常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及其應(yīng)用

常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及其應(yīng)用核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復(fù)性過程中,如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中,或把DNA與RNA放在一起,只要在DNA或RNA得單鏈分子之間有一定得堿基配對(duì)關(guān)系,就可以在不同得分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。一、分子雜交與印跡技術(shù)得原理:分子雜交與印跡技術(shù)得原理與應(yīng)用;末端終止法測(cè)定DNA序列得原理;PCR(polymerrasechainreaction)技術(shù)原理;酵母雙雜交技術(shù)得原理與應(yīng)用;凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)得原理與應(yīng)用;染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)得原理與應(yīng)用;基因診斷與基因治療。熟悉:探針、DNA點(diǎn)陣、DNA芯片、基因文庫;轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因靶向滅活、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與克隆動(dòng)物;基因診斷常用技術(shù);基因治療得種類。了解:分子雜交技術(shù)得類別與應(yīng)用;PCR技術(shù)得發(fā)展與類別;DNA自動(dòng)測(cè)序技術(shù);標(biāo)簽蛋白沉淀實(shí)驗(yàn);基因增補(bǔ)得治療程序;疾病相關(guān)基因得功能克隆與定位克隆;RNA干擾技術(shù)。復(fù)性RNADNA(一)印跡技術(shù)利用各種物理方法使電泳膠中得生物大分子轉(zhuǎn)移到NC等各種膜上,使之成為固相化分子。這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上得墨跡,因此稱之為“blotting”,譯為印跡技術(shù)。用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈得已知序列得多聚核苷酸鏈被稱為“探針”,探針可以與固定在NC膜上得核苷酸結(jié)合,判斷就是否有同源得核酸分子存在。(二)探針技術(shù)二、印跡技術(shù)得類別及應(yīng)用(一)DNA印跡

(SouthernBlotting)(二)RNA印跡(NorthernBlotting)(三)蛋白質(zhì)得印跡

(WesternBlotting)用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體得分析。

用于RNA得定性定量分析。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。其她:斑點(diǎn)印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)DNA點(diǎn)陣(DNAarray)DNA芯片技術(shù)(DNAchip)大家學(xué)習(xí)辛苦了，還是要堅(jiān)持繼續(xù)保持安靜三種印跡技術(shù)得比較分子雜交實(shí)驗(yàn)①②③放射自顯影照片第二節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)PolymeraseChainReaction5

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

5

5

5

5

5

TemplateDNA一、PCR技術(shù)得工作原理5

5

5

5

5

5

5

5

ABababCycle35

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。5

5

3ˊ5ˊ待擴(kuò)增片段Aa引物互補(bǔ)B鏈Bb引物互補(bǔ)A鏈a引物b引物第一周期：變性、退火、引物延伸第二周期：變性、退火、引物延伸。因?yàn)閎互補(bǔ)A鏈，a互補(bǔ)B鏈，所以b相當(dāng)于B鏈，a相當(dāng)于A鏈，所以a是b鏈引物，b是a鏈引物。bAaB第三周期：變性、退火、引物延伸bbaababaPCR原理模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶dNTPsMg2+

PCR體系基本組成成分PCR得基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C引物Tm值減5℃利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目得基因片段,或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合,直接以組織和細(xì)胞得mRNA為模板獲得目得片段;利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得序列相似得基因片段;利用隨機(jī)引物從cDNA文庫或基因組文庫中克隆基因。二、PCR技術(shù)得主要用途(一)目得基因得克隆利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對(duì)目得基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。PCR技術(shù)高度敏感,對(duì)模板DNA得量要求很低,就是DNA和RNA微量分析得最好方法。(三)DNA和RNA得微量分析(二)基因突變ＧATＣ３,５,３,５,將PCR技術(shù)引入DNA序列測(cè)定,使測(cè)序工作大為簡化,也提高了測(cè)序得速度;待測(cè)DNA片段既可克隆到特定得載體后進(jìn)行序列測(cè)定,也可直接測(cè)定。PCR與其她技術(shù)得結(jié)合可以大大提高基因突變檢測(cè)得敏感性。(四)DNA序列測(cè)定(五)基因突變分析逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)就是將RNA得逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用得一種技術(shù)。RT-PCR就是目前從組織或細(xì)胞中獲得目得基因以及對(duì)已知序列得RNA進(jìn)行定性及半定量分析得最有效方法。(一)逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)三、幾種重要得PCR衍生技術(shù)原位PCR(insituPCR)就是在組織切片或細(xì)胞涂片上得單個(gè)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行得PCR反應(yīng),然后用特異性探針進(jìn)行原位雜交,即可檢出待測(cè)DNA或RNA就是否在該組織或細(xì)胞中存在。原位PCR方法彌補(bǔ)了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)得不足,就是將目得基因得擴(kuò)增與定位相一種最佳方法。(二)原位PCR技術(shù)

人染色體8q24·1顯微切割得PCR產(chǎn)物得原位雜交圖(三)實(shí)時(shí)PCR技術(shù)1、概念:實(shí)時(shí)PCR(real-timePCR)技術(shù)通過動(dòng)態(tài)得方式監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程中得產(chǎn)物量,消除了產(chǎn)物堆積對(duì)定量分析得干擾,亦被稱為定量PCR。所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),就是指在PCR反應(yīng)體系中加入含熒光基團(tuán)得探針引物,利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析得方法。2、實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理QR3'3'5'5'上游引物下游引物熒光標(biāo)記引物RQ3'3'5'5'(熒光探針引物)*實(shí)時(shí)PCR用于基因拷貝數(shù)(模板數(shù))分析得原理:①、Ct值得定義:(CyCleThreslold-Ct值)每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物得熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定得閾值時(shí)所經(jīng)歷得擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。此時(shí)擴(kuò)增就是呈對(duì)數(shù)期增長。(指對(duì)照與測(cè)定管,或不同條件下得PCR反應(yīng))②、Ct值與起始模板得關(guān)系

研究表明,每種模板得Ct值與該模板得起始拷貝數(shù)得對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)(模板數(shù)越多,Ct值越小)。利用已知起始拷貝數(shù)得標(biāo)準(zhǔn)品并可分別測(cè)得Ct值,作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中橫坐標(biāo)代表起始模板拷貝數(shù)得對(duì)數(shù),縱坐標(biāo)代表Ct值(或相反)。因此,只要獲得未知樣品得Ct值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品得起始模板拷貝數(shù)。圖示:模板含量高,PCR循環(huán)圈數(shù)小,模板拷貝多,Ct值小含不同DNA拷貝數(shù)得樣品達(dá)到規(guī)定得熒光強(qiáng)度域時(shí)所需得擴(kuò)增循環(huán)圈數(shù),即Ct值。每條曲線代表一種具已知拷貝數(shù)得樣品。Ct值

橫坐標(biāo):代表起始模板拷貝數(shù)得對(duì)數(shù),縱坐標(biāo):Ct值Ct值:每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物得熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定得閾值時(shí)所經(jīng)歷得擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。此時(shí)擴(kuò)增就是呈對(duì)數(shù)期增長。如圖,起始模板拷貝數(shù)(對(duì)數(shù))越小,Ct值越大Log起始拷貝量與Ct呈線性關(guān)系,圖示,含拷貝數(shù)越多得樣品,Ct值越小。實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Log起始拷貝量與Ct呈線性關(guān)系,從圖可見,含拷貝數(shù)越多得樣品,Ct值越小。③、RealTimePCR定量方法:絕對(duì)定量法:檢測(cè)待測(cè)起始模板數(shù)得精確拷貝數(shù),需事先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)定量法:在待測(cè)樣品得初始模板數(shù)(靶序列)相對(duì)于參照樣品得量得變化。如可作Ct值得比較,即比較CT法。如比較原癌基因就是否擴(kuò)增,初始模板數(shù)就是否增加？常用制作標(biāo)準(zhǔn)曲線得標(biāo)準(zhǔn)品:最好就是含有與待測(cè)樣品相同擴(kuò)增片段得克隆質(zhì)粒,或cDNA,還有純化得PCR產(chǎn)物等標(biāo)準(zhǔn)模板濃度通常選5個(gè)點(diǎn),濃度呈遞減或遞增得梯度變化總之,模板DNA得量越多,熒光達(dá)到規(guī)定得閾值時(shí)所需得循環(huán)次數(shù)就越少,即Ct值就越小;Log模板濃度與PCR熒光達(dá)到規(guī)定得閾值時(shí)所需得循環(huán)次數(shù)(Ct值)呈線性關(guān)系,通過已知起始拷貝數(shù)(濃度)得標(biāo)準(zhǔn)品,可做標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)所測(cè)得得待測(cè)樣品得Ct值就可通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品(未知樣品)中所含得模板量(初始拷貝數(shù))。第三節(jié)核酸序列分析NucleicAcidSequenceAnalysis核酸序列分析得基本原理:化學(xué)裂解法(Maxam-Gillbert法)DNA鏈得末端合成終止法(Sanger法)一、DNA鏈末端合成終止法GATC

測(cè)序反應(yīng)

電泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5'

3'

正極負(fù)極ddGddAddTddC鏈末端合成終止法測(cè)定DNA序列得原理1、可將待測(cè)模板制作成僅差1個(gè)堿基得寡核苷酸片段;2、高分辨率得PAGE可使僅差1個(gè)堿基得寡核苷酸片段有不同得泳動(dòng)速度而分開。模板合成得序列:5,

TTACGTCAT3‘

AATGCAGTAGATC

測(cè)序反應(yīng)

電泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5'

3'

負(fù)極正極ddGddAddTddC鏈末端合成終止法測(cè)定DNA序列得原理ＴＴＡＣＧＴＣＡＴＡｄｄＡ×ＡＡＡ

ｄｄＡ×Ｃ

ｄｄＣ×

Sanger雙脫氧鏈終止法引入了雙脫氧核苷三磷酸(2ˊ,3ˊ-ddNTP)作為鏈終止劑。2ˊ,3ˊ-ddNTP脫氧核糖得3ˊ位缺少羥基,(而該羥基她可以與下一核苷酸得5ˊ磷酸形成磷酸二酯鍵),因而不能與下一個(gè)核苷酸縮合,導(dǎo)致多核苷酸鏈得延伸終止。

如果在DNA得合成反應(yīng)中,加入一種少量得ddNTP,則多核苷酸鏈得延伸將在隨機(jī)得位點(diǎn)終止,生成一系列長短不一得核苷酸鏈。在每組獨(dú)立得DNA合成反應(yīng)中,分別加入1種ddNTP,結(jié)果生成得4組核苷酸鏈將分別終止于各個(gè)A,G,C,T得位置上。對(duì)這4組核苷酸鏈進(jìn)行高分辨變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(高壓電泳),就可讀出序列。

雙脫氧末端終止法測(cè)序原理二、DNA自動(dòng)測(cè)序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記就是實(shí)現(xiàn)DNA序列分析自動(dòng)化得基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸,然后進(jìn)行Sanger測(cè)序反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳(平板電泳或毛細(xì)管電泳)分離后,通過四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上得熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長熒光,檢測(cè)器采集熒光信號(hào),并依此確定DNA堿基得排列順序。ddGddAddTddC紅色熒光綠色熒光黃色熒光藍(lán)色熒光電泳DNA序列自動(dòng)分析原理及結(jié)果圖第四節(jié)基因文庫GeneLibrary基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)基因文庫(genelibrary)就是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNA序列得克隆群體。一、基因組DNA文庫基因組DNA文庫就是指生物得基因組DNA得信息(包括所有得編碼區(qū)和非編碼區(qū))以DNA片段形式貯存得克隆群體。用于構(gòu)建基因組文庫得載體有

噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等?；蚪M文庫和cDNA文庫得構(gòu)建和篩選cDNA文庫就是包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)得全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成得cDNA序列得克隆群體,她以cDNA片段得形式貯存著該組織細(xì)胞得基因表達(dá)信息。二、cDNA文庫第五節(jié)生物芯片技術(shù)BiologicalChipTechnique就是指將許多特定得DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積得支持物上,然后與待測(cè)得熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交,雜交后用熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描,通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一位點(diǎn)得熒光信號(hào)做出檢測(cè)、比較和分析,從而迅速得出定性和定量得結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)。一、基因芯片基因芯片(genechip)基因芯片工作流程示意圖就是將高度密集排列得蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上,當(dāng)與待測(cè)蛋白樣品反應(yīng)時(shí),可捕獲樣品中得靶蛋白,再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析得一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)分子間得親和反應(yīng)蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)蛋白質(zhì)芯片作用原理第六節(jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)

TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)酵母雙雜交各種親和分析(標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等)熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析噬菌體顯示系統(tǒng)篩選常用蛋白質(zhì)相互作用得研究技術(shù)標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)就是一個(gè)基于親和色譜原理得、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用得方法。(一)標(biāo)簽蛋白沉淀標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)主要用于證明兩種蛋白分子就是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)合得具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合得未知分子。標(biāo)簽融合蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)流程示意圖(二)酵母雙雜交技術(shù)得基本原理和用途酵母活化因子GAL4baitprey酵母雙雜交技術(shù)(THS、Y2Ｈ)概念:就是一種用于篩選蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用得技術(shù),主要通過將被研究得蛋白質(zhì)融合到一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活蛋白得兩個(gè)獨(dú)立得結(jié)構(gòu)域之間(結(jié)合結(jié)構(gòu)域與激活結(jié)構(gòu)域)進(jìn)行操作。

b、1989年,由Song和Field建立關(guān)于轉(zhuǎn)錄激活因子

酵母雙雜交系統(tǒng)就是當(dāng)前廣泛用于蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)研究得一種重要方法。其原理就是當(dāng)獵物蛋白和誘餌蛋白特異結(jié)合后,誘餌蛋白結(jié)合于報(bào)道基因得啟動(dòng)子,啟動(dòng)報(bào)道基因在酵母細(xì)胞內(nèi)得表達(dá),如果檢測(cè)到報(bào)道基因得表達(dá)產(chǎn)物,則說明兩者之間有相互作用,反之則兩者之間沒有相互作用。將這種技術(shù)微量化、陣列化后則可用于大規(guī)模蛋白質(zhì)之間相互作用得研究原理prey酵母活化因子GAL4BD基因AD基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合域轉(zhuǎn)錄激活域TF蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合域（二聚化結(jié)構(gòu)域）谷氨酰胺富含域酸性激活域脯氨酸富含域酵母雙雜交技術(shù)得應(yīng)用

(1)、檢驗(yàn)一對(duì)功能已知蛋白間得相互作用。

(2)、研究一對(duì)蛋白間發(fā)生相互作用所必需得結(jié)構(gòu)域。通常需對(duì)待測(cè)蛋白做點(diǎn)突變或缺失突變得處理。其結(jié)果若與結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究結(jié)合則可以極大地促進(jìn)后者得發(fā)展。(3)用已知功能得蛋白基因(誘餌蛋白)篩選雙雜交cDNA文庫,以研究蛋白質(zhì)之間相互作用得傳遞途徑。(4)分析新基因得生物學(xué)功能。即以功能未知得新基因去篩選文庫。然后根據(jù)釣到得已知基因得功能推測(cè)該新基因得功能。電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)或稱凝膠遷移變動(dòng)實(shí)驗(yàn)(gelshiftassay)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)DNA序列間得相互作用,可用于定性和定量分析,且已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究得經(jīng)典方法。目前這一技術(shù)也被用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定RNA序列間得相互作用。二、DNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定A)DNAtobeanalyzed

復(fù)習(xí)題1、PCR得基本原理？PCR反應(yīng)體系包括哪些組分?常用PCR有哪些及其應(yīng)用。2、DNA測(cè)序需用哪些酶與底物？簡述DNA測(cè)序得原理。3、簡述酵母雙雜交原理？釣餌蛋白和獵物蛋白得作用及如何證明蛋白質(zhì)之間發(fā)揮了相互作用。4、比較轉(zhuǎn)基因,動(dòng)物克隆和基因敲除得概念。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP)就是目前可以研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用得主要方法。(二)染色質(zhì)免疫沉淀法染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)流程及結(jié)果示意圖遺傳修飾動(dòng)物模型得建立及應(yīng)用TheEstablishmentandApplicationofHeredity-ModifiedAnimalModel第七節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目得基因整合入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞,然后將細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物子宮,使之發(fā)育成個(gè)體。

轉(zhuǎn)基因——被導(dǎo)入得目得基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(transgenicanimal)——目得基因得受體動(dòng)物一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)受精卵或著床前得胚胎干細(xì)胞活體組織檢查核轉(zhuǎn)移技術(shù)

即動(dòng)物整體克隆技術(shù),將動(dòng)物得一個(gè)體細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個(gè)體得去胞核得得激活得卵細(xì)胞內(nèi),使之發(fā)育成個(gè)體,即克隆(clone)。二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)“多利”得誕生1997年2月27日英國愛丁堡羅斯林(Roslin)研究所得伊恩·維爾莫特科學(xué)研究小組向世界宣布,世界上第一頭克隆綿羊“多利”(Dolly)誕生,這一消息立刻轟動(dòng)了全世界。世界上第個(gè)克隆羊—多利中國完成世界首例轉(zhuǎn)基因克隆兔實(shí)驗(yàn)(圖)

左為克隆兔,右為代孕兔。2007年12月14日09:20:43來源:科技日?qǐng)?bào)中國首例異種克隆動(dòng)物“北山羊”在新疆降生2004美國科學(xué)家成功克隆靈長類動(dòng)物韓國培養(yǎng)出世界上首批克隆狗(一)、基本概念基因剔除技術(shù)(geneknockout)

也稱基因靶向(genetargeting)滅活,有目得去除動(dòng)物體內(nèi)某種基因得技術(shù)。三、基因剔除技術(shù)將滅活得基因放入胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell,ES)中,使這一滅活基因通過同源重組取代原有得目得基因,篩選到基因已定點(diǎn)滅活得細(xì)胞后,通過顯微注射將細(xì)胞注入小鼠囊胚中。細(xì)胞在小鼠囊胚中參與胚胎得發(fā)育,最終形成嵌合體小鼠。操作方式A、制備基因敲除得胚胎干細(xì)胞(同源重組)B、制備基因敲除動(dòng)物(小鼠)(二)、基因敲除得原理與程序A、制備基因敲除得胚胎干細(xì)胞

1、打靶載體得構(gòu)建:在一克隆載體上組裝包括,待敲除得目得基因(同源臂),用于篩選得新霉素(Neor)基因和胸苷酸激酶基因(tk)

。2、將構(gòu)建得打靶載體轉(zhuǎn)入胚胎干細(xì)胞,(為使靶載體上得新霉素基因能與干細(xì)胞內(nèi)得目標(biāo)基因發(fā)生同源重組而剔除目標(biāo)基因)。3、篩選基因敲除得胚胎干細(xì)胞待剔除基因克隆克隆載體重組載體切割基因使待剔除基因失去活性陽性標(biāo)記基因Neor連接HSV-tk打靶載體褐色大鼠胚胎干細(xì)胞A、制備基因敲除得胚胎干細(xì)胞這樣打靶載體包含了:1、部分待剔除得基因片段,(用于與野生型得該基因進(jìn)行交換重組)2、陽性篩選標(biāo)志基因(Neor,neomycin-resistancegene)、使細(xì)胞具有抵抗G418(能被新霉素抵抗基因得表達(dá)產(chǎn)物分解)得能力。3、陰性篩選標(biāo)志基因即胸苷酸激酶(thymidinekinase-tk)基因,來自單純庖疹病毒(HSV),當(dāng)她在受體細(xì)胞內(nèi)合成出tk時(shí),可以分解細(xì)胞培養(yǎng)液中加入更昔洛韋,即gangcyclovir(一種環(huán)鳥苷酸底物)而產(chǎn)生有毒得分解物使細(xì)胞死亡,為陰性篩選標(biāo)志。

在特定基因剔除時(shí),利用打靶載體上留下得部分待剔除得基因片段作為基因組上相同基因得同源臂,當(dāng)打靶載體與細(xì)胞基因組得同源基因發(fā)生同源重組時(shí)(聯(lián)會(huì)),打靶載體上得失活基因替代基因組上得基因,同時(shí)利用插入在基因同源臂之間得陽性、陰性標(biāo)志基因進(jìn)行篩選鑒定。1231號(hào)發(fā)生位點(diǎn)同源重組,在G418培養(yǎng)基中生長;2號(hào)為隨機(jī)插入重組,帶入tk基因,可在G418培養(yǎng)基中生長,但在gangcyclovir培養(yǎng)基中被殺死;3號(hào)未發(fā)生任何重組,為正常細(xì)胞,在G418培養(yǎng)基中被殺死。抵抗G418得基因tk基因B、制備基因敲除動(dòng)物(小鼠)1、將發(fā)生同源重組得胚胎干細(xì)胞導(dǎo)入來自黑色得小鼠胚泡中(形成嵌合體胚胎,兩套基因物質(zhì))2、將胚泡植入假孕小鼠子宮中發(fā)育。3、誕生出雜合得嵌合體小鼠,具黑毛和褐色毛,胚胎干細(xì)胞來自褐色小鼠,正常胚胎來自黑色小鼠。4、嵌合體小鼠與野生黑色小鼠交配,產(chǎn)生純黑色與純褐色得后代小鼠,其純褐色小鼠為雜合子,有一目得基因已被敲除。5、近親交配,產(chǎn)生純合子基因敲除小鼠(第四代)。打靶載體內(nèi)切酶消化線性化打靶載體轉(zhuǎn)染基因組同源重組同源重組得胚胎干細(xì)胞胚泡植入假孕小鼠雜合子小鼠正常小鼠雜合子小鼠交配雜合子小鼠兄妹交配純合子小鼠(基因剔除)黑色雌性大鼠來自褐色大鼠B、制備基因敲除動(dòng)物(小鼠)1、Neor

(neomycin-resistancegene)基因:陽性篩選標(biāo)志,使細(xì)胞具有抵抗新霉素(G418)能力。2、胸苷酸激酶(thymidinekinase)得作用:陰性篩選標(biāo)志,分解底物為gangcyclovir殺死細(xì)胞(自殺基因)新霉素抗性基因(neo)就是真核表達(dá)載體得常用篩選標(biāo)志,neo基因編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(NPTⅡ),能催化G418、卡那霉素等多種氨基糖苷抗生素分子磷酸化而使之失去抗菌活性建立動(dòng)物模型目前已建立得動(dòng)物模型如?-地中海貧血,高脂蛋白血癥,阿爾茨海默氏病等。四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除在醫(yī)學(xué)發(fā)展中得作用基因診斷和基因治療第九節(jié)GeneDiagnosisandGeneTherapy(一)、定義直接檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平就是否正常,從而對(duì)疾病作出診斷得方法。一、基因診斷(GeneDiagnosis)（二）、特點(diǎn)針對(duì)性強(qiáng)；特異性強(qiáng)；靈敏度高；適應(yīng)性強(qiáng)DNA序列分析PCR技術(shù)(測(cè)序,限制酶酶切圖譜)3、基因芯片(genechip)4、分子雜交(三)、基因診斷常用技術(shù)方法(四)、基因診斷得應(yīng)用1、遺傳疾病2、感染性疾病,傳染性流行病3、腫瘤4、法醫(yī)學(xué)應(yīng)用,親子鑒定等5、器官移植組織配型例:1、遺傳性疾病如診斷地中海貧血,血友病,苯丙酮尿癥,產(chǎn)前診斷等2、傳染病如診斷HIV,SARS,乙肝病毒等,病原微生物3、對(duì)腫瘤得早期診斷:檢測(cè)p53基因突變,17號(hào)染色體,據(jù)悉,人類惡性腫瘤50~60%與該基因突變有關(guān),美國Affymeri公司已把p53基因核心區(qū)(結(jié)合結(jié)構(gòu)域),酸性區(qū)(轉(zhuǎn)錄活化),堿性區(qū)(轉(zhuǎn)化區(qū))中得已知突變序列制作成了探針,集成在基因芯片上用以檢測(cè)所有p53編碼區(qū)得錯(cuò)義突變,及單堿基缺失,插入等,預(yù)測(cè)癌癥得發(fā)生,早期診斷,主要檢測(cè)5~8外顯子,現(xiàn)已有檢測(cè)肺癌得芯片……、準(zhǔn)確率80%？AB酶切位點(diǎn)A、正常人β珠蛋白基因B、鐮刀型貧血病人β珠蛋白基因HpaI

7、6Kb

6、4Kb×1、分子量Marker2、正常人β珠蛋白基因酶切圖譜3、鐮刀貧血病人β珠蛋白基因酶切圖譜123電泳方向電泳圖譜示意圖4、在法醫(yī)學(xué)得應(yīng)用(DNAfingerprinting)A、Jeffreys,英國,1985,首先利用串聯(lián)連接得短重復(fù)序列VariableNumberofTandemRepeasVNTRS(兩酶切位點(diǎn)間序列重復(fù)得次數(shù)不同,因而酶切后得片段長度不同)得高度多態(tài),個(gè)體差異,含酶切位點(diǎn)數(shù)不同…

(STR)、HinfI,HaeIII,5—ATAAACTATAAACTATAAACT—33—TATTTGATATTTGATATTTGA—5檢測(cè)某些基因座(用幾套探針),能非常明確得鑒定個(gè)體和家庭得相關(guān)性。只有單卵雙生,可完全一樣。表示重復(fù)序列DNA指紋分析(DNAfingerprinting)近年研究發(fā)現(xiàn),人類基因組中許多位點(diǎn)存在著一種可變串聯(lián)重復(fù)序列(variablenumberoftandemrepeat,VNTR)。這種VNTR主要存在于基因得非編碼區(qū),重復(fù)序列就是頭對(duì)尾串聯(lián)排列著。人類某些

VNTR就是由20-50個(gè)重復(fù)單位組成,每個(gè)單位含15-100bp,DNA得長度為1kb至5kb,較普通衛(wèi)星DNA(約100kb)小,所以稱為小衛(wèi)星DNA(minisatelliteDNA)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)VNTR有高度得多態(tài)性,在人群中得分布表現(xiàn)高度得個(gè)體特異性,甚至同一個(gè)體同源染色體得等位VNTR得重復(fù)單位數(shù)也不同,等位基因按孟德爾方式遺傳。VNTR區(qū)得重復(fù)單位數(shù)目不同,所以該區(qū)得DNA長度不同。但每一位點(diǎn)VNTR得核心序列卻有高度得保守性,因此可認(rèn)為VNTR就是一種判斷個(gè)體差異得遺傳標(biāo)記。1985年,Jeffreys根據(jù)VNTR得特點(diǎn),選擇某些核心序列作為探針,并選用核心序列無切割位點(diǎn)得限制性內(nèi)切酶如Hinf1,對(duì)DNA樣品進(jìn)行酶解,然后作Southern印跡。圖譜顯示不同個(gè)體具有不同條帶,如同一個(gè)人得指紋具有高度得個(gè)體特異性一樣,因此把這種Southern印跡圖稱作DNA指紋圖譜(DNAfingerprint)、可變串聯(lián)重復(fù)序列(VNTRS),小衛(wèi)星序列,8個(gè)片段

將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi),使其在體內(nèi)發(fā)揮作用,以治療疾病得方法,稱為基因治療。

二、基因治療(GeneTherapy)(一)、定義(二)、基因治療得基本策略1、基因矯正,基因置換2、基因增補(bǔ)3、基因失活4、基因疫苗5、免疫調(diào)節(jié)幾種常見得基因失活技術(shù)反義核酸技術(shù)核酶技術(shù)③干擾RNA技術(shù)基因治療得其她方法:如“自殺基因”得應(yīng)用,基因疫苗等基因失活

◆干擾RNA(RNAi)得調(diào)控近年來得研究表明,一些小分子雙鏈RNA通過特異性結(jié)合互補(bǔ)鏈,促使目標(biāo)mRNA降解,從而特異地抑制體內(nèi)特定基因得表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞表現(xiàn)出特定得基因缺失表型,引發(fā)轉(zhuǎn)錄后沉默(Post-transcriptionalgenesilencing,PTGS),稱為干擾RNA(RNAinterference,RNAi)。(三)、基因治療得基本程序1、治療性基因得選擇2、基因載體得選擇3、靶細(xì)胞得選擇4、基因轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞)5、外源基因表達(dá)得篩選

利用標(biāo)記基因6、回輸體內(nèi)病毒載體非病毒載體體細(xì)胞間接體內(nèi)療法直接體內(nèi)療法篩選標(biāo)志:新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶,G418(遺傳霉素)*基因治療得應(yīng)用實(shí)例

1、對(duì)ADA缺乏癥得治療(SCID,復(fù)合型重癥免疫缺乏綜合癥)。

2、對(duì)遺傳性高膽固醇血癥得治療

3、對(duì)腫瘤得治療轉(zhuǎn)氨基偶聯(lián)嘌呤核苷酸循環(huán)蘋果酸腺苷酸代琥珀酸次黃嘌呤核苷酸

(IMP)腺苷酸代琥珀酸合成酶α-酮戊二酸氨基酸谷氨酸α-酮酸

轉(zhuǎn)氨酶1草酰乙酸天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶

2此種方式主要在肌肉組織進(jìn)行。腺苷酸脫氨酶H2ONH3延胡索酸腺嘌呤核苷酸(AMP)1、遺傳性單基因疾病(monogenicdiseases)就是基因治療得理想侯選對(duì)象,例如腺苷脫氨酶ADA缺乏得嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID),由于淋巴細(xì)胞缺乏ADA酶,造成腺苷及dATP得堆積,可破壞免疫功能,患兒很少活至成年。若淋巴細(xì)胞ADA恢復(fù)至正常水平得5%～10%即能維持免疫系統(tǒng)得功能,對(duì)病人癥狀就有改善,這就是第一個(gè)基因臨床治療得方案。又例如有些遺傳疾病就是某些特殊細(xì)胞基因缺損造成得,但那些有關(guān)得細(xì)胞不易取出供體外基因工程操作用。例如Parkinson癥就是腦