年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。圖3—26運用細(xì)胞融合技術(shù)制備單克隆抗體(引自Kuby，1994)如今這種細(xì)胞融合技術(shù)已在動物間實現(xiàn)了小鼠和田鼠，小鼠和小雞，甚至于小鼠和人等許多遠(yuǎn)緣和超遠(yuǎn)緣體細(xì)胞雜交。雖然當(dāng)前動物雜交細(xì)胞還只停留在分裂傳代水平，不能分化發(fā)育成完整個體，但在理論研究和基因定位上均有重大意義。而植物間細(xì)胞融合所得到雜交細(xì)胞，獲得了新雜交植物，如西紅柿與馬鈴薯細(xì)胞融合獲得“西紅柿馬鈴薯”，羽衣甘藍(lán)與白菜型油菜細(xì)胞融合得到“甘藍(lán)型油菜”等。2．細(xì)胞核移植細(xì)胞核移植是將一種動物細(xì)胞核移入同種或異種動物去核成熟卵細(xì)胞內(nèi)顯微操作技術(shù)。由于重要遺傳物質(zhì)存在于細(xì)胞核內(nèi)，因而此技術(shù)可獲得遺傳上具同質(zhì)性狀動物，對動物優(yōu)良雜交種無性繁殖和瀕臨絕跡貴重動物傳種具備重大意義。1952年，美國科學(xué)家布里格斯(R．Briggs)初次運用豹紋蛙卵細(xì)胞建立了細(xì)胞核移植技術(shù)。1981年，瑞士科學(xué)家K．111menses率先對哺乳動物小鼠卵細(xì)胞進(jìn)行核移植獲得成功。她將灰鼠細(xì)胞核注入到除去了精核和卵核黑鼠受精卵內(nèi)，然后再將這一f'Fh黑鼠細(xì)胞質(zhì)和灰鼠細(xì)胞核構(gòu)成卵細(xì)胞體外培養(yǎng)，得到仔鼠是灰色，闡明仔鼠性狀取決于細(xì)胞核來源。在細(xì)胞核移植技術(shù)上發(fā)展起來動物體細(xì)胞克隆技術(shù)在1997年因克隆羊“多莉”(Dolly)誕生而獲得了重大突破。英國科學(xué)家維爾穆特(I．wilmut)等1997年2月27日在《自然》描述了“多莉”克隆過程(圖3—27)。她們?nèi)〕隽g芬蘭多塞特白綿羊母羊乳腺細(xì)胞核，將此核導(dǎo)入蘇格蘭黑綿羊去核卵細(xì)胞內(nèi)，待手術(shù)完畢之后，以相似頻率電脈沖刺激換核卵，讓蘇格蘭黑綿羊卵細(xì)胞質(zhì)與芬蘭多塞特白綿羊母羊乳腺細(xì)胞核互相協(xié)調(diào)，使這個“組裝”細(xì)胞在體外發(fā)育成初期胚胎，然后將胚胎植入另一只母羊子宮內(nèi)，產(chǎn)下了小綿羊“多莉”?！岸嗬颉辈皇怯赡秆蚵鸭?xì)胞和公羊精細(xì)胞受精產(chǎn)物，而是體細(xì)胞核加去核卵細(xì)胞質(zhì)，不經(jīng)兩性結(jié)合誘導(dǎo)出來胚胎產(chǎn)生。“克隆羊”誕生表白：動物體中執(zhí)行特殊功能、具備特定形態(tài)所謂高度分化細(xì)胞與受精卵同樣具備發(fā)育成完整個體潛在能力。圖3—27克隆羊“多莉”誕生過程(引自Glick&Pasternak，1998)1998年，日本科學(xué)家運用成年動物體細(xì)胞克隆兩頭牛犢誕生；同年，美國科學(xué)家用成年鼠體細(xì)胞成功地哺育出了第三代共50多只克隆鼠；1999年，夏威夷大學(xué)科學(xué)家運用成年鼠體細(xì)胞克隆出第一只雄性老鼠；1月，美國科學(xué)家宣布克隆猴成功，這只恒河猴被命名為“泰特拉”；同年3月，曾參加克隆小羊“多莉”英國PPL公司宣布，她們成功哺育出5頭克隆豬。，國內(nèi)科學(xué)家成功克隆出牛和山羊，使國內(nèi)成為少數(shù)掌握體細(xì)胞克隆哺乳動物核心技術(shù)國家之一。，美國、意大利等國科學(xué)家分別哺育出世界上第一匹克隆騾子和克隆馬。中華人民共和國和法國科學(xué)家合伙初次克隆出大鼠。(二)蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程是依照分子設(shè)計方案，通過對天然蛋白質(zhì)基因進(jìn)行改造，來實現(xiàn)對其所編碼蛋白質(zhì)改造，它產(chǎn)品已不再是天然蛋白質(zhì)，而是通過改造，具備了人類所需要特性特殊蛋白質(zhì)。天然蛋白質(zhì)都是通過漫長進(jìn)化過程自然選取而來，而蛋白質(zhì)工程對天然蛋白質(zhì)改造，能更快、更有效地為人類服務(wù)。重組人p干擾素(IFNp)人工改造是蛋白質(zhì)工程一種成功范例。干擾素(interferon)是人體細(xì)胞分泌一種蛋白質(zhì)，具備廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能，是人體防御系統(tǒng)重要構(gòu)成某些。重組人IFNβ是采用重組DNA技術(shù)，克隆人β干擾素基因，構(gòu)建合成干擾素基因工程菌，經(jīng)發(fā)酵、提純、純化制備而成。其基因工程產(chǎn)物活性為10萬U/mg，僅是天然IFN口產(chǎn)物活性10%。蛋白質(zhì)構(gòu)造分析發(fā)現(xiàn)，人IFNβ由154個氨基酸構(gòu)成，在17、41、141位有3個半胱氨酸(Cys)，人體天然產(chǎn)物在41、141間形成二硫鍵，基因工程產(chǎn)物二硫鍵位置有偏差，17位Cys巰基參加二硫鍵，形成無活性二聚體或寡聚體。由于絲氨酸(Ser)與半胱氨酸在構(gòu)造上除羥基(-OH)與巰基(-SH)外完全同樣，因而將17位Cys點突變?yōu)镾er，成果證明人工改造IFN口產(chǎn)物活性提高100倍，穩(wěn)定性好于天然產(chǎn)物。(三)酶工程酶工程(enzymeengineering)就是通過對酶修飾改造，提高酶催化效率并在某畢生物反映器中大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)過程，重要涉及酶發(fā)酵生產(chǎn)、酶分離純化、酶分子修飾、酶和細(xì)胞固定化、酶反映動力學(xué)與反映器、酶應(yīng)用等。酶工程應(yīng)用重要集中于食品工業(yè)、輕工業(yè)以及醫(yī)藥工業(yè)中(表3—4)。例如，固定化青霉素?；赣糜诔掷m(xù)裂解青霉素生產(chǎn)；α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖異構(gòu)酶持續(xù)作用于淀粉，就可以生產(chǎn)出各類糖漿；運用葡萄糖苷酶可生產(chǎn)出低糖啤酒；蛋白酶用于除去毛皮中特定蛋白，軟化皮革等。加酶洗衣粉、用蛋白酶生產(chǎn)嫩肉粉等，都是酶工程產(chǎn)物。此外，酶工程還用于農(nóng)副產(chǎn)品加工運用。美國運用大豆生產(chǎn)出200余種產(chǎn)品，涉及營養(yǎng)食品、藥物、食品添加劑等，例如高純度大豆卵磷脂、大豆蛋白等。當(dāng)前工業(yè)生產(chǎn)酶有60余種，其中規(guī)?；a(chǎn)僅20余種。表3—4酶工程重要應(yīng)用領(lǐng)域應(yīng)用領(lǐng)域酶類重要用途食品工業(yè)淀粉酶類葡萄糖、麥芽糖生產(chǎn)，啤酒釀造，面包、餅干等，烘烤食品制作等蛋白酶類嫩肉粉、餅干、蛋白胨、乳酪生產(chǎn)，啤酒澄清，肉類加工(如香腸熟化等)糖化酶淀粉液化，糊精降解葡萄糖異構(gòu)酶高果糖漿生產(chǎn)葡萄糖苷酶低糖啤酒生產(chǎn)凝乳酶乳酪生產(chǎn)果膠酶果酒、果汁去濁紡織工業(yè)淀粉酶類紡織品褪漿纖維素酶解決纖維制品，提高棉毛紡織品質(zhì)量蛋白酶類絲制品脫膠解決日化工業(yè)蛋白酶類加酶洗滌劑、加酶護(hù)膚品與化妝品生產(chǎn)淀粉酶類加酶洗滌劑生產(chǎn)超氧化物歧化酶化妝品生產(chǎn)糖酐酶牙膏添加劑制革工業(yè)蛋白酶類皮革去毛、軟化醫(yī)藥工業(yè)青霉素?；盖嗝顾?、頭孢霉素生產(chǎn)羥化酶氫化可松生產(chǎn)酪氨酸酶多巴(主治帕金森病)生產(chǎn)蛋白酶類氨基酸、蛋白水解液生產(chǎn)，治療消化不良，消腫，降壓等葡萄糖腦苷酯酶治療高雪病(葡萄糖腦苷酯酶缺少癥)天冬酰胺酶治療白血病溶菌酶消炎，鎮(zhèn)痛，止血等尿激酶治療心肌梗死、結(jié)膜出血等超氧化物歧化酶治療紅斑狼瘡、皮肌炎、輻射損傷等鏈激酶治療血栓性靜脈炎、血腫等其她各種酶各種疾病診斷(如葡萄糖氧化酶診斷糖尿病，膽堿酯酶診斷肝炎等)環(huán)保工業(yè)淀粉酶類解決造紙工業(yè)廢水溶菌酶解決高有機(jī)物含量廢水丁酸梭菌酶系解決釀酒工業(yè)廢水其她各種酶環(huán)境監(jiān)測試劑(如膽堿酯酶監(jiān)測有機(jī)磷農(nóng)藥，硫氰酸酶監(jiān)測氰

化物等)(四)發(fā)酵工程發(fā)酵工程(fermentationengineering)是運用微生物特性，通過當(dāng)代化工程技術(shù)，在反映器中生產(chǎn)目產(chǎn)物或提供所需服務(wù)技術(shù)過程?！鞍l(fā)酵”一詞來源于拉丁語動詞fervere(發(fā)泡)，意指運用酵母以果汁或麥芽汁為原料生產(chǎn)酒精飲料時浮現(xiàn)現(xiàn)象。老式發(fā)酵技術(shù)有悠久歷史，早在幾千年前人類就運用有益微生物生產(chǎn)食品和藥物，如酒、醋、醬、奶酪等。當(dāng)代發(fā)酵工程是在老式發(fā)酵工藝基本上結(jié)合基因工程、細(xì)胞工程、酶工程等當(dāng)代高新技術(shù)發(fā)展而成，由于其重要以微生物培養(yǎng)為主，因而也稱微生物工程。發(fā)酵工程由3某些構(gòu)成(圖3—28)：上游工程、發(fā)酵過程和下游工程。其中上游工程涉及優(yōu)良菌株選育、最適發(fā)酵條件(pH、溫度、溶氧和營養(yǎng)構(gòu)成)擬定、營養(yǎng)物準(zhǔn)備等。發(fā)酵過程重要指在最適發(fā)酵條件下，發(fā)酵罐中大量培養(yǎng)細(xì)胞和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物工藝技術(shù)。這里要有嚴(yán)格無菌生長環(huán)境，涉及發(fā)酵開始前采用高溫高壓對發(fā)酵原料和發(fā)酵罐以及各種連接管道進(jìn)行滅菌技術(shù)，在發(fā)酵過程中不斷向發(fā)酵罐中通入干燥無菌空氣空氣過濾技術(shù)，在發(fā)酵過程中依照細(xì)胞生長規(guī)定控制加料速度計算機(jī)控制技術(shù)，尚有種子培養(yǎng)和生產(chǎn)培養(yǎng)不同工藝技術(shù)。圖3—28發(fā)酵工程基本流程微生物發(fā)酵產(chǎn)品可分為如下幾大類：微生物細(xì)胞(生物量)作為產(chǎn)品，如單細(xì)胞(酵母)蛋白作為食品或飼料。微生物代謝物產(chǎn)品，當(dāng)前醫(yī)用抗生素、農(nóng)用抗生素等已有近200個品種，絕大某些都是發(fā)酵產(chǎn)品。此外，發(fā)酵產(chǎn)品還涉及酒精、氨基酸、檸檬酸和工業(yè)用酶等。味精、各種維生素等也是發(fā)酵工程產(chǎn)品?；蚬こ坍a(chǎn)品。微生物(如大腸桿菌、芽孢桿菌、鏈霉菌和酵母等)是最慣用重組基因表達(dá)系統(tǒng)。重要產(chǎn)品涉及干擾素、胰島素、牛凝乳酶、G—CSF(粒細(xì)胞集落刺激因子)、EPO(紅細(xì)胞生成素)和tPA(重組組織型纖溶酶原激活劑)等。(五)生物醫(yī)學(xué)工程生物醫(yī)學(xué)工程(biomedicalengineering)是綜合生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和工程學(xué)理論和辦法而發(fā)居起來新興綜合學(xué)科。生物醫(yī)學(xué)工程開始以仿生學(xué)原理制造人工器官，如心臟起搏器、人造心臟、假肢等，以及用于診斷手段醫(yī)學(xué)儀器。日后人體器官移植成為醫(yī)療中可以選取手段，但經(jīng)常要克服異體器官排斥反映，在用藥物可以解決排斥反映之前，人體器官移植成功例子很少。由于生物技術(shù)迅猛發(fā)展，在DNA雙螺旋構(gòu)造發(fā)現(xiàn)50年后，人類基因組籌劃已經(jīng)完畢，對人類基因全面理解后，人們已經(jīng)將眼光投到干細(xì)胞克隆和治療性克隆(非生殖性克隆)，某些國家如美國建立了胚胎干細(xì)胞系，用于涉及治療性克隆等方面研究。國外已經(jīng)成功地從自體鼻窿腔內(nèi)取出干細(xì)胞，導(dǎo)人心臟，去除心臟因炎癥等留下疤痕，恢復(fù)了心臟正常功能，以及用血液中干細(xì)胞修復(fù)因車禍等導(dǎo)致四肢癱瘓患者脊髓神經(jīng)，使她們重新站立起來。這是由于即便是成人，某些在胚胎時期存在干細(xì)胞仍可以留存在身體各某些，或者作為專能干細(xì)胞，也在人體器官中，這些干細(xì)胞可以在特定狀況下進(jìn)一步分化為組織。運用自體干細(xì)胞也免除了異體器官移植糟糕排斥反映。這種運用人體自身干細(xì)胞修復(fù)人體受損某些已經(jīng)成功例子以及治療性克隆前景，為解除人類病痛帶來了福音。(六)生物信息工程生物信息工程(biologicalinformationengineering)可以簡樸地定義為計算機(jī)與信息技術(shù)在生命科學(xué)中應(yīng)用，它是一種年輕和迅速發(fā)展領(lǐng)域。生物信息工程運用數(shù)學(xué)、計算機(jī)科學(xué)和生物學(xué)來闡明和理解大量生物學(xué)研究實驗數(shù)據(jù)中所包括生物學(xué)意義，涉及此類數(shù)據(jù)采集、貯存、整頓、歸檔、分析與可視化等。以人類基因組籌劃(humangenomeproject，HGP)為序幕生物信息學(xué)研究，是全面結(jié)識生命及其過程重要手段，由此引起生物信息革命，將從主線上變化生命科學(xué)和生物產(chǎn)業(yè)思維方式和研究體系。人類基因圖譜繪制既是生物學(xué)突破也是計算科學(xué)壯舉。在生物學(xué)家看來，存在于基因組中堿基對序列是寶貴生物信息資源，是將來生物工程產(chǎn)業(yè)支柱。人類3萬～4萬個基因信息以及相應(yīng)染色體位置被闡明后，將成為醫(yī)學(xué)和生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)知識和技術(shù)創(chuàng)新源泉。某些困擾人類健康重要疾病，例如心腦血管疾病、糖尿病、肝病、癌癥、老年癡呆癥等都與基因關(guān)于，可以根據(jù)已知基因序列和功能，找出這些基因并針對相應(yīng)靶位進(jìn)行藥物篩選，并設(shè)計新藥。究竟，已有1500各種致病基因被標(biāo)記。信息技術(shù)有史以來初次成為推動實驗生物學(xué)和醫(yī)學(xué)發(fā)展重要動力。這一趨勢明顯地體當(dāng)前所有與理解疾病起因、新藥開發(fā)有關(guān)核心領(lǐng)域中——基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝途徑研究等，這些專業(yè)研究需要依托強(qiáng)大計算機(jī)系統(tǒng)、數(shù)據(jù)和存儲管理系統(tǒng)來完畢大量數(shù)據(jù)解決工作。而這些對生命研究數(shù)據(jù)將協(xié)助人類解開人體內(nèi)數(shù)以萬計蛋白質(zhì)種類基因編碼秘密。此外，運用生物信息工程技術(shù)建立動、植物良種及有關(guān)有用基因數(shù)據(jù)庫將有助于各種家畜、作物基因改良。四、轉(zhuǎn)基因動物圖3—30轉(zhuǎn)基因鼠(引自Griffithsetal，1999)老式家畜改良重要是通過多代選取性交配改良飼養(yǎng)動物遺傳性狀，如產(chǎn)奶、羊毛品質(zhì)、生長速度和產(chǎn)蛋率等。在每一輪持續(xù)世代中，那些具備優(yōu)越性狀動物可作為選育良種。這種交配、選育方式雖然費時、費力，但卻很成功，現(xiàn)今幾乎所有家畜都通過這種改良。但是這種辦法不能將單一功能基因或基因簇引入高等動物染色體DNA上。通過20世紀(jì)80年代不懈努力，借助于受精卵原核顯微注射和初期胚胎細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄病毒感染等手段，將基因?qū)胧芫旬a(chǎn)生新品種設(shè)想已成為現(xiàn)實。動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)迅速成為研究哺乳動物基因表達(dá)和發(fā)育有效手段，在建立研究人類疾病動物模式系統(tǒng)中發(fā)揮著作用，還可以使動物乳腺分泌具有藥用蛋白乳汁，因而浮現(xiàn)了“乳腺生物反映器”。轉(zhuǎn)基因技術(shù)在小鼠研究中發(fā)展得較為成熟(圖3—30)。20世紀(jì)80年代以來，已經(jīng)將幾百種基因?qū)氩煌废抵?。這些研究使人們對基因調(diào)控、腫瘤發(fā)生、免疫專一性、發(fā)育分子遺傳學(xué)及其她某些基本生物活動過程有了更多理解。轉(zhuǎn)基因小鼠還可作為人類治療藥物檢測動物，不同轉(zhuǎn)基因品系可作為研究人類遺傳疾病生物醫(yī)學(xué)模型。(一)基因?qū)雱游镛k法在轉(zhuǎn)基因中，DNA可通過3種方式導(dǎo)入：①反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)感染初期胚胎細(xì)胞，然后植入雌性動物體內(nèi)。②顯微注射到受精卵內(nèi)膨大精核(雄性原核)中。③基因工程解決胚胎干細(xì)胞，導(dǎo)入一種初期發(fā)育胚胎后再植入雌性動物體內(nèi)。1．反轉(zhuǎn)錄病毒載體法圖3—31顯微注射法進(jìn)行動物轉(zhuǎn)基因基本過程(引自Glick&Pasternak，1998)在各種基因轉(zhuǎn)移辦法中，反轉(zhuǎn)錄病毒作為載體可以有效地使轉(zhuǎn)移基因整合到受體細(xì)胞基因組中。但是，此類載體只能攜帶小片段(約8kb)DNA，由于長度限制，這些轉(zhuǎn)移基因也許缺少核心相鄰調(diào)控序列。使用病毒載體有一種最重要缺陷，雖然這些載體被設(shè)計為復(fù)制缺陷型，但是用于制備大量載體DNA病毒株基因組可同樣進(jìn)入細(xì)胞核。除非采用特殊防止辦法，這些輔助病毒會在轉(zhuǎn)基因個體中復(fù)制、產(chǎn)生。無論是直接將轉(zhuǎn)基因個體作為食品，還是運用其產(chǎn)物，都應(yīng)絕對避免病毒污染，因此，反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法很少用于生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)用途轉(zhuǎn)基因動物。2．DNA顯微注射法由于反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法局限性，顯微注射DNA成為產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠首選辦法。整個過程涉及3個重要環(huán)節(jié)(圖3—31)：①刺激供體雌性鼠超量排卵，以產(chǎn)生足夠受精卵用于注射。一方面注射孕馬血清，約48h后再注射人絨毛膜促性腺激素，一只超量排卵小鼠可產(chǎn)生大概35顆卵，而不是普通5～10顆卵。②雌鼠通過交配，受精卵從輸卵管中洗出。③及時對采集受精卵進(jìn)行顯微注射。注射轉(zhuǎn)移基因普通是線性構(gòu)造，不采用原核生物載體序列。整個過程看似簡樸，但需要一系列實驗環(huán)節(jié)配合，并且成功率最高也只有5%左右，因此必要對大量卵進(jìn)行注射。例如，經(jīng)注射卵有66%成活率，成活受精卵25%可正常發(fā)育，25%后裔攜帶轉(zhuǎn)移基因，那么，注射1000個受精卵，才干獲得30～50個轉(zhuǎn)基因后裔。并且，DNA在染色體上隨機(jī)整合，在某些個體中，轉(zhuǎn)移基因由于整合位點不當(dāng)而不能表達(dá)，在某些個體中因拷貝數(shù)高而過度表達(dá)，這會干擾動物正常生理活動。3．胚胎干細(xì)胞法小鼠胚胎發(fā)育卵泡階段細(xì)胞在培養(yǎng)基中依然保持分化能力。當(dāng)把它們重新輸回胚胎胚泡后，仍保存著分化成其她細(xì)胞(涉及生殖細(xì)胞)能力，此類細(xì)胞稱多能性胚胎干細(xì)胞(EScell)。ES細(xì)胞在體外培養(yǎng)時可承受轉(zhuǎn)基因操作而不影響其分化多能性。外源基因通過同源重組可特異性整合在ES基因組內(nèi)一種非必須位點上，構(gòu)成工程化胚胎干細(xì)胞。經(jīng)體外篩選鑒定、擴(kuò)大培養(yǎng)后再輸回小鼠胚胎胚泡