AbMole關(guān)于材料誘導(dǎo)異位骨形成的實(shí)驗(yàn)研究

AbMole|關(guān)于材料誘導(dǎo)異位骨形成的實(shí)驗(yàn)研究骨組織在非骨部位形成的異位骨化（HO）現(xiàn)象在臨床上具有重要意義。來(lái)自重慶口腔疾病和生物醫(yī)學(xué)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的DanLi,YucanJiang,PingHe等多名研究人員發(fā)表了題為《HypoxiaDrivesMaterial-InducedHeterotopicBoneFormationbyEnhancingOsteoclastogenesisviaM2/Lipid-LoadedMacrophageAxis》的研究成果。在該文章中，研究人員使用了購(gòu)自AbMole的rapamycin（目錄號(hào)M1768）、DFO（目錄號(hào)M5129）。研究主要探討了缺氧在材料誘導(dǎo)的異位骨形成中的作用機(jī)制。為了評(píng)估材料誘導(dǎo)骨形成的能力，將具有不同物理化學(xué)性質(zhì)的兩種鈣磷陶瓷（TCPB和MG）植入FVB小鼠的臀肌中。6周后，組織學(xué)分析顯示，MG植入物內(nèi)檢測(cè)到新骨形成，在脫鈣切片和非脫鈣切片中均能觀察到骨組織，而TCPB中未觀察到骨形成。這一結(jié)果證實(shí)了材料誘導(dǎo)異位骨形成的材料依賴性，同時(shí)也驗(yàn)證了FVB小鼠臀肌內(nèi)植入模型可用于研究材料誘導(dǎo)的異位骨形成。圖1TCPB和MG植入物中缺氧、HIF-1α表達(dá)和CaP誘導(dǎo)的骨形成。通過(guò)對(duì)MG和TCPB植入物中缺氧和HIF-1α表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，從植入后第1周到第2周，兩種植入物中的細(xì)胞都變得更加缺氧，且MG植入物比TCPB植入物更缺氧。具體表現(xiàn)為，MG植入物中pimonidazole水平更高，缺氧相關(guān)基因（如Aldoc、Xbp1、Ramp3、Slc2a1、Pfk1、Mcl1、Lrg1、Hif-1α等）顯著上調(diào)，Hif-1α基因在第1周和第2周的表達(dá)顯著高于TCPB植入物。圖2HIF-1α抑制劑（雷帕霉素和PX-478）對(duì)第1周MG和TCPB植入物中HIF-1α表達(dá)和巨噬細(xì)胞極化的影響。為了探究血管生成在材料誘導(dǎo)骨形成中的作用，對(duì)MG和TCPB植入物進(jìn)行了相關(guān)檢測(cè)。結(jié)果表明，無(wú)論是通過(guò)肉眼觀察CD31、α-SmoothMuscleActin（α-SMA）和Endomucin（EMCN）的免疫染色，還是進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析檢測(cè)血管生成相關(guān)基因（如Vegfb、Angpt4、Egf、Vegfc、Vegfd、Angpt1、Pecam1、Emcn、Eng）的表達(dá)，以及通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)Cd31、Emcn和Vegfa基因的表達(dá)，都未發(fā)現(xiàn)MG和TCPB植入物在第1周和第2周時(shí)血管形成存在差異。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：使用HIF-1α抑制劑（rapamycin和PX-478）處理后，MG植入物中HIF-1α陽(yáng)性細(xì)胞、Arginase1（ARG-1）陽(yáng)性細(xì)胞、F4/80陽(yáng)性細(xì)胞和CCR7陽(yáng)性細(xì)胞減少，Hif-1α和Arg-1基因表達(dá)顯著下調(diào)。同時(shí)，CathepsinK（CTSK）陽(yáng)性細(xì)胞和TRAP陽(yáng)性細(xì)胞減少，Trap和Ctsk基因表達(dá)降低。這表明HIF-1α抑制劑抑制了巨噬細(xì)胞向M2極化和破骨細(xì)胞生成。圖3時(shí)間依賴性HIF-1αHIF-1α抑制劑的激活和HIF-1抑制劑對(duì)腹膜內(nèi)注射后骨形成的影響。體外實(shí)驗(yàn)：在體外培養(yǎng)的骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞（mBMDMs）中，引入rapamycin后，Arg-1基因表達(dá)顯著下調(diào)，CD206陽(yáng)性細(xì)胞減少，但Cd163基因表達(dá)無(wú)顯著變化。低氧則顯著上調(diào)Arg-1基因表達(dá)，但對(duì)CD206陽(yáng)性細(xì)胞和Cd163基因表達(dá)影響不大。此外，rapamycin處理顯著下調(diào)了Trap和Ctsk基因表達(dá)，減少了TRAP陽(yáng)性細(xì)胞和CD61陽(yáng)性細(xì)胞；低氧則顯著上調(diào)了Trap和Ctsk基因表達(dá)，增加了TRAP陽(yáng)性細(xì)胞和CD61陽(yáng)性細(xì)胞。這些結(jié)果表明，HIF-1α抑制劑在體外抑制了巨噬細(xì)胞向M2極化和破骨細(xì)胞生成，而低氧則促進(jìn)了這些過(guò)程。通過(guò)對(duì)植入小鼠使用HIF-1α抑制劑（rapamycin和PX-478）和HIF-1α激活劑（desferrioxamine，DFO）來(lái)研究HIF-1α對(duì)材料誘導(dǎo)骨形成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后前2周腹腔注射Rapamycin和PX-478顯著抑制了MG植入物中的骨形成，而在術(shù)后2周內(nèi)注射DFO增強(qiáng)了MG植入物中的異位骨形成，甚至使非osteoinductive的TCPB也能形成異位骨。在第3周和第4周注射Rapamycin則不抑制骨形成。對(duì)mBMDMs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和靶向代謝組分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用rapamycin處理mBMDMs時(shí)，破骨細(xì)胞生成相關(guān)基因（如Trap、Ctsk、Mmp9、Itgb3、Nfact1、Dc-stamp、Ckb、Calcr、Atp6v0d2、Oc-stamp、Oscar等）和脂質(zhì)積累相關(guān)基因（如Srebf1、Lss、Hmgcs1、Slc25a1、Fads2、Scd1、Scd2等）顯著下調(diào)，總脂質(zhì)產(chǎn)生減少，其中磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰膽堿（PC）受影響最為明顯。低氧則增強(qiáng)了脂質(zhì)積累，增加了破骨細(xì)胞生成。當(dāng)在體外破骨細(xì)胞生成評(píng)價(jià)體系中引入脂質(zhì)積累抑制劑GW3965時(shí)，破骨細(xì)胞和脂質(zhì)滴減少；引入脂質(zhì)積累激活劑GSK2033時(shí)，破骨細(xì)胞和脂質(zhì)滴增加。此外，用cinnamycin滅活PE或用抗CD36抗體阻斷CD36時(shí)，破骨細(xì)胞形成受到抑制。通過(guò)培養(yǎng)MSCs與有無(wú)破骨細(xì)胞生成條件培養(yǎng)基以及含有rapamycin的條件培養(yǎng)基，來(lái)評(píng)估破骨細(xì)胞生成對(duì)MSCs成骨分化的影響。結(jié)果表明，與不含破骨細(xì)胞生成條件培養(yǎng)基的對(duì)照組相比，含有破骨細(xì)胞生成條件培養(yǎng)基的MSCs培養(yǎng)物中Alkalinephosphatase（ALP）產(chǎn)生和Alp基因表達(dá)增加，而當(dāng)破骨細(xì)胞生成培養(yǎng)基中存在rapamycin時(shí)，Alp基因表達(dá)和ALP產(chǎn)生受到抑制。同時(shí)，rapamycin處理還顯著下調(diào)了破骨細(xì)胞生成過(guò)程中Cthrc1和Sphk1基因的表達(dá)，降低了CT