c1型尼曼-匹克氏病對神經(jīng)元發(fā)生

1/1c1型尼曼-匹克氏病對神經(jīng)元發(fā)生新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科研創(chuàng)新計劃課題申報書所屬學(xué)科：

發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)課題名稱：

C1型尼曼-匹克氏病對神經(jīng)元發(fā)生發(fā)育影響的初步研究申報者：

丁登峰所在院系、年級：

生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院2014級起止時間：

2015.01-2016.06申報時間：

2014.11.11共青團(tuán)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院委員會制課題名稱C1型尼曼-匹克氏病對神經(jīng)元發(fā)生發(fā)育影響的初步研究所屬學(xué)科發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)起止時間2015.01-2016.06申請金額2000申報人姓名丁登峰性別男出生年月1995.5.24所在院系、專業(yè)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，生物工程課題組成員情況姓名性別出生年月所在院系年級任職情況丁登峰男1995.05生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，2014級董宏天女1995.10生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，2014級顧巧美女1995.02生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，2014級課題組總?cè)藬?shù)3指導(dǎo)教師1喬梁性別男出生年月1985.9技術(shù)職稱講師最后學(xué)歷研究生學(xué)位博士所在院系生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院推薦意見：

簽名：

年月日指導(dǎo)教師2閆欣性別男出生年月1980.1技術(shù)職稱副教授最后學(xué)歷研究生學(xué)位博士所在院系生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院推薦意見：

簽名：

年月日一、本課題研究概況及趨勢，研究本課題的實際意義和理論意義1.國內(nèi)外研究概況及趨勢C1型尼曼-匹克氏?。∟iemann-PickdiseasetypeC1,NPC1）是一種由于NPC1基因突變而引起脂類代謝異常的遺傳性疾病，常見臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)受損的癥狀和體征，如發(fā)育遲緩、共濟(jì)失調(diào)、步態(tài)不穩(wěn)、肌張力降低、震顫、癲癇發(fā)作、癡呆等，具有高致殘率和致死率的特點(diǎn)。

根據(jù)發(fā)病年齡可將病人分為4類，分別為新生兒、幼兒、青少年和成年病人，其中嬰幼兒時期發(fā)病率較高，多在10多歲前死亡[1]。

迄今為止，臨床上還沒有有效的治療方法，僅能通過對癥治療、低脂飲食和加強(qiáng)營養(yǎng)的方法來延緩病情的發(fā)展，不僅給家庭和社會造成了沉重的負(fù)擔(dān)，也給患者本身帶來難以想象的痛苦。

NPC1是一種由1278個氨基酸殘基組成的細(xì)胞膜蛋白分子，分子量約為142kD，具有13個跨膜區(qū)，5個固醇敏感區(qū)（sterolsensingdomainSSD，圖1），它可以直接結(jié)合膽固醇，將其從次級溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜和高爾基網(wǎng)狀系統(tǒng)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞脂質(zhì)代謝平衡。

而對NPC1病人的基因分析顯示，大部分的突變位點(diǎn)位于NPC1蛋白中富含半胱氨酸的第8和第9跨膜區(qū)之間的內(nèi)環(huán)，這種突變可能導(dǎo)致該蛋白喪失脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能，從而使膽固醇、葡萄糖酰鞘氨醇、鞘糖脂GM2和GM3等脂類分子在細(xì)胞中沉積。

而胞體內(nèi)大量脂質(zhì)沉積，會阻礙不同神經(jīng)細(xì)胞的生長發(fā)育和它們之間的脂質(zhì)循環(huán)，影響神經(jīng)元胞膜、髓鞘和膠質(zhì)細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞變性壞死[2]。

圖1NPC1分子的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖目前，NPC1發(fā)病的病理機(jī)制、治療藥物篩選和開發(fā)是國際上生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究的前沿和熱點(diǎn)。

早期研究認(rèn)為神經(jīng)元胞漿脂質(zhì)沉積可能是導(dǎo)致NPC1神經(jīng)元功能障礙和死亡的主要因素，但在用多種方法降低或消除神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)后仍不能阻止或延緩神經(jīng)元變性和死亡。

因此，近年來的研究主要是從不同的視角來探討NPC1的發(fā)病機(jī)制。

首先，NPC1發(fā)病過程中神經(jīng)元細(xì)胞蛋白發(fā)生病變是導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)變性的重要原因。

WalterM,etal發(fā)現(xiàn)NPC1小鼠中Vimentin發(fā)生過度磷酸化，致使晚期胞內(nèi)體功能失活[3]。

而ChuaCC,etal認(rèn)為NPC1病變引起的載脂蛋白E（ApoE）異常糖基化跟神經(jīng)毒素A-beta片段的產(chǎn)生和聚集有關(guān)[4]。

BuB,etal發(fā)現(xiàn)NPC1基因突變引起神經(jīng)元的蛋白激酶Cdk5（celldivisionkinase5）活性明顯上調(diào)，導(dǎo)致Tau、神經(jīng)細(xì)絲以及MAP-2等細(xì)胞骨架蛋白高度磷酸化而引發(fā)神經(jīng)元纖維集結(jié)、變性或死亡[5]。

其次，NPC1在發(fā)病過程中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞異常活躍，引發(fā)系統(tǒng)發(fā)生過度的炎癥反應(yīng)，直接導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞的激活和神經(jīng)元受損之間發(fā)生惡性循環(huán)。

PresseySN,etal證實在NPC1突變小鼠發(fā)育后期的大腦中，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增加，胞體增生肥大，突起多、短、粗[6]，這些膠質(zhì)細(xì)會大量分泌性的神經(jīng)毒性片段A[7]，引起神經(jīng)元變性。

在NPC1疾病的藥物篩選和開發(fā)方面，美國和歐洲開始的比較早，并且在這方面投入了大量的人力和物力。

美國康乃爾大學(xué)醫(yī)學(xué)院的PipaliaNH博士、NIH的XuM博士、德國羅斯托克大學(xué)醫(yī)學(xué)院的HovakimyanM博士等研究團(tuán)隊均已發(fā)現(xiàn)一些藥物（如曲古抑素、帕比司他、-生育酚、四氫孕酮等)，在降低膽固醇和其他脂質(zhì)體的堆積方面，有一定的效果[8-10]。

另外，美國華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院的GelsthorpeME,etal通過分子伴侶修飾NPC1蛋白的突變結(jié)構(gòu)，使其恢復(fù)活性，在該病的治療方面也具有積極的意義[11]。

目前國內(nèi)對NPC1疾病的研究起步較晚，在研究深度和支持力度等方面同國外相比還存在一些差距，主要是在華中科技大學(xué)、北京大學(xué)以及浙江大學(xué)等重點(diǎn)大學(xué)進(jìn)行[12,13]。

但是，隨著我國政府對這類疾病的逐漸重視和對基礎(chǔ)研究資金投入的不斷增多，以及在該領(lǐng)域中日益加強(qiáng)的國際交流合作，將會使我們在有關(guān)NPC1疾病的分子病理機(jī)制和藥物開發(fā)等方面不斷有新的突破，在研究的內(nèi)容和水平上與國際上趨于同步。

綜上所述，目前對NPC1分子機(jī)制的研究主要集中在疾病發(fā)展后期與神經(jīng)系統(tǒng)變性相關(guān)的代謝機(jī)制以及治療藥物篩選等方面，但沒有涉及或闡明NPC1對早期胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，特別是神經(jīng)元發(fā)育分化的影響。

通過我們的初步研究將為進(jìn)一步研究NPC1的病理機(jī)制提供基礎(chǔ)性資料，為分析NPC1基因和疾病之間的關(guān)系奠定實驗和理論基礎(chǔ)，也可為臨床診斷和治療提供相關(guān)指導(dǎo)。

2.研究的實際意義和理論意義目前對于NPC1基因突變影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和病變的具體機(jī)制和發(fā)病機(jī)理并不清楚，以至于到現(xiàn)在為止還找不到有效的、具有針對性的臨床治療手段。

多年以來的研究結(jié)果認(rèn)為NPC1基因突變所導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇等脂類轉(zhuǎn)運(yùn)障礙是引起該病發(fā)生的主要原因，但對于圍繞NPC1蛋白的細(xì)胞信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和其所涉及的細(xì)胞發(fā)育過程知之甚少。

同時，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育本身就是一個非常復(fù)雜的過程，各種信號通路的有序調(diào)控構(gòu)成了這個系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，任何的差異和病變都會對其產(chǎn)生連續(xù)的、致命的影響。

因此，如果能從NPC1病的神經(jīng)發(fā)育基礎(chǔ)研究入手，研究NPC1基因突變對于神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育及其網(wǎng)絡(luò)信號調(diào)控過程的影響，不僅有助于我們正確了解NPC1的發(fā)病原因，而且能夠為NPC1針對性治療方案的設(shè)計開辟新的思路和理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

1.MaulikM,ThinakaranG,KarS.(2013)Alterationsingeneexpressioninmutantamyloidprecursorproteintransgenicmicelackingniemann-picktypec1protein.PLoSOne,8,e54605.2.VanierMT.(2010)Niemann-PickdiseasetypeC.OrphanetJRareDis,5,16.3.WalterM,ChenFW,TamariF,WangR,IoannouYA.(2009)EndosomallipidaccumulationinNPC1leadstoinhibitionofPKC,hypophosphorylationofvimentinandRab9entrapment.BiolCell,101,141-152.4.ChuaCC,LimML,WongBS.(2010)AlteredapolipoproteinEglycosylationisassociatedwithAbeta(42)accumulationinananimalmodelofNiemann-PickTypeCdisease.JNeurochem,112,1619-1626.5.BuB,LiJ,DaviesP,VincentI.(2002)Deregulationofcdk5,hyperphosphorylation,andcytoskeletalpathologyintheNiemann-PicktypeCmurinemodel.JNeurosci,22,6515-6525.6.PresseySN,SmithDA,WongAM,PlattFM,CooperJD.(2012)Earlyglialactivation,synapticchangesandaxonalpathologyinthethalamocorticalsystemofNiemann-PicktypeC1mice.NeurobiolDis,45,1086-1100.7.KodamA,MaulikM,PeakeK,AmritrajA,VetrivelKS,ThinakaranG,VanceJE,KarS.(2010)AlteredlevelsanddistributionofamyloidprecursorproteinanditsprocessingenzymesinNiemann-PicktypeC1-deficientmousebrains.Glia,58,1267-1281.8.PipaliaNH,CosnerCC,HuangA,ChatterjeeA,BourbonP,FarleyN,HelquistP,WiestO,MaxfieldFR.(2011)HistonedeacetylaseinhibitortreatmentdramaticallyreducescholesterolaccumulationinNiemann-PicktypeC1mutanthumanfibroblasts.ProcNatlAcadSciUSA,108,5620-5625.9.XuM,LiuK,SwaroopM,PorterFD,SidhuR,FinkesS,OryDS,MaruganJJ,XiaoJ,SouthallN,PavanWJ,DavidsonC,WalkleySU,RemaleyAT,BaxaU,SunW,McKewJC,AustinCP,ZhengW.(2012)-TocopherolreduceslipidaccumulationinNiemann-PicktypeC1andWolmancholesterolstoragedisorders.JBiolChem,287,39349-39360.10.HovakimyanM,PetersenJ,MaassF,ReichardM,WittM,LukasJ,StachsO,GuthoffR,RolfsA,WreeA.(2011)Cornealalterationsduringcombinedtherapywithcyclodextrin/allopregnanoloneandmiglustatinaknock-outmousemodelofNPC1disease.PLoSOne,6,e28418.11.GelsthorpeME,BaumannN,MillardE,GaleSE,LangmadeSJ,SchafferJE,OryDS.(2008)Niemann-PicktypeC1I1061Tmutantencodesafunctionalproteinthatisselectedforendoplasmicreticulum-associateddegradationduetoproteinmisfolding.JBiolChem,283,8229-8236.12.FuR,YanjaninNM,ElrickMJ,WareC,LiebermanAP,PorterFD.(2012)ApolipoproteinEgenotypeandneurologicaldiseaseonsetinNiemann-Pickdisease,typeC1.AmJMedGenetA,158A,2775-2780.13.ZhouSY,XuSJ,YanYG,YuHM,LingSC,LuoJH.(2011)DecreasedpurinergicinhibitionofsynapticactivityinamousemodelofNiemann-PickdiseasetypeC.Hippocampus,21,212-219.二、本課題的基本內(nèi)容，預(yù)計突破那些難題1.研究的基本內(nèi)容本課題將利用NPC1基因敲除小鼠（BALB/cNctr-Npc1m1N/J，浙江大學(xué)提供）作為該研究的模式生物，應(yīng)用分子生物學(xué)、組織免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等技術(shù)，初步研究NPC1疾病對于神經(jīng)元前體細(xì)胞的自我更新、增殖、遷移和分化等過程的影響。

根據(jù)神經(jīng)元分化時期，可將這部分研究分為3個內(nèi)容：

（1）NPC1疾病對于神經(jīng)元前體細(xì)胞發(fā)生增殖的影響，主要對比研究與神經(jīng)祖細(xì)胞增殖相關(guān)因子的表達(dá)和分布情況。

（2）NPC1疾病對于神經(jīng)元遷移定位能力的影響，主要對比分析與細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白標(biāo)志物的表達(dá)情況。

（3）NPC1疾病對于神經(jīng)元發(fā)育分化能力的影響，主要研究神經(jīng)元分化不同階段分子標(biāo)志的表達(dá)水平和分布情況。

2.突破難題（1）NPC1基因敲除小鼠的飼養(yǎng)、繁育和鑒定。

（2）NPC1胎鼠和幼鼠大腦的震蕩切片（3）原位雜交和WesternBlot方法的掌握三、課題的研究思路和方法，研究工作方案（包括已進(jìn)行的研究工作情況）和進(jìn)度計劃、中期成果1.研究思路和方法本課題將圍繞神經(jīng)元發(fā)育分化的問題，揭示NPC1病變對于神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育過程的影響，為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育疾病的早期預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

2.研究工作方案（1）根據(jù)不同實驗的要求，將不同時期NPC1的胎鼠（E13、E15、E17）和出生后（P1、P5）的幼鼠處死后，收集胎鼠和幼鼠的大腦，進(jìn)行固定，包埋，震蕩或冷凍切片用于免疫組化研究；或者用裂解液進(jìn)行勻漿、超聲破碎、抽提用于Westernblot和PCR實驗等，對照為野生型小鼠。

（2）大腦的普通形態(tài)學(xué)對比分析a.對比分析P1和P5時期NPC1突變型和野生型幼鼠的大腦的結(jié)構(gòu)、質(zhì)量、大?。籦.常規(guī)免疫組化對比分析P1和P5時期NPC1敲除型和野生型幼鼠的大腦皮層結(jié)構(gòu)和厚度。

（3）神經(jīng)元前體細(xì)胞增殖情況分析收集胎鼠和幼鼠大腦幼鼠的大腦結(jié)構(gòu)、質(zhì)量和尺寸對比分析HE、Nissl染色分析幼鼠的大腦皮層結(jié)構(gòu)熒光免疫組化、實時熒光定量PCR和Westernblot神經(jīng)細(xì)胞增值情況神經(jīng)元遷移情況顯示不同標(biāo)志性分子如pH3、Ki67、Pax6等神經(jīng)元分化情況顯示不同標(biāo)志性分子如Reelin、DCX等顯示不同標(biāo)志性分子如NeuroD、Tbr1、MAP2等免疫熒光組化、原位雜交以及WesternBlot等方法研究大腦皮層神經(jīng)前體細(xì)胞增殖情況；具體方法：

取E13、E15和E17天的胎鼠，研究細(xì)胞增殖期標(biāo)志物（如pH3、Ki67）和不同大腦皮層神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志物（如Pax6、Sox2、Hes5）的表達(dá)變化，分析不同時期胎鼠大腦皮層細(xì)胞的增殖情況。

（4）神經(jīng)元遷移定位能力的分析免疫熒光組化、原位雜交以及WesternBlot等方法研究與細(xì)胞遷移的相關(guān)因子如Reelin、mDAB、p35、DCX等的表達(dá)變化，綜合分析E15-P1時期大腦皮層神經(jīng)元遷移情況。

（5）神經(jīng)元發(fā)育分化能力的分析a.免疫熒光組化、實時熒光定量PCR以及WesternBlot等方法研究大腦皮層不同層面、不同時期的一些神經(jīng)元形成標(biāo)志物（如NeuN、NeuroD、Tbr1、ER81、MAP2等）的表達(dá)水平和分布情況，綜合分析E15-P1時期神經(jīng)元分化情況；b.免疫熒光雙染色以及WesternBlot分析神經(jīng)元突觸的形態(tài)發(fā)育情況；c.高爾基染色法（Golgistaining）分析神經(jīng)元軸突和樹突形態(tài)結(jié)構(gòu)。

3.進(jìn)度計劃2015.01-2015.04NPC1小鼠飼養(yǎng)、繁育和鑒定2015.05-2015.07大腦的普通形態(tài)學(xué)對比分析2015.08-2016.10神經(jīng)元前體細(xì)胞增殖情況分析2015.11-2016.01神經(jīng)元遷移定位能力的分析2016.02-2016.04神經(jīng)元發(fā)育分化能力的分析2016.05-2016.06撰寫總結(jié)報告，結(jié)題4.中期成果1.從多方面提供證據(jù)確定NPC1病變對于神經(jīng)元發(fā)生、分化和遷移等過程的影響。

2.爭取發(fā)表科研論文1篇。

四、研究工作的資料準(zhǔn)備情況1.指導(dǎo)教師閆欣和喬梁主要從事發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)方面的研究，在NPC1病的發(fā)病機(jī)理方面積累了豐富的研究經(jīng)驗，同時，他們已熟練掌握免疫熒光組化、實時熒光定量PCR