蛋白質(zhì)磷酸化研究之磷酸化抗體制備

蛋白質(zhì)磷酸化研究之磷酸化抗體制備北京義翹神州科技股份有限公司義翹神州CONTENT蛋白質(zhì)磷酸化介紹1蛋白磷酸化檢測方法2磷酸化抗體制備技術路線3磷酸化兔單抗開發(fā)案例分享4義翹神州蛋白質(zhì)磷酸化介紹01義翹神州蛋白質(zhì)翻譯后修飾磷酸化乙?；谆核鼗u基化脫酰胺基作用糖基化蛋白水解義翹神州/10.1007/s10337-019-03796-9蛋白質(zhì)磷酸化蛋白質(zhì)磷酸：是指在蛋白質(zhì)激酶催化下把ATP或GTPγ位磷酸基團轉移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的過程。蛋白質(zhì)磷酸類型：蛋白質(zhì)磷酸化類型蛋白質(zhì)磷酸化位點氨基酸與磷酸基團之間的bondO-磷酸化絲氨酸（Serine；Ser；S）磷脂鍵蘇氨酸（Threonine；Thr；T）酪氨酸（Tyrosine；Tyr；Y）N-磷酸化組氨酸（Histidine；His；H）氨基磷酸酯鍵精氨酸（Arginine；Arg；R）賴氨酸（Lysine；Lys；K）S-磷酸化天冬氨酸（Asparticacid；Asp；D）酸酐鍵谷氨酸（Glutamicacid；Glu；E）酰基磷酸化半胱氨酸（Cysteine；Cys；C）硫代磷酸酯鍵蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)義翹神州基因復制轉錄調(diào)控細胞膜功能代謝調(diào)控分子識別和信號傳遞肌肉收縮腫瘤發(fā)生蛋白質(zhì)磷酸化的生物學意義義翹神州DOI:

10.4161/cc.8.8.8147ERK通路示意圖信號轉導1）胞外信號轉導至胞內(nèi)2）信號級聯(lián)放大3）應答反應DOI:10.1016/j.ccell.2016.08.008檢測磷酸化判定蛋白活性義翹神州磷酸化蛋白檢測方法02義翹神州蛋白質(zhì)磷酸化檢測方法32P

同位素放射性標記法質(zhì)譜分析法磷酸化特異性抗體的免疫學方法義翹神州32P

同位素放射性標記法放射性同位素32P標記（γ-位的磷）的ATP為磷酸基團供體32P標記的磷酸基團轉移到底物蛋白分離反應混合物中的蛋白酶促反應SDS磷酸化目的蛋白X-光片放射自顯影或磷儲屏檢測義翹神州質(zhì)譜分析法義翹神州DOI:10.1016/B978-0-12-396456-4.00014-6磷酸化抗體的免疫學方法磷酸化抗體分類：泛磷酸化抗體磷酸化特定氨基酸表位抗體X-X-X-X-X-Y-X-X-X-X-XPR-X-R-X-X-S/TPH-F-P-Q-F-S-Y-S-A-S-GP

磷酸化基序抗體磷酸化抗體可用于ELISA、WB、FCM、IP、IHC等多種免疫學實驗磷酸化絲氨酸、磷酸化蘇氨酸、磷酸化酪氨酸義翹神州各檢測方法比較同位素標記優(yōu)點缺點質(zhì)譜法優(yōu)點缺點特異性抗體優(yōu)點缺點易于操作；數(shù)據(jù)解讀簡單；不受抗體質(zhì)量干擾放射性危害；無法確定磷酸化的具體位點；通量受限辨別不同蛋白質(zhì)異構體的能力；高度敏捷需要昂貴設備和專業(yè)人員操作普通常規(guī)設備；操作簡便；數(shù)據(jù)解讀簡單；高通量無法區(qū)分蛋白異構體；抗體依賴性義翹神州磷酸化抗體制備技術路線03義翹神州磷酸化抗體主要類型磷酸化兔多克隆抗體優(yōu)點：制備周期短、價格低缺點：非特異結合，批間有差異磷酸化鼠單克隆抗體優(yōu)點：技術成熟，批間穩(wěn)定缺點：篩選難度大磷酸化兔單克隆抗體優(yōu)點：特異性好、靈敏度高缺點：價格高義翹神州多肽設計原則：長度10-16氨基酸序列親水性序列免疫原性多肽結構序列同源性免疫原設計義翹神州兔多克隆抗體制備01多肽合成02動物免疫03抗體純化04抗體質(zhì)控05磷酸化多肽非磷酸化多肽多肽純度>95%兩只兔子4-5次免疫免疫成功率95%ProteinA純化磷酸化多肽純化非磷酸化多肽純化與非磷酸化多肽交叉反應<10%天然樣本檢測義翹神州雜交瘤技術流程YYYYYYYYYYYYYYYYYSplenocytesMyelomaHybridomacellsScreeningAmplificationpurification技術路線成熟，可進行多種功能性篩選，成本低、易操作義翹神州免疫效價與融合效果關系磷酸化多肽效價與非磷酸化多肽效價差值越大，獲得磷酸化特異性抗體的成功率越高義翹神州更多陽性抗體更好的多樣性識別更多表位開發(fā)人鼠蛋白抗體結構更穩(wěn)定親和力更高特異性更好靈敏度更高兔單抗的特點和優(yōu)勢義翹神州優(yōu)勢：種屬多樣、可介入、篩選方式靈活局限：周期長、非天然配對、特異性一般應用：大分子抗原、納米抗體、突變改造噬菌體Beacon優(yōu)勢：周期短、效率高、天然配對局限：成本高應用：成藥性抗體開發(fā)兔單抗篩選平臺比較義翹神州優(yōu)勢：周期短、天然配對、可介入、多樣性好局限：抗原需要標記、培養(yǎng)效率應用：小分子、功能基團的特殊表位抗體開發(fā)流式分選ImmunizationorInfectedSplenocytes

&

PBMCSingleBCellSortingRT-PCR&

InsertVectorExpressionRT-PCRFunctionAssayBCellCulture兔單克隆抗體制備義翹神州磷酸化抗體開發(fā)實例分享04義翹神州Phospho-ERK1/2(Thr202,Tyr204)

兔單抗開發(fā)01動物免疫02流式分選03單細胞培養(yǎng)04抗體質(zhì)控05免疫效價OD-B磷酸化多肽:0.65非磷酸化多肽:0.01磷酸化特異性B細胞：0.1%磷酸化特異性克隆比例：35%WB陽性磷酸化特異性克隆比例：50%義翹神州特異性驗證天然樣品驗證

多肽阻斷義翹神州AB+CalyculinA(100nM，30min)3510070554025KDaHelaHela抗體特異性識別磷酸化蛋白，磷酸化多肽可以阻斷抗體與細胞裂解的結合多種屬驗證HelaNIH-3T3Human細胞樣本Mouse細胞樣本義翹神州抗體可以檢測不同種屬的細胞裂解液靈敏度驗證義翹神州抗體親和力高，適用于檢測低豐度的磷酸化蛋白

義翹神州

多肽設計保證95%的免疫成功率分選后>90%靶點可獲得特異性抗體單B細胞培養(yǎng)成功率90%單B上清檢測抗體特異性單B細胞上清篩選高親和力抗體

單B細胞上清篩選功能性抗體1功能活性的磷酸化抗體磷酸化兔單抗開發(fā)總結123456關于“北京義翹神州”堅持自主研發(fā)生產(chǎn)打造中國生命科學研究“一站式”試劑與服務支撐平臺人才與設施榮譽資質(zhì)設施：

25,000+平米研發(fā)中心

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團隊：900+

碩士以上學歷占1/3