靜注加替沙星在家兔體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究

靜注加替沙星在家兔體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究1、背景加替沙星是第四代喹啉羧酸類喹諾酮抗生素，其為一種DNA旋轉(zhuǎn)酶抑制劑，作用于細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶，干擾DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的解旋，從而阻礙DNA的復(fù)制，而呈現(xiàn)殺菌作用。該藥于1999年12月在美國首次上市，因抗菌譜廣、生物利用度高、抗菌活性強(qiáng)、毒副反應(yīng)小,已廣泛應(yīng)用于臨床、預(yù)防和治療多種細(xì)菌和支原體感染性疾病。該藥具有重要的藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征，較適合用于藥物代謝動(dòng)力學(xué)初學(xué)者的研究。2、目的熟悉藥物代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)基本流程，并設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。熟練動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作，樣品處理及高效液相色譜儀的使用。掌握藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)處理及參數(shù)的計(jì)算。3、材料與儀器3-1、動(dòng)物：健康家兔一只（2kg）3-2、試劑：烏拉坦，普魯卡因，加替沙星氯化鈉注射液(0.2g:100mL)，肝素，加替沙星對(duì)照品，高氯酸，醋酸銨（分析純），乙腈（分析純）。3-3、儀器：電子稱，注射器(50mL,10mL,1mL)，秒表，離心機(jī)，兔臺(tái)，手術(shù)器械，BP管，移液槍，Agilent高效液相色譜儀。4、實(shí)驗(yàn)方法4-1、樣品的制備4-1-1、樣品的采集取健康家兔進(jìn)行稱重，耳緣靜脈注射烏拉坦5mL/kg進(jìn)行麻醉。把家兔固定于兔臺(tái)上，股動(dòng)脈插管供取血用，手術(shù)畢，于家兔另一耳緣將加替沙星注射液按30mg/kg體重給藥，在給藥后分別于2,5,10,15,30,45,60,90,120min時(shí)進(jìn)行血液采集，每次血量約0.5mL并置于裝有肝素的BP管內(nèi)待離心。4-1-2、樣品的制備將取得的全血12000rpm,10min高速離心得血漿，吸取上層血漿100ul置于另一潔凈BP管內(nèi)。4-2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立4-2-1、標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品的制備精密稱取50mg加替沙星置于50mL量瓶中，加甲醇使溶解至刻度，作為加替沙星工作液，吸取上述加替沙星工作液5mL于50mL量瓶加甲醇至刻度，配制成溶液（100ug/ml)，吸取上述溶液，二倍稀釋，制備標(biāo)準(zhǔn)溶液：濃度為：50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39ug/mL，以10uL標(biāo)準(zhǔn)溶液加入90uL空白血漿制備標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品。4-2-2、樣品處理標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品中加入高氯酸100ulL，3min渦旋，12000rpm高速離心10min。4-2-3、色譜條件色譜柱：ODS-SP5μm4.6×150mmInersilC18色譜柱；流動(dòng)相：醋酸銨：乙腈=80:20，預(yù)先混合并超聲脫氣；流速:1.0mL/min；檢測波長:294nm；柱溫:40℃。4-2-4、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取上清液，使用100uL微量注射器進(jìn)樣60uL，測定峰面積，以峰面積對(duì)濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。4-3、樣品中加替沙星含量的測定以上述4-2-2方法處理樣品，并依照上述方法進(jìn)樣分析，記錄峰面積。4-4、藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果由半對(duì)數(shù)-時(shí)間曲線預(yù)測該藥物符合二房室模型。（文獻(xiàn)表明，口服給藥符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)）藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)擬合,按藥物代謝動(dòng)力學(xué)程序軟件Kinetica,得出結(jié)果如下。單劑量靜脈注射二室模型表達(dá)式:C=42.67e^(-12.68t)+11.95e^(-0.6528t)初始血藥濃度C0=54.62(μg/mL);藥物的分布半衰期t1/2a=0.055(h);藥物的消除半衰期t1/2b=0.275(h);由中央室到周邊室的一級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)速率常數(shù)K12=7.531(h-1);由周邊室到中央室的一級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)速率常數(shù)K21=3.286(h-1);藥物自中央室消除的一級(jí)消除速率常數(shù)Kel=2.520(h-1);藥物自體內(nèi)消除的總清除率Clb=1.994(L/kg/h);血藥濃度-時(shí)間曲線下總面積AUC=21.68(μg/mL?h);Vc=0.05492(L)，Vss=0.1808（L），Vz=0.2120（L）;平均駐留時(shí)間MRT=1.306h6、討論1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)的比較DoseC0t1/2at1/2bK12K21KelAUCClVc實(shí)測30mg/kg54.620.0550.2757.5313.2862.5221.680.1380.054文獻(xiàn)40mg/kg39.690.0221.42923.906.2912.4816.001.2490.504由上述表格的對(duì)比中可以看出，我們的數(shù)據(jù)存在較大的出入，可能的原因有，1）我們所采用的計(jì)算軟件不同，文獻(xiàn)采用了3p87而我們采用的是Kinetica，不同的軟件可能會(huì)存在一定差別。2）樣品的采集中出現(xiàn)問題，在實(shí)驗(yàn)過程中，我們發(fā)現(xiàn)我們組所得到的樣品峰面積大約小其他組一倍多，可能是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)給藥不足，也可能是由于采血時(shí)操作不當(dāng)，造成血液的大量外流引起了稀釋。3）動(dòng)物的個(gè)體差異性。2、取血點(diǎn)的設(shè)置，本次實(shí)驗(yàn)采用的取血點(diǎn)與文獻(xiàn)中1,3,5,7.5,15,30,60,120,180,240,360min略有差別，因?yàn)殚_始時(shí)的采血點(diǎn)過密會(huì)給操作帶來麻煩，考慮到我們實(shí)驗(yàn)課時(shí)限制，并保證能有三到五個(gè)半衰期的情況下，我們將采血點(diǎn)設(shè)置為2,5,10,15,30,45,60,90,120min，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看實(shí)驗(yàn)點(diǎn)設(shè)置還是比較科學(xué)，每個(gè)點(diǎn)測得的血藥濃度也都在定量限內(nèi)，采集的總血量也是在家兔可承受的范圍呢，且得到的藥時(shí)曲線各個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)分布均勻。另外，此次實(shí)驗(yàn)中，我們所選擇的采血方法是股動(dòng)脈采血，這種方法使采血變得簡便可控，但是在實(shí)驗(yàn)過程中不可避免的會(huì)造成血量的流失，會(huì)造成對(duì)動(dòng)物的損傷，這點(diǎn)需要注意。3、方法學(xué)的建立，高效液相色譜法進(jìn)行定量分析分為外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法，本實(shí)驗(yàn)中我們采用的是外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法，由實(shí)驗(yàn)可以看出這種方法較適合。色譜條件我們依據(jù)以往實(shí)驗(yàn)選擇波長294nm，流動(dòng)相pH值3.5，柱溫40度，其中波長由檢測紫外吸收確定，柱溫，pH由預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。4、方法學(xué)驗(yàn)證的問題：由于課時(shí)限制我們并未對(duì)建立的測定方法進(jìn)行方法學(xué)的驗(yàn)證，包括干擾性、回收率、精密度等等，尤其我們還應(yīng)注意到，我們的血漿樣品從采集到測定間隔了一個(gè)月左右，冷藏期間血藥濃度是否會(huì)發(fā)生變化，有條件的話也應(yīng)驗(yàn)證。