FLP分子標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用2

AFLP分子標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用涪陵師范學(xué)院生命科學(xué)系主講人：江

波AFLP

分子標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用?一、什么叫AFLP？?二、AFLP?三、AFLP?四、AFLP的基本原理是什么？的實(shí)驗(yàn)過(guò)程怎樣？的應(yīng)用研究如何？?五、對(duì)AFLP的評(píng)價(jià)我們都知道世界是多姿多彩的，可以說(shuō)是五彩斑斕，花樣百出，無(wú)奇不有！從生物學(xué)這個(gè)角度來(lái)看，這到底是什么原因呢？主?要生是物是的因多為樣生性物主具要有包括多四樣個(gè)性層！次！即?。海窟z？傳多樣性、物種多樣性、生態(tài)系統(tǒng)多樣性和景觀多樣性。?而遺傳多樣性是其它多樣性的基礎(chǔ)，也可以說(shuō)，生物多樣性歸根到底就是遺傳多樣性。?那么大家知不知道遺傳多樣性是如何檢測(cè)的呢？a.多態(tài)性高；共顯性遺傳,在二倍體的生物中能區(qū)分純合與雜合狀態(tài)；在基因組中頻繁出現(xiàn),甚至貫穿分布于整個(gè)基因組；選擇中性；e.容易獲得；f.容易操作,自動(dòng)化程度高；h.所得數(shù)據(jù)可在實(shí)驗(yàn)室之間交流和比較?（1）形態(tài)學(xué)標(biāo)記?（2）細(xì)胞學(xué)標(biāo)記?（3）生化標(biāo)記?（4）分子標(biāo)記

我們這里講的AFLP就是一種分子標(biāo)記技術(shù)。它是AmplifiedFragment

LengthPolymorphism的簡(jiǎn)寫(xiě),g.重復(fù)性好；叫做擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性。分子標(biāo)記的歷史:?第一代分子標(biāo)記技術(shù)RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism,限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）?第二代分子標(biāo)記技術(shù)RAPD（Random

AmplifiedPolymorphicDNA,隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA ）?

AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphis,m擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性）?事實(shí)上,還有很多分子標(biāo)記技術(shù)像SSR、ISSR、SRAP（相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性）另外,還有現(xiàn)在號(hào)稱(chēng)為第三代分子標(biāo)記的SNP（單核苷酸多態(tài)性)等AFLP

的基本原理?基因組DNA經(jīng)兩種限制性內(nèi)切酶酶切,形成分子量大小不等的隨機(jī)限制性酶切片段,將特定的人工合成的短的雙鏈接頭連在這些片段的兩端,形成一個(gè)帶接頭的特異片段,通過(guò)接頭序列和PCR引物3ˊ端選擇性堿基的識(shí)別,對(duì)特異性片段進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增。最后只有那些兩端序列能與選擇性堿基配對(duì)的限制性酶切片段才能被擴(kuò)增；最后將選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物在高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳,尋找多態(tài)性擴(kuò)增片段。AFLP

的實(shí)驗(yàn)流程?模板制備?DNA的提?。⊿DS法和CTAB法）?酶切?連接?PCR擴(kuò)增(PCR

AMPLIFIED)擴(kuò)增片段通常用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,根據(jù)擴(kuò)增片段大小范圍選擇應(yīng)用4%一10%的凝膠電泳。?預(yù)擴(kuò)增(Pre-amplified)?選擇性擴(kuò)增(Elective

amplified)應(yīng)用放射自顯影、銀染、熒光測(cè)序儀等方法顯示結(jié)果,通過(guò)Gene-Scan,Gel-Compare等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。?擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳?結(jié)果分析DNA的提?。?/p>

SDS法和CTAB法）?SDS是Sodiumdodecylsulfa的te縮寫(xiě)稱(chēng)為十二烷基磺酸鈉,?CTAB是Cetyltrimethylammoniumbromide的縮寫(xiě)十六烷基三甲基溴化氨,?兩種都是去污劑,它們都能破壞細(xì)胞膜使膜蛋白變性沉淀,故而使核酸釋放出來(lái),另外,它還能保護(hù)DNA不受內(nèi)源核酸酶的降解。酶切? 為了使酶切片段大小分布均勻，一般采用兩個(gè)限制性內(nèi)切酶，一個(gè)用6個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶(常用EcoRI,、PstI或SacI)，另一個(gè)用4個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶(常用MseI、TaqI)。采用雙酶切的主要原因有:(1)多切點(diǎn)酶產(chǎn)生較小的DNA片段，而切數(shù)點(diǎn)較少的酶能夠減少擴(kuò)增片段的數(shù)目，因?yàn)閿U(kuò)增片段主要是多切點(diǎn)酶和切點(diǎn)數(shù)較少的酶組合產(chǎn)生的酶切片段，這樣就可以減少選擇擴(kuò)增時(shí)所需要的選擇堿基數(shù)。(2)雙酶切可以進(jìn)行單鏈標(biāo)記，從而防止形成雙鏈造成的干擾。 (3)雙酶切可以對(duì)擴(kuò)增片段數(shù)進(jìn)行靈活調(diào)節(jié)。(4)通過(guò)少數(shù)引物可產(chǎn)生許多不同的引物組合，從而產(chǎn)生大量的不同的 AFLP指紋。這樣，經(jīng)過(guò)酶切后就形成了三種類(lèi)型的酶切片段，如EcoRI/MseI酶切形成EcoRI一EcoRI片段、EcoRI一MseI片段、Mse工一MseI片段，由于AFLP技術(shù)革新成功的關(guān)鍵在于DNA的充分酶切，所以對(duì)模板質(zhì)量要求很高，要注意避免其它DNA污染和抑制物質(zhì)存在。連接?酶切后的DNA片段在T4

DNA

連接酶作用下與兩種內(nèi)切酶相應(yīng)的特定接頭相連接,形成帶接頭的特異性片段。接頭為雙鏈,由兩部分組成,一部分是核心序列,一部分是酶特定序列(能與酶切片段粘端互補(bǔ)),通常在酶特定序列中變換了一個(gè)內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的堿基,保證了連接片段不能再被酶切。只有遵循“引物擴(kuò)增原則”設(shè)計(jì)的接頭才能得到滿意的擴(kuò)增結(jié)果。PCR擴(kuò)增(PCR

AMPLIFIED)? 應(yīng)用與接頭相識(shí)別的引物進(jìn)行擴(kuò)增。AFLP引物由三部分組成:（1）5′端的與人工接頭序列互補(bǔ)的核心序列(coresequence（)2）限制性內(nèi)切酶特定識(shí)別序列(enzyme-specificsequence（)3）3′端的帶有選擇性堿基的粘性末端(selectiveextensio，n)其中AFLP接頭的設(shè)計(jì)(包括核心序列和酶特定序列)是關(guān)鍵之處，常用的多為EcoRI和MseI接頭，接頭和與接頭相鄰的酶切片段的堿基序列是引物的結(jié)合位點(diǎn)，合成的寡核苷酸接頭經(jīng)過(guò)94℃變性，37℃退火，4℃保存?zhèn)溆?；理論上每增加一個(gè)選擇性堿基，將只擴(kuò)增限制性片段的1/4，而在兩個(gè)引物上都有三個(gè)選擇性堿基的情況下，則僅獲得 1/4096的片段；也就是說(shuō)，只有那些兩端序列能與選擇堿基配對(duì)的限制酶切片段被擴(kuò)增。所以選擇性堿基是選擇用于擴(kuò)增的特定的限制性片段的一種精確而有效的方法；?預(yù)擴(kuò)增(Pre-amplified)?擴(kuò)增所用引物3′端有一個(gè)選擇堿基,通過(guò)預(yù)擴(kuò)增對(duì)擴(kuò)增模板進(jìn)行初步篩選,一方面可以避免直接擴(kuò)增造成的指紋帶型背景拖尾現(xiàn)象,另一方面可以避免直接擴(kuò)增由引物3′端3個(gè)選擇堿基誤配形成的擴(kuò)增產(chǎn)物。?選擇性擴(kuò)增(Electiveamplified)?預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)稀釋后進(jìn)行選擇性擴(kuò)增,使所需模板量不受限制。所用引物3′端有3個(gè)選擇堿基的延伸,通過(guò)3個(gè)選擇堿基的變換獲得豐富的DNA片段。AFLP

技術(shù)的改良? 內(nèi)切酶的應(yīng)用?有多種內(nèi)切酶組合如EcoRI、PstI、SacI、HindIII或Apal與MseI、TaqI用于AFLP 技術(shù)?只應(yīng)用一種內(nèi)切酶制備模板（單酶切）?也有應(yīng)用三種內(nèi)切酶的報(bào)道（三酶切）TE-AFLP? 引物的標(biāo)記及結(jié)果顯示?引物標(biāo)記已從同位素標(biāo)記發(fā)展到目前的熒光標(biāo)記,熒光標(biāo)記減少了同位素對(duì)人體的損害,同時(shí)使結(jié)果分析更加便利準(zhǔn)確,但費(fèi)用仍然很高,單酶切AFLP 法的引物不需要標(biāo)記,只需通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、紫外透射儀觀察結(jié)果,省時(shí)、方便,但溴化乙錠對(duì)人體有危害?，F(xiàn)有一種銀染法可以降低成本又對(duì)人體無(wú)害,但操作相對(duì)復(fù)雜繁瑣又費(fèi)時(shí)。? 其它類(lèi)型?AFLP 技術(shù)是基于對(duì)基因組DNA的分析而創(chuàng)建的,目前已有cDNA-AFLP ,還有甲基化敏感-AFLP。EcoR

IMse

I（限制性內(nèi)切酶）EcoR

I接頭Mse

I接頭EcoR

I引物+AMse

I引物+C（預(yù)擴(kuò)增）EcoR

I引物+AACMse

I引物+CAA（選擇擴(kuò)增）（連接）（電泳檢測(cè)）AFLP

的應(yīng)用研究?AFLP技術(shù)在植物研究上的應(yīng)用?基因定位及構(gòu)建遺傳圖譜?遺傳多樣性分析和種質(zhì)資源鑒定?輔助育種?研究基因表達(dá)與調(diào)控?居群的遺傳結(jié)構(gòu)與保護(hù)生物學(xué)研究?其它方面的應(yīng)用?AFLP結(jié)合BSA(分群分析法,Bulksegregateanalysi)s可進(jìn)行基因的快速定位；Ballvora利用AFLP技術(shù)結(jié)合BSA法精確定位了馬鈴薯的根包囊線蟲(chóng)抗病基因Grol；AFLP技術(shù)能找出因基因槍法或完整細(xì)胞電穿孔而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因大米中發(fā)生的隱藏的基因改變；對(duì)于構(gòu)建遺傳圖譜,AFLP被認(rèn)為是迄今最有效的分子標(biāo)記技術(shù)；近幾年來(lái),利用AFLP技術(shù)已對(duì)桉樹(shù)、楊樹(shù)、松樹(shù)、桃樹(shù)進(jìn)行了遺傳圖譜的構(gòu)建并取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展。AFLP技術(shù)在植物基因定位及構(gòu)建遺傳圖譜上的應(yīng)用AFLP技術(shù)在植物遺傳多樣性分析和種質(zhì)資源鑒定上的應(yīng)用?

種質(zhì)資源收集的遺傳多樣性可通過(guò)譜系記錄與DNA

指紋分析兩條途徑相結(jié)合,其目的是對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行分類(lèi)、描述雜合的類(lèi)群與雜合式樣、追索育種的歷史； AFLP在鑒定與評(píng)估種質(zhì)資源方面有廣泛的應(yīng)用前景；有人進(jìn)行了花生多態(tài)標(biāo)記的AFLP鑒定；有人用AFLP評(píng)估了太平洋西北小麥品種的遺傳多樣性；還有人用了 6個(gè)AFLP引物組合得到359個(gè)AFLP擴(kuò)增帶,對(duì)24個(gè)向日葵優(yōu)良品系的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。另周志勇等人采用雙酶切的方法,將AFLP技術(shù)應(yīng)用于人參、西洋參基因組指紋圖譜,發(fā)現(xiàn)二者在遺傳上有較近的親緣關(guān)系,但引種到我國(guó)吉林的西洋參與西洋參基因組DNA相比有一定變異,證明了AFLP分子標(biāo)記技術(shù)有望成為一種獨(dú)立的、確實(shí)可行的手段,用于人參、西洋參等藥用植物品種的鑒別。AFLP技術(shù)在植物輔助育種研究上的應(yīng)用? 在指紋圖譜技術(shù)出現(xiàn)以前,基因圖譜只能依靠植物的表現(xiàn)型和同工酶分析來(lái)建立DNA 指紋圖譜,特別是AFLP技術(shù)的出現(xiàn),使標(biāo)志的數(shù)量大大增加,進(jìn)而使分辨率大大提高；特定農(nóng)業(yè)性狀與標(biāo)志連鎖關(guān)系的建立在育種上有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,使得定向育種成為可能,不僅減少了育種的工作量,而且還使時(shí)間縮短,使人們能在植物生長(zhǎng)早期就預(yù)知它的某些性狀并加以篩選； Jonathan等人通過(guò)AFLP標(biāo)志研究番茄,發(fā)現(xiàn)許多DNA 標(biāo)志與番茄抗葉霉病菌的基因相聯(lián)系；同樣,ChristianeGebhardts小組發(fā)現(xiàn)29條AFLP標(biāo)志與馬鈴薯抗晚疫病菌的R1基因有關(guān),2條與抗孢囊線蟲(chóng)的基因有關(guān)；用相同的方法Matthews等也發(fā)現(xiàn)與白楊抗葉銹病相關(guān)的標(biāo)志；這種將傳統(tǒng)育種與現(xiàn)代分子生物學(xué)結(jié)合的分子標(biāo)記協(xié)助育種已被大量的采用。AFLP技術(shù)在植物基因表達(dá)與調(diào)控研究上的應(yīng)用?Bachem等人采用AFLP技術(shù)檢測(cè)了馬鈴薯塊莖發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)情況,他們利用3個(gè)引物組合,進(jìn)行塊莖發(fā)育不同時(shí)期的AFLP分析,得到了塊莖特異轉(zhuǎn)錄的片段TDFS,2個(gè)TDFS片段與關(guān)鍵基因LOX高度同源,且二者在塊莖的不同時(shí)期表達(dá)的量不一樣；表明了AFLP是研究基因表達(dá)非常有效的方法,可同時(shí)比較植物不同時(shí)期以及分離某些重要基因。AFLP技術(shù)在植物居群的遺傳結(jié)構(gòu)與保護(hù)生物學(xué)研究研究上的應(yīng)用Travis等1996年第一次將AFLP產(chǎn)生的220個(gè)多態(tài)標(biāo)記用于評(píng)估一種臨界于瀕危的黃芪屬(Astragalu)s植物（Astragaluscremnophylaxvar.cremnophylax）的3個(gè)已知居群的居群內(nèi)與居群間的多態(tài)信息含量和遺傳變異的分配,他們還用AMOVA 分析了居群間的分化；這些結(jié)果指出在居群內(nèi)存在空間上分離的組,與UPGMA 聚類(lèi)和主成分分析的結(jié)果一致；提出了保護(hù)這個(gè)物種的若干建議；Krauss和Peakell用AFLP對(duì)Persooniamolli的天然居群作了分析；Winfield1988年研究了英國(guó)Sevem地區(qū)黑楊亞種Populasnigrasubsp.Betulifol的ia遺傳多樣性；Breyne等1997年將Arabidopsisthalian作a為模式物種,用AFLP技術(shù)評(píng)估了基因組的多樣性；他們認(rèn)為AFLP 測(cè)十分相近的基因型之間的細(xì)微差異足夠靈敏,非常適合于評(píng)估居群內(nèi)與居群間的多樣性水平和描述種下水平的遺傳關(guān)系；他們也用AFLP測(cè)定天然居群和熱帶樹(shù)種的遺傳變異。其它方面的應(yīng)用?AFLP 技術(shù)除可以用于植物方面外還可以用于動(dòng)、微生物、寄生蟲(chóng)、昆蟲(chóng)、人群等方面。吳豐春等應(yīng)用AFLP技術(shù)采用單酶切對(duì)小鼠進(jìn)行了遺傳檢測(cè)的研究,為小鼠從DNA上的遺傳檢測(cè)提供了一種新的技術(shù)手段；AFLP技術(shù)在微生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用也相當(dāng)廣泛,在微生物分類(lèi)、基因標(biāo)定、親緣關(guān)系及遺傳多樣性研究都有不俗的表現(xiàn),特別是微生物的鑒定和品系分析方面更是成績(jī)可佳。在流行病檢測(cè)中AFLP 標(biāo)記已成為微生物病原體診斷的理想技術(shù)。在腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究中,腫瘤易感基因的檢測(cè)是首要任務(wù),而AFLP標(biāo)記為腫瘤基因組的檢測(cè)帶來(lái)了一種新的方法。是一種較為理想的技術(shù)。FukudaT等用cDNA-AFLP 法對(duì)大鼠高低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤基因組進(jìn)行對(duì)比檢測(cè),得到43條差異片段,通過(guò)篩選,克隆出與大鼠骨肉瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的4種差異表達(dá)基因；MajimaS等應(yīng)用同樣的方法克隆出與腎癌發(fā)生相關(guān)的一種新基因—Niban；YamamotoF應(yīng)用甲基化敏感-AFLP技術(shù)檢測(cè)了乳腺癌的基因變化。這些都會(huì)對(duì)以后研究腫瘤發(fā)病機(jī)制發(fā)揮重要作用。五、對(duì)AFLP的評(píng)價(jià)?AFLP技術(shù)特點(diǎn)?（1）所需DNA 量少,擴(kuò)增效率高,多態(tài)性強(qiáng),易于分辨。?（2）AFLP"標(biāo)記結(jié)果穩(wěn)定可靠,重復(fù)性強(qiáng),不受基因組來(lái)源和復(fù)雜度的影響,使不同時(shí)間、不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果可以進(jìn)行比較,有利于進(jìn)行回顧性研究,并促進(jìn)信息與資料的交流,達(dá)到資源共享。?（3）AFLP標(biāo)記呈典型的孟德?tīng)栠z傳,可作為物理圖譜和遺傳圖譜的聯(lián)系橋梁,用于構(gòu)建基因組高密度連鎖圖譜。?（4）圖譜構(gòu)建聚類(lèi)顯著,定位專(zhuān)一。?（5）AFLP對(duì)模板濃度不敏感,允許一定強(qiáng)度的共擴(kuò)增,樣本DNA量相差1000倍仍可獲得相同的結(jié)果。作為DNA指紋技術(shù)的評(píng)價(jià)? 眾多研究者對(duì)RFLP及SSR,RAPD,AFLP 四種分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行了比較分析,綜合考慮遺傳穩(wěn)定性和標(biāo)記系統(tǒng)機(jī)制(速度、費(fèi)用、可靠性),提出了標(biāo)記指數(shù)MI(Markerindex),MI是變異指數(shù)DI(Diversityindex和)有效復(fù)合比EMR(Eff