LightCycler480熒光定量PCR儀操作規(guī)程

LightCycler480熒光定量PCR儀操作規(guī)程

1.開機(jī)前請(qǐng)注意確保室溫在15-32℃,每次反應(yīng)最后一步都建議做降溫，降至37度維持

10秒（請(qǐng)不要更改默認(rèn)的升降溫速率），維持至少30秒。

2.為保持實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定，在系統(tǒng)運(yùn)行過(guò)程中，尤其是HRM熔解曲線信號(hào)采集時(shí)請(qǐng)不要在連接

儀器的計(jì)算機(jī)上進(jìn)行其他操作或同時(shí)打開超過(guò)10個(gè)實(shí)驗(yàn)文件進(jìn)行分析；HRM的實(shí)驗(yàn)采集

數(shù)據(jù)點(diǎn)每。C不要超過(guò)25個(gè)，溫度區(qū)間不要超過(guò)22℃。

3.請(qǐng)選用與羅氏原裝耗材高度一致的96孔板或8聯(lián)管（lOOul白色/透明矮管），在操作過(guò)

程中，切忌戴有粉末的乳膠手套或裸手接觸光學(xué)透性封板膜或8聯(lián)管蓋。

4.先開電腦和儀器，編輯程序后，再配制反應(yīng)液，不能使用預(yù)混ROX參比染料的

SYBRmix試劑，加樣封膜完畢后在板式離心機(jī)中1500xg（3000rpm）離心兩分鐘，排

除氣泡。

5.打開儀器后方的電源開關(guān)，儀器自動(dòng)進(jìn)行自檢，儀器正面兩盞燈呈桔黃色閃爍。打開

電腦，進(jìn)入系統(tǒng)，雙擊LightCycler480軟件圖標(biāo)，輸入軟件用戶名admin,密碼

MasterOlo如需安裝軟件則切換到LCinstall賬號(hào)，密碼Aal23456。儀器自檢完畢左邊

的燈變綠，右邊的燈仍為桔黃色。這時(shí)按擊燈右邊雙箭頭的開關(guān)，儀器的載板器會(huì)自動(dòng)

伸出，將準(zhǔn)備好的反應(yīng)板放入載板器中（反應(yīng)板的缺角在右下角）。再按一下帶雙箭頭

的開關(guān)，儀器的載板器會(huì)自動(dòng)縮入儀器內(nèi)，此時(shí)儀器能自動(dòng)檢測(cè)到反應(yīng)板，原來(lái)呈桔黃

色的燈會(huì)變綠，軟件中StartRun按鈕也同時(shí)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)（儀器不能空機(jī)運(yùn)行，也不能

只放適配器）。

6.設(shè)定完實(shí)驗(yàn)程序并編輯完樣本后（樣本信息可以在實(shí)驗(yàn)完成后編輯），點(diǎn)擊軟件中

StartRun按鈕，保存實(shí)驗(yàn)文件到數(shù)據(jù)庫(kù)指定文件夾中后運(yùn)行實(shí)驗(yàn)。點(diǎn)擊EndProgram

將進(jìn)入下一個(gè)程序可以正常分析，點(diǎn)擊AbortRun將終止實(shí)驗(yàn)而且數(shù)據(jù)不能分析。

7.軟件界面上出現(xiàn)RunComplete….標(biāo)識(shí)時(shí)?，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)運(yùn)行完畢，按儀器正面灰色按

鈕，使載板器伸出，取下反應(yīng)板，再按按鈕，使載板器縮回，關(guān)閉LightCycler480儀器

后方的電源開關(guān)，在電腦上分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

8.分析完實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)后保存結(jié)果，打印報(bào)告，并關(guān)閉電腦及總電源，拷貝數(shù)據(jù)時(shí)建議用光

盤或格式化的U盤，實(shí)驗(yàn)人員在離開PCR擴(kuò)增區(qū)時(shí)帶走用完的反應(yīng)板。

維護(hù)SOP

LightCycler480是一臺(tái)免維護(hù)的儀器。做任何維護(hù)工作前，須確認(rèn)主機(jī)電源已被關(guān)閉。

預(yù)防性維護(hù)：

1.檢查L(zhǎng)ightCycler480主機(jī)兩側(cè)與背后空間，確保無(wú)任何阻礙空氣流通的物品，包

括書本、紙張或窗簾等；

2.若主機(jī)表面和桌面有灰塵，用不起毛的軟布蘸少量清水擦拭干凈。

清潔性維護(hù)：

若有需要，可用性質(zhì)溫和的商品化清潔劑或70%的乙醇溶液對(duì)LightCycler48()主機(jī)表

面、熱循環(huán)96孔模塊和熱蓋進(jìn)行清潔。

清潔96孔熱循環(huán)模塊：

L用移液器移取125m70-75%乙醇溶液或異丙醇至所有孔內(nèi)；

2.15分鐘后，使用移液器對(duì)孔內(nèi)溶液進(jìn)行多次吹洗；

3.移除孔內(nèi)的液體，并使96孔模塊孔內(nèi)自然風(fēng)干；注意操作時(shí)不要讓清洗液腐蝕熱循環(huán)

模塊的涂層。

售后服務(wù)：

故障報(bào)修或?qū)浖氖褂霉δ芑蛘呦嚓P(guān)參數(shù)設(shè)置有任何問(wèn)題，請(qǐng)座機(jī)致電800-820-

8864或者手機(jī)400-820-8864o

LightCycler480Software1.5軟件操作（中文版）

第一部分基本界面及圖標(biāo)

Overview界面

物

Exit：關(guān)閉LC480軟件

刎

Logoff：從目前使用的數(shù)據(jù)庫(kù)中退出并可登陸其他的數(shù)據(jù)庫(kù)

翻

@Overview：點(diǎn)擊該圖標(biāo)進(jìn)入"Overview”界面

Navigator：點(diǎn)擊該圖標(biāo)進(jìn)入“Navigator”界面，可進(jìn)行數(shù)據(jù)的導(dǎo)入導(dǎo)出等操作，

1161Save：點(diǎn)擊該圖標(biāo)進(jìn)行保存

⑧Export：導(dǎo)出當(dāng)前打開的文件

Close：關(guān)閉當(dāng)前打開的文件

昌

/Print：打印當(dāng)前打開的窗口

Tools：打開“Took”界面，可進(jìn)行密碼修改，建立和編輯用戶，系統(tǒng)設(shè)置，查看數(shù)

@據(jù)庫(kù)狀態(tài)、儀器狀態(tài)、濾光片組合等操作

Help：查看軟件版本，操作說(shuō)明書等

二、NewExperiment界面

■LightCyclcr?480Softrarcrelease1.5.0

InstrumentVirtualLightCycler48096SystemI/NotConnectedDatabase:MyComputer(Traceable)

Window:|NevzExperiment3User:SystemAdmin

RunProtocolDataRunNotes

Fxperi-

ment

DetectionFormat|SYBRGreenI/HIJCcustomize^BlockSizePlateID|ReactionVolume|203ffBl

ColorCompID|LotNo|TestID|

.ProgramsS

.ProgramNameAnalysisMode

0⑥Program?

0

ReportX?

TemperatureTargets

⑥TargetfQAcquisitionModeHold(hh:mm:ss)RampRate「Acquisitions(perSecTargetStepSizefStepDelay

CMCQ(cyc?e^?

一[95:Nor-2?00:00:01:q.4:：o：0"IJ"

3⑧

@

0

1

Experi-

mentRunModule：編輯、運(yùn)行或查看PCR程序及查看PCR實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)

Subset

EditorSubsetEditor：點(diǎn)擊該模塊后可進(jìn)行子集的編輯

ile

SampleEditor：點(diǎn)擊后進(jìn)行樣品信息的編輯

AnalysisModule:點(diǎn)擊進(jìn)行結(jié)果分析或查看已保存的分析結(jié)果

K6bou

ReportModule：選擇需要的內(nèi)容以報(bào)告的形式給出結(jié)果

SummaryModule:查看實(shí)驗(yàn)的總體概況，包括實(shí)驗(yàn)名稱，所用的程序，檢測(cè)模

式，濾光片組合等。概況的內(nèi)容由系統(tǒng)自動(dòng)生成

三、Navigator界面

?LightCycler?480Softwarerelense1.5.0

Instrument:VinualLightCycier48096SystemI/NotConnectedDatabase:MyComputer(Traceable)

(RQCQ

Window:|Navigator□User:SystemAdmin

ExpenmerttnemeDemoAbsQuonlwithSYBRGieiA

NavigatorQuery

Createdcn2007-10188:38:15

-工JRootC<e<Xodby.SystemAdamn?l

*_?JAdhirutrabonLa?tnxxiitedon:200813115:34:43

LastmodifBdbySystemAdmin

?_Jhp

SoitwareveuonHTC13

-_|RocheReviaonhgtotyccmpJeteNo

三_|Expaments

|OemoAbsQuantwth$YBRGroen”RsSlattedat2005-6-911:24:49andcomplelet

G)DanoDualCokxHydrdyz訟PiobesInrtiumecinsmePilot-510

ImliumetiIDHTC_510

循DemoEndt>oniGenotypngPCR-Rcad

Oprr.iloiDemo

QDemoEndpantGenotypingPost-ReadNotesDetectionFWIMI:SYBRGieenI

公DemoGeneScamrgAbsoluteQuantificationwith*tand<wddilutionsn

QDemoMeltCurveGenotypngMcllmgCutveAnalysistodutmguixhspecificpt<

口DeonReiQuantDudCcioi

Progsam?

QDemoRdQuartMonoCola

I:Preincubation1CJFCteJt)None

傘DemoTmCaftngwithHybProbeProbes2'Amplification45cycle㈤Quanl

IMacro*?.MeltingCmve1cj.cle(.|Meltir

4Cooling1eyeleft)None

IPreferencesE]

?+-._jSpecialDaUBlocklype384wells

*_JTemplate?

-_|SystemAdmnDetectionCarnal:

：

?_UExper?nenlxNameSYBRGreen

IrtograbontmemodeManual

IMacro?01

：+!_|PreferencesFrtetcombrahons:

?_JSpecialDataAcirveName

圖_JTemplatesYetSYBRGieen(483533)

Analysemodiiec

1AbtQuanl/2ndDerivativeMax(oftype"Abt(

GeHedcc20079-2614.52:45

CrMtedSysteMAdmin

Results

I黑:霜]|Imp?！盵[Export[〔BatchImport](BatchExp

NewNewFolderOpenRenameDelete

(1)Navigator：保存的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和模板

L溫港]Problemreporting：儀器出現(xiàn)故障時(shí)生成一^t*問(wèn)題報(bào)告

I]Import：導(dǎo)入一個(gè)文件

[志。"]Export：導(dǎo)出一個(gè)文件

Ji"。"〕BatchImport：導(dǎo)入一批數(shù)據(jù)

I?…。"IBatchExport：導(dǎo)出一批數(shù)據(jù)

「嬴】New：新建一個(gè)實(shí)驗(yàn)或文件夾

NewFolder：新建一個(gè)文件夾

則」Open：打開一個(gè)文件

Rename：重命名

Delete：刪除選中的目標(biāo)

'Copy：拷貝選中的目標(biāo)

(2)Queny：設(shè)定條件進(jìn)行數(shù)據(jù)搜索和篩選

Note：所有上述圖標(biāo)在深藍(lán)色時(shí)為激活狀態(tài)，灰色時(shí)為滅活狀態(tài)也就是不可用狀態(tài)。

各圖標(biāo)的功能在不同狀態(tài)下以顏色來(lái)區(qū)分是否具備。

軟件操作

一.打開軟件

打開電腦，Windows操作系統(tǒng)的用戶名為operator,密碼為L(zhǎng)C480(區(qū)分大小

寫)。電腦操作系統(tǒng)啟動(dòng)完畢，檢查電腦右下角是否有令圖標(biāo)。如果沒(méi)有，點(diǎn)擊桌面

“Exor4forXDMS_R”快捷方式文件。然后右鍵點(diǎn)擊它圖標(biāo)，左鍵點(diǎn)擊“Show”，如最后一

句話顯示“Exor4serverisrunning”表示數(shù)據(jù)庫(kù)加載成功。如果顯示“Exor4failedtostart”則

表示數(shù)據(jù)庫(kù)沒(méi)有加載上，關(guān)閉該窗口，右鍵點(diǎn)擊e圖標(biāo)，選“Shutdown"，退出數(shù)據(jù)庫(kù)，

重新雙擊桌面“Exor4forXDMS_T”文件,加載數(shù)據(jù)庫(kù)。

然后點(diǎn)擊桌面“LightCycler480Software”快捷方式文件，運(yùn)行該軟件。

輸入用戶名和密碼。用戶名默認(rèn)為admin(管理者權(quán)限)，密碼為L(zhǎng)ightCycler480(區(qū)分

大小寫)，如用戶已經(jīng)建立新用戶名，則可以按照新用戶名登錄。

二.用戶管理

為了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效管理，可以建立不同級(jí)別的用戶。如：標(biāo)準(zhǔn)用戶(Standard

User)、專業(yè)用戶(ExpertUser)、管理者(LocalAdministrator)。一般實(shí)驗(yàn)室建議建

立專業(yè)用戶(ExpertUser)用戶名，然后以該用戶名登錄軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

建立新用戶操作：打開LightCycler480操作軟件，點(diǎn)擊右側(cè)［割按鈕打開“Tools”工

具欄，選擇“UserAccess/UsersandGroups”選項(xiàng)。在右邊窗口中點(diǎn)擊“NewUser”鍵，在右

邊“Entertheuser'sfullname”一欄中填寫用戶的全名，在“Enterthenametheuserwantsto

loginas”一欄填寫用戶登錄名，在“Entertheuser'spassword”一欄中輸入密碼(密碼須含

有6個(gè)以上字母，1個(gè)以上數(shù)字，其中有至少一個(gè)字母大寫)，在“Confirmthepassword”

一欄中重新輸入一次密碼，加以確認(rèn)，在“Selecttheuser'srole”一欄中選擇用戶級(jí)別，然

后點(diǎn)擊右下方“Close”按鈕加以確認(rèn)。

在國(guó)I“Tools”工具欄中的“SystemSettings”界面中可以設(shè)置各用戶級(jí)的權(quán)限，以及

密碼的時(shí)效。

新建檢測(cè)通道：在底卜Tools”工具欄中的“DetectionFormats”界面中，點(diǎn)擊“New”，

命名檢測(cè)通道名稱，根據(jù)實(shí)際檢測(cè)的熒光探針在界面右上角的filtercombination

selection,勾選每個(gè)探針?biāo)鶎?duì)應(yīng)的激發(fā)光波長(zhǎng)(Excitation)和檢測(cè)波長(zhǎng)(Emission)；在

右下角的list中Name欄目編輯每個(gè)通道對(duì)應(yīng)的探針名稱，并將每個(gè)探針的QuantFactor

設(shè)置為10,Maxintegrationtime改為2即可。

三.儀器自檢

每次開機(jī)時(shí)，儀器會(huì)自動(dòng)進(jìn)行初始化自檢程序。自檢通過(guò)，儀器左側(cè)指示燈變綠。

如放置了樣本，儀器右側(cè)指示燈變綠。在自檢時(shí)，不能放置反應(yīng)板，否則自檢無(wú)法通

過(guò)，如果儀器有配置八連管適配器，則應(yīng)注意該適配器日常不用時(shí)不能放入儀器中。

四.建立實(shí)驗(yàn)程序

打開LightCycler480操作軟件，成功登錄后點(diǎn)擊■一一二一瓶____J按鈕，進(jìn)

入NewExperiment/RunProtocol程序設(shè)置界面。在“DetectionFormat”一欄中選擇所使用

的熒光檢測(cè)技術(shù)，可選擇各類探針和染料，如常見的SYBRGreenl染料、MonoColor

HydrolysisProbe單色TaqMan水解探針、MultiColorHydrolysisProbe多色TaqMan水解

-Setup------------------------------------------------------------------------------

探針DetectionFormat[MultiColorHydrolysisProbt▼[

在進(jìn)行多色熒光PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，須點(diǎn)擊回E遺按鈕選擇用戶所采用的熒光檢測(cè)通道，

點(diǎn)擊確認(rèn)。

DetectionFormats

Dele島onFormatMultiColorHydrolysisProbe

-IntegrationTimeMode------------------------------------

t*Dynamic「Manual

o⑧

在ReactionVolume忸過(guò)一欄中填寫反應(yīng)體積。

在“Programs”界面中設(shè)置實(shí)驗(yàn)程序：在“ProgramName”下方命名程序，“Cycles”一欄

內(nèi)填寫該程序的循環(huán)數(shù)，在“AnalysisMode”一欄選擇該程序的分析模式。定量分析選擇

“Quantification”，溶解曲線分析選擇“MeltingCurves”,顏色補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)選擇“Color

Compensation”。

而后在“TemperatureTargets”界面內(nèi)設(shè)置所指定程序的內(nèi)容，在“Target(℃)”處填寫目

標(biāo)溫度，“AcquisitionMode”處選擇信號(hào)采集方式，“HokT一欄填寫該溫度所持續(xù)的時(shí)

間，“RampRate(℃/s)”處填寫升降溫速率。如一個(gè)程序有多個(gè)步驟，則在Temperature

Targets界面的左側(cè)處點(diǎn)擊⑥，增加步驟；也可點(diǎn)擊上下箭頭￡)(3調(diào)整各步驟的先后

順序。如一個(gè)實(shí)驗(yàn)中有多個(gè)程序，也可在“Programs”界面左側(cè)點(diǎn)L[十I,增加程序，也可

點(diǎn)擊上下箭頭調(diào)整各程序的先后順序。

實(shí)驗(yàn)程度設(shè)置完成后，在下方“Overview”界面內(nèi)會(huì)自動(dòng)生成溫度隨時(shí)間變化的溫控

曲線，以及估計(jì)的運(yùn)行時(shí)間，綠色點(diǎn)表示采集熒光信號(hào)的溫度和時(shí)間點(diǎn)，可以依照該圖

檢查一下程度設(shè)置是否正確。

|crIlghtCvder2480So內(nèi)二

Instrument:VirtualLightCycler48096SystemI■'NotConnectedDatabase:MyComputer(Research)

<1toche>

Window:|NewExperimentUser:SystemAdmin

IExperlRunProtocolDataRunNotme

DetectionFormat(MultiColorHydrolysisPCustomBlockSizePlateID|ReactionVolume

ColorCompID|LotNo「?TestID「H

Programs

ProgramNameCyclesAnalystsMode

pre-denatureiNone

AmplificationQuant1tication

HelclngCurveBeltingCurves

BlMCoolm9(None

0

AmplificationTemperatureTargets

TargetfQAcquisitionModi:Hold(hh:mm:ss)RampRatefAcquisitions(per"SecTargetfStepSizofStepDelay

魚

⑥qQQ(cycles)

〉

aai-

Al

設(shè)置好的實(shí)驗(yàn)程序可以保存成模板文件，下次使用同樣的實(shí)驗(yàn)程序時(shí)可以調(diào)用。具

I!....Apply....iO

.Template_I

SaveAs~

體操作如下：點(diǎn)擊工嬴PXJ按鈕右側(cè)的下拉箭頭，選中"SaveAsTemplate”選項(xiàng)，系統(tǒng)

默認(rèn)將實(shí)驗(yàn)程序模板文件保存在所登錄的用戶名下“Templates”目錄中，用戶可將其存放

在其下的子目錄“RunTemplates”下，填寫該程序模板文件的名稱，點(diǎn)擊T”按鈕即完成保

存。調(diào)用模板程序時(shí)可點(diǎn)擊“ApplyTemplate”按鈕，從目錄樹中選定所要調(diào)用的模板，點(diǎn)

擊按鈕確認(rèn)。

五.樣本設(shè)置

1、樣本亞組編輯：LightCycler480軟件擁有一個(gè)獨(dú)特的樣本編輯管理功能——亞

組編輯(SubsetEditor),即將反應(yīng)板上所有的樣本根據(jù)用戶需要分成亞組，對(duì)亞組進(jìn)行

獨(dú)立地分析定量。具體操作如下：

在“NewExperiment”界面中，點(diǎn)擊左側(cè)的?巡J按鈕，進(jìn)入Subset設(shè)置界面，點(diǎn)擊⑥

按鈕新建亞組，并給其命名。點(diǎn)擊國(guó)按鈕可復(fù)制所選定的亞組，點(diǎn)擊叵司按鈕可更改

所選定亞組的名稱，點(diǎn)擊“Delete”按鈕可刪除所選定的亞組。設(shè)置亞組：在Subsets界面

中選定要設(shè)置的亞組名，在右邊反應(yīng)板孔位處選定該亞組所包含的孔位，使所選定的孔

位中都出現(xiàn)深藍(lán)色凹陷的序，點(diǎn)擊下方的?"3按鈕加以確認(rèn)。

高

InctrumeotVirtualLightCycier4809&SystemI>'No<ConnedodDatabase:MyComputer(Research)

卸

Window:|N?wExp?dmn?TMsecSyMemAdmin

囹

蔗

函

H

S

⑧

IS3I

囹

設(shè)置亞組可以在一塊反應(yīng)板上實(shí)現(xiàn)多個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)，前提是這些檢測(cè)項(xiàng)目的實(shí)

驗(yàn)運(yùn)行程序都一致（這在使用T叫Man水解探針時(shí)比較容易實(shí)現(xiàn)），由于各檢測(cè)項(xiàng)目均

有各自的質(zhì)控對(duì)照，因而，設(shè)定亞組可以單獨(dú)對(duì)各檢測(cè)項(xiàng)目進(jìn)行分析。

2.樣本屬性編輯

點(diǎn)擊NewExperiment界面左側(cè)^司按鈕設(shè)置樣本信息。在“Workflow”一欄在選擇實(shí)

驗(yàn)方案：AbsQuant：絕對(duì)定量或定性分析；ReiQuant：相對(duì)定量；Scanning：基因掃

描；ColorComp：顏色補(bǔ)償；Tm：熔解溫度檢測(cè)；MeltGeno：熔解曲線法基因分型；

EndptGeno：終點(diǎn)法基因分型。

-Step1:SelectWorkflow-------------------------------------------------------------

「AbsQuant「ReiQuant「Scanning「ColorComp

CTm（'MeltGenoCEndptGeno

在SelectSainples/Subset選項(xiàng)中選定待編輯的樣本亞組：

-Step2:SelectSamples----------------

Subset:|HBVsamples二］

在界面右方編輯各樣本的名稱屬性等:

Pos：樣本在96孔板或384孔板上的位置；ReplOf：重復(fù)樣本設(shè)置;

SampleName：樣本名稱；QuantificationSampleType：定量樣本類型；Concentration：濃

度；TargetName：檢測(cè)類型。

-SelectFilterCombinations-------------AbsQuant-

Units[

F483-533廠558-610

一

PosColorReplOfSampleQuantificationConce