GB∕ T 40626-2021 楊樹細菌性潰瘍病菌檢疫鑒定方法（正式版）

ICSCCS65.020.01楊樹細菌性潰瘍病菌檢疫鑒定方法國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會IGB/T40626—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由全國植物檢疫標準化技術委員會(SAC/TC271)提出并歸口。1GB/T40626—2021楊樹細菌性潰瘍病菌檢疫鑒定方法1范圍間調(diào)查和病害監(jiān)測工作。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文SN/T1193基因檢驗實驗室技術要求SN/T2601植物病原細菌常規(guī)檢測規(guī)范3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。AplanobacteriumpopuliRidéXanthomonaspopulisubsp.populi分類地位：變形菌門(Proteobacteria),變形菌綱(Gammaproteobacteria),黃單胞菌目(Xan-thomonadaceae),黃單胞菌科(Xanthomonadaceae),黃單胞菌屬(Xanthomonas)。楊樹細菌性潰瘍病菌的相關資料參見附錄A。以及致病性測試是本文件檢疫鑒定方法的原理。6檢測流程檢測流程見圖1。2GB/T40626—2021待測樣品待測樣品癥狀觀察分離培養(yǎng)革蘭氏染色、鞭毛染色(初篩)煙草過敏性反應、生化特征測定(初篩)按以上實驗步驟順序，若分子特異性檢測和致病性測試為陽性則判定為檢出分子特異性檢測陰性則判7儀器及用具8主要試劑及培養(yǎng)基8.1試劑和材料(MgSO?·7H?O)、磷酸氫二鉀(K?HPO?)、溴酚藍(C??H??Br?O?S)、七葉靈(C??H??O?)、檸檬酸鐵3GB/T40626—2021(FeC?H?O?)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸、冰醋酸(C?H?O?)、氯化鎂(MgCl?)、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、DNA聚合酶(Taq酶),氧化酶試紙條、細菌微量生化鑒定管、溴化乙錠(C2?H??N?Br)、瓊脂8.2培養(yǎng)基蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基、營養(yǎng)葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(NDA)配制按照附錄B操作。9檢疫鑒定方法9.1癥狀觀察楊樹的病害調(diào)查或進出境楊樹苗木的現(xiàn)場檢疫中，若發(fā)現(xiàn)枝條皮層產(chǎn)生裂縫，從裂縫中流出灰褐色細菌菌液，或樹干出現(xiàn)腫大的、瘤狀潰瘍斑(見A.2危害情況),取樣帶回實驗室做進一步分離鑒定。9.2寄主組織分離培養(yǎng)按照SN/T2601要求進行操作。取疑似潰瘍病癥狀的樹段進行病原菌的分離培養(yǎng)，表面用75%酒精消毒后，去除樹皮，把內(nèi)部變色木材切成長度和厚度3mm～4mm的小塊，用無菌水清洗三次。在滅菌離心管中加入少量無菌水，將小塊病組織放入無菌水中，并用滅菌研磨棒對小塊病組織進行碾壓研病組織浸出液，在蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基或NDA培養(yǎng)基平板上涂布分離，做不少于5個平板。平板置于25℃下培養(yǎng)4d~5d后觀察，若發(fā)現(xiàn)可疑菌落(特征為直徑3mm~若發(fā)現(xiàn)染病苗木皮層裂縫流出菌液，可直接用接種環(huán)蘸取并在蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基或NDA培養(yǎng)基平板上劃線分離，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每份樣品做不少于5個平板，培養(yǎng)4d～5d后挑取單菌落進行純化培養(yǎng)。9.3分離菌的鑒定9.3.1革蘭氏染色反應進行革蘭氏染色試驗，要設置陽性菌的對照。若染色結果為革蘭氏陰性菌，應進行鞭毛染色試驗。革蘭氏染色應采用3%氫氧化鉀(KOH)溶液進行檢測判斷。用牙簽挑取新鮮待測菌落放在載玻革蘭氏陽性菌。9.3.2鞭毛染色反應若分離菌經(jīng)生物顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)有鞭毛并且鞭毛極生，繼續(xù)進行生化指標的檢測。9.3.3煙草過敏性反應取分離的菌株用無菌水配制成約10?CFU/mL菌懸液，用滅菌注射器接種煙草葉片背面，置于25℃光照培養(yǎng)，24h～48h觀察煙草葉片是否出現(xiàn)過敏性壞死反應。若葉片出現(xiàn)枯斑情況則為陽性反應，若出現(xiàn)黃斑或不明顯變化則為陰性反應。同時接種陽性菌株懸液和無菌水分別作為陽性對照和空白對照。采用微量生化鑒定管對可疑菌株和楊樹細菌性潰瘍病菌標準菌株進行生化指標檢測，該步驟也可4GB/T40626—2021使用細菌自動鑒定系統(tǒng)等自動化生化指標檢測設備。楊樹細菌性潰瘍病菌的生化指標測定結果若為七葉靈水解陰性，明膠液化陰性，D-木糖、蜜二糖、棉子糖不產(chǎn)酸，能從甘露糖、半乳糖和果糖產(chǎn)酸，則繼續(xù)進行分子方法鑒定步驟。生化指標測定方法按照附錄B操作。9.3.5分子特異性檢測采用試劑盒提取細菌DNA。按照SN/T1193要求進行分子實驗的操作。9.3.5.2PCR特異性檢測根據(jù)楊樹細菌性潰瘍病菌RNA聚合酶σ-70因子的編碼基因(rpoD)設計特異性引物，擴增片段大小為160bp,檢測方法及步驟按照附錄C操作。采用楊樹感病品種的離體枝條，試驗在控溫的室內(nèi)或培養(yǎng)箱中進行，溫度控制在20℃~25℃。將培養(yǎng)48h的供試菌株用無菌水配制成約10?CFU/mL菌懸液，將枝條截成約40cm長的段，在枝條中接種陽性菌株懸浮液和無菌水分別作為陽性對照和空白對照。5d后觀察傷口處情況，若發(fā)現(xiàn)韌皮部具有軟腐癥狀且有變色情況出現(xiàn)，且在發(fā)病組織處分離到供試菌株，則證明供試菌株對楊樹有致病性。10結果判定分離得到的細菌菌株經(jīng)過初篩試驗(菌落形態(tài)、革蘭氏染色、鞭毛染色、煙草過敏性試驗、生化特征測定)步驟檢測，若PCR特異性檢測為陰性，則判定未檢出楊樹細菌性潰瘍病菌。若PCR特異性檢測11菌株保存與處理從檢測樣品中分離并鑒定為楊樹細菌性潰瘍病菌的菌株，應妥善保存。將菌株接種于營養(yǎng)葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(NDA)斜面上，23℃培養(yǎng)1d后轉入4℃低溫冰箱中保存，定期(約30d)轉接防止病菌死12結果記錄與資料保存并要有實驗人員和審核人員簽字記錄。5(資料性)楊樹細菌性潰瘍病菌相關資料A.1寄主植物A.2危害情況率一般可達12.0%～14.2%,感病樹種甚至可達37%。病樹主干的潰瘍斑使木材的加工利用價值大楊樹細菌性潰瘍病主要危害10年生大樹，幼樹少見，1～2年生幼苗不會發(fā)生此病，主要危害主干和主枝。在感染初期，使樹干形成橢圓形、光滑的小瘤，腫瘤增大成明顯后，其韌皮部和木質(zhì)部出現(xiàn)變色，夏季開裂流出棕褐色黏液，有臭味。病菌進入樹體后，在寄主的細胞間隙擴散，溶解細胞壁和中膠株呈禿頂狀。病害主要由雨水、昆蟲等傳播，經(jīng)皮孔、傷口侵入危害，發(fā)病楊樹產(chǎn)生的黏液是重要的侵A.3癥狀楊樹細菌性潰瘍病菌引起的癥狀見圖A.1。圖A.1楊樹細菌性潰瘍病菌危害癥狀6A.4形態(tài)特征嚴格好氧，以分子氧為終端電子受體。不能反硝化或硝酸鹽還原反應。最適生長溫度24℃~26℃。在含有葡萄糖的培養(yǎng)基上產(chǎn)生一種多糖黏液，即莢膜。在多種培養(yǎng)基上可產(chǎn)生黃色色素，色素是極具特征的溴化芳基多烯黃單胞菌素。接觸酶試驗陽性，氧化酶試驗陰性，有機化能營養(yǎng)，不還原硝酸鹽。能利用不同的糖和有機酸鹽作乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸，不能液化明膠，可利用乳酸鈣而不能利用谷氨酰胺生長，不能利用天門冬酰胺作為唯一的碳源和氮源。0.1%(通常為0.02%)氯化三苯四唑能抑制生長。通常必需的生長因子包括蛋氨酸、谷摩爾分數(shù)為62.1%～65.6%。A.6分布情況A.7傳播途徑傳播，遠距離傳播主要是帶菌苗木、接穗等。昆蟲能攜帶病菌，在傳病過程中也起了重要作用。人工接種病菌的蚜蟲和其他昆蟲的傳病試驗已得到證實。從蛀蟲(Cypsonomaaceriana)的蟲癭上和取食幼樹昆蟲很可能是傳病的媒介，而土壤可能是病菌的自然棲息場所。A.8種以下階元分類目前楊樹細菌性潰瘍病菌[Xanthomonaspopuli(exRide1958)Ride&.Ridé1992]存在兩個亞種，即Xanthomonaspopulisubsp.populi和Xanthomonaspopulisubsp.salicis,其中后者是1977年亞種并入楊樹細菌性潰瘍病菌(Xanthomonaspopuli),兩個亞種可以通過寄主植物、菌落形態(tài)、有無運動性、耐鹽性高低及生化指標等加以區(qū)分。B.1培養(yǎng)基B.1.2營養(yǎng)葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(NDA)B.1.3營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)121℃濕熱滅菌15min。蛋白胨2g,氯化鈉5g,葡萄糖10g,磷酸氫二鉀0.2g,瓊脂粉6g,溴酚藍(先用少量95%乙醇溶B.1.5明膠蛋白胨培養(yǎng)基B.2生化指標測定B.2.1七葉靈水解在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中添加0.1%的七葉靈和0.05%的檸檬酸鐵。分裝試管斜面，121℃濕熱滅菌GB/T40626—2021(規(guī)范性)分子方法鑒定C.1PCR特異性引