分子生物學技術在昆蟲系統(tǒng)學研究中的應用

分子生物學技術在昆蟲系統(tǒng)學研究中的應用摘要：分子牛物學技術應用于昆蟲系統(tǒng)學研究，是50年代末新興起來的，近年來發(fā)展相當迅速。為了把握這個研究方向，并促進這個研究領域的發(fā)展，作者從研究方法、研究內(nèi)容、研究對象等方面著手，近10年來分子生物學技術應用于昆蟲系統(tǒng)學，并對其的研究進展進行了概括和總結。介紹了DNA序列測定、RFLP、分子雜交技術、RAPD、SSC及DSCP等幾種主要方法及其應用情況，并從分類鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分析、分子進化、遺傳變異及進化研究等方而總結了已有的研究成果，日前已進行過分子系統(tǒng)發(fā)育研究的昆蟲類樣進行了列表總結。關鍵詞：分子生物學技術；昆蟲系統(tǒng)學.PERSPECTIVEOFMOLECULARBIOLOGICALTECHNIQUESAPPLIEDININSECTSYSTEMATICSAbstract：Anewareaofentomologicalscienceformsasmolecularbiologicaltechniqueswereappliedininsectsystematics.Sinceitscommencementin1980's,muchimportantprogresshasbeenmadeandmanyexcellentresultshavebeenachievedespeciallyinrecentfewyears.Inordertohaveagoodperspectiveonthisnewarea,thispaperfocusesonthemainthemesandmethodsincludedinthisarea,andgivesanoutlinetotheprogressintherecent10years.ThemethodsmainlyusedinthisareaincludeDNAsequencing,RFLP,molecularridization,RAPD,SSCPandDSC，whicharediscussedinthepaper.Theirapplicationsintaxonomyandidentificationofspecies,phylogenyreconstruction,molecularevolution，populationecologyandevolution,aresumma-rued.Thereisalsoalistofinsectgroupswhichhavebeenstudiedinmolecularsystematics.Keywords：molecularbiologicaltechnique；insectsystematics前言：本世紀70年代，由于限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn),DNA重組技術的建立,DNA序列快速測定方法的發(fā)明，分子生物學及其技術以迅猛的速度發(fā)展。80年代，PCR技術的產(chǎn)生和發(fā)展，加速了分子生物學技術在生物學各研究領域的廣泛應用，分子生物學技術應用于昆蟲系統(tǒng)學研究中，始于本世紀80年代末，近些年來發(fā)展迅速，通過研究昆蟲核酸分子的結構來探求各類群之間的親緣和進化關系，從生命的本質上子找昆蟲各類群之間的內(nèi)在聯(lián)系。作者從研究方法、研究內(nèi)容及研究對象二方面對近10年來昆蟲分子系統(tǒng)學的研究進展作簡要的綜述。正文：1研究方法前用于昆蟲分子系統(tǒng)學研究的卞要方法有核酸序列分析(DNAsequenceanalysis)、RFLP(限制性片段長度多態(tài)性分析，Restrictionfragmentlengthpolymorphism)、分子雜交技術(Molecularhybridization),RAPD(隨機擴增DNA多態(tài)性分析，RandomamplifiedpolymorphicDNAI),SSCP(單鏈構象多態(tài)性，Singlestrandconformationalpolymorphism)和DSCP（鏈構象多態(tài)性，Doublestrandconformationalpolymorphism)分析等方法[1]。1.1DNA序列分析DNA序列分析是通過直接比較不同類群個體同源核酸的核茸酸排列順序，構建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，并推斷類群間的系統(tǒng)演化關系、最可靠的方法。但序列分析耗資較大，也很費時，所以不適[2]宜于大群體的遺傳進化研究。但隨著生物技術的不斷提高，藥品、試劑盒及酶制劑越來越廉價，此方法將會得到廣泛應用。此方法與RFLP及DSCP等其它方法相結合，可快速而經(jīng)濟地測定大量個體，此乃今后發(fā)展的方向[2]。日前已對許多昆蟲核基因組中的核糖體DNA(rDNA)及線粒體DNA(mtDNA)進行了序列測定，并進行了相應的系統(tǒng)發(fā)育分析。1.2RFLP分析RFLP是應用限制性內(nèi)切酶切割不同類群個體的基因組DNA或某一基因，產(chǎn)生不同長度的限制性片段，根據(jù)酶切圖，計算類群之間的遺傳距離，構建系統(tǒng)樹。此方法的優(yōu)點是快速·經(jīng)濟、簡便，而A結果也比較可靠，因此特別適合大群體的遺傳、進化研究。通常用于RFLP研究的是線粒體基因組DNA(mtDNA，因為昆蟲的mtDNA較小，基因結構較清楚，用限制性內(nèi)切酶切割后可直接進行分析。而昆蟲核基因組DNA復雜，酶切后片段很多，很難確定其同源性，擊進行分子雜交后才能分析，所以用mtDNA進行RFLP分析的研究較多。目前，也有采用RFLP與PCB相結合的方法，先選用特定引物將某一片段進行PCB擴增和克隆，然后再進行RFLP分析。但RFLP分析遠不如核酸序列分析提供的信息量多，而且結果也不如后者可靠，所以，RFLP通常只用于種類鑒定或種內(nèi)種群間的遺傳進化研究，很少用于種上階元的系統(tǒng)發(fā)育分析。1.3分子雜交技術分子雜交的基本原理是具有一定同源性的兩條核酸單鏈，在一定的條件下可按堿基互補原則退火形成雙鏈，雜交過程是高度特異性的。用于雜交的雙方是待測核酸序列和探針。用帶有標記的已知核茸酸片段作為探針，來檢測目的基因或DNA片段的存在及變異情況。此方法用于昆蟲近緣種和復合種的鑒定效果較好。但此方法要求對研究類群的遺傳背景有一定的了解，而目探針的制備也較麻煩，因此，探針雜交技術應用并不廣泛，通常只用于小型醫(yī)學昆蟲的種類鑒定。1.4RAPDRAPD是在PCB基礎上，采用單個人工合成的隨機引物(一般為10bp)對基因組DNA進行擴增，所用引物G+C含量在50%一70%之間[3]。此方法的優(yōu)點是:a.快速、簡便，整個實驗能在24h以內(nèi)完成，而目只擊具備分子生物學實驗的基本條件就可進行，也尤擊昂貴的試劑及儀器設備;b.反應靈敏;c.對遺傳背景不清楚的材料也能進行。此方法的缺點是:反應過于靈敏，極易受外源DNA的污染，可貢復性低。在昆蟲中，最早由Black等將此方法應用于4種蚜蟲的鑒定比較，根據(jù)電泳圖r,能明確區(qū)別4個種[4]。同時，還檢測了種內(nèi)不同生物型、同一生物型內(nèi)不同個體，以及同一種群內(nèi)不同個體之間擴增產(chǎn)物的多態(tài)性。此外，還用RAPI)技術檢測和鑒定了蚜蟲體內(nèi)的兩種寄生蜂。Kambhampti等采用RAPI技術對蚊蟲的種和種群進行了鑒定和區(qū)分，并對RAPI的實驗技術、統(tǒng)計分析及應用等進行了探討。其后，RAPI在按蚊、寄生蜂、舞毒蛾、粉虱、蚜蟲、蝗蟲、果蠅等昆蟲中均有應用。在這些研究中，RAPI大多用于近緣種、復合種和種內(nèi)生物型的識別和鑒定，以及地理種群的遺傳進化研究。RAPI在系統(tǒng)發(fā)育分析上的應用，還有一定的爭論，例如，VanlerbergheMesutti采用RAPI的方法成功地對膜翅b紋翅卵蜂科的種類進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，但Zande將RAPD應用于果蠅種間的系統(tǒng)發(fā)育分析時，卻得出相反的結論，認為RAPD尤法得到可靠的遺傳距離先要計算出分類單元間的遺傳距離，遺傳距離的算法以Jukes的單參數(shù)法和Kimura的雙參數(shù)法較為常用。在獲取距離距陣后，按一定的規(guī)則，根據(jù)各距離值間的內(nèi)在關系構建系統(tǒng)樹。距離法構建樹的方法有多種，影響最大的是Saitou的鄰接法Sneath的不加權對群分析法(Unweightedpairgroupwithmathematicalaverage,UPGMA)。距離法適合于分析各種方法獲得的分子數(shù)據(jù)如序列測定,RFLP,RAPD等。似然法首先擊要確定一個序列進化的模型，如Kimura的雙參數(shù)模型等，然后淤找在該進化模型下最有可能產(chǎn)生所研究的DNA序列數(shù)據(jù)的系統(tǒng)樹，由于這類方法計算特別復雜費時，因此其應用不如前兩類方法普遍。在似然法中，影響最大的是最大似然法(Maximumlikelihoodmethod)。以上3類方法都是在一定的前提條件下進行的，因而有一定的運用范圍，由于作者對許多條件所知甚微，因而很難判斷在某一具體情況下哪種方法最佳。最好是同時合用多類方法構建系統(tǒng)樹，若多種方法所獲系統(tǒng)樹的拓撲結構一致，將大大提高結果的可靠性目前用于分子系統(tǒng)發(fā)育分析的主要常用軟件有:MacClade，Phylip，Mega。2研究內(nèi)容2.1種群遺傳變異及進化的研究檢測和描述種內(nèi)各種群的遺傳結構及變異狀況，探討物種的形成與分化的內(nèi)在機理。內(nèi)容包括自然地理種群及社會性昆蟲的社會種群研究。通常采用的方法有RAPD,RFLP,SSCP和DSCP，而DNA序列測定用于種群研究較少。此方面的研究有:Chapco等采用RAPI對蝗蟲種群的研究;Kambhampti等、BallingerGrabtree等采用RAPI檢測按蚊的亞種及種群變異;陳燕茹等采用RAPI分析果蠅的地理種群變異;土文等、賈振宇等用mtDNA的RFLP方法分析果蠅的自然種群;Martinez等研究mtDNA在蚜蟲地理種群內(nèi)的變異;McLain等分析按蚊地理種群中rDNANTS片段的變異;Pnterka等采用RAPDPCB分析蚜蟲種群的遺傳變異;Atkinson等采用mtDNA的DSCP方法分析社會性昆蟲種群的遺傳變異[5]。2.2種及種下階元的分類鑒定主要是對近緣種和復合種、種下亞種與生物型的識別和鑒定。此研究最為可靠的方法是分子雜交技術，在醫(yī)學昆蟲的研究中應用較多，如用DNA探針鑒定按蚊復合種。采用RAPD、RFLP及SSCP,DSCP也能進行種類鑒定，Black等采用RAPI技術成功地檢測了蚜蟲的種及種內(nèi)不同的生物型以及蚜蟲體內(nèi)的寄生蜂;VanlerbergheMesutti用mtDNA的RFLP、RAPI分子標記有效地鑒定膜翅b寄生蜂種類;Boge等采用PCBSSCP對步甲種類進行了鑒定。2.3系統(tǒng)發(fā)育分析系統(tǒng)發(fā)育分析是系統(tǒng)學研究的熱點，通過分子系統(tǒng)發(fā)育研究，對傳統(tǒng)分類有疑問的類群或形態(tài)分類不能解決的類群的系統(tǒng)發(fā)育進行分析和探討，也可對傳統(tǒng)的分類系統(tǒng)進行驗證。分子系統(tǒng)發(fā)育研究采用的數(shù)據(jù)通常是DNA序列，RFLP數(shù)據(jù)也可用于低級階元的系統(tǒng)發(fā)育分析[6]。目前已有許多類群進行了分子系統(tǒng)發(fā)育分析，從種級至目級階元都有研究。分子系統(tǒng)學研究結果與傳統(tǒng)的分類系統(tǒng)及形態(tài)支序分析的結果有的相一致，但有的卻很矛盾，如Camp-bell等Dohlen等根據(jù)18SrDNA片段序列構建的分子系統(tǒng)樹證明:同翅目并非為一個單系群，而是一個平行進化的類群。Chalwatzis等、Whiting等根據(jù)18S和28SrDNA的序列分析，證明捻翅目與雙翅目親緣關系較近，而與鞘翅目關系卻較遠，而傳統(tǒng)分類學一直認為捻翅目與鞘翅目關系較近，有的學者并把它作為鞘翅目中的一個總科。這樣，分子數(shù)據(jù)與形態(tài)數(shù)據(jù)結果不統(tǒng)一，在現(xiàn)有研究水平下很難說哪種方法得出的結論更可靠，目前較為折中的辦法是把分子性狀和形態(tài)性狀綜合起來分析2.4分子進化。分子進化的研究目的是構建基因或DNA分子的進化樹，并探索生物大分子的進化機制和特征。這類研究卞要集中在親緣關系比較明確的類群或高級階元類群之間進行，研究對象以rDNA及mtDNA為主要研究對象。3研究結論3.1rDNArDNA是編碼核糖體RNA的基因，是一類中度重復的DNA序列，以串聯(lián)多拷貝形存在于染色體DNA中，每個重復單位由非轉錄間隔區(qū)(norrtranscribedspacer,NTS)、轉錄間隔區(qū)(internaltranscribedspacer,ITS)。3種RNA(18S,5.8S,28SrRNA)基因編碼區(qū)組成rDNA3個區(qū)域的DNA進化速率各有不同，編碼區(qū)總的來說，進化速率很慢，非常保守，適合于構建生命系統(tǒng)樹的基部分支，但編碼區(qū)內(nèi)，又可分為高度保守區(qū)、保守區(qū)、可變區(qū)和高變區(qū)，這些不同的區(qū)域，適合于不同階元類群的系統(tǒng)發(fā)育研究;轉錄間隔區(qū)為中度保守，適合于推斷5-10年左右的進化事件;非轉錄間隔區(qū)則進化速度較快，適合于種間關系的研究[7]。由于rDNA是生物界普遍存在的遺傳結構，具有多拷貝性及上述種種優(yōu)點，因而在個體及群體內(nèi)有較好的均一性，少量樣品能有效代表其來源群體的rDNA的變異情況。因此，rDNA已成為生物系統(tǒng)進化研究中一個非常有用的分子標記。自Hillis最先將rDNA用于系統(tǒng)發(fā)育分析之后，rDNA在不少昆蟲類群的系統(tǒng)進化和分類研究中已得到廣泛的應用。其中，編碼18S和28SrRNA的基因片段用于系統(tǒng)發(fā)育研究較多，常用于科級以上水平的系統(tǒng)發(fā)育分析,高可變區(qū)序列也可用于屬級或種級水平的系統(tǒng)發(fā)育關系研究。編碼5.8SrRNA的基因片段由于太短，一般很少單獨使用。Wesson等首先開始蚊子的ITS片段比較研究，其后Campbell等將ITS片段用于膜翅b金小蜂科復合種的系統(tǒng)發(fā)育分析,Porter等及Paskewitz等分別將ITS片段用于雙翅目按蚊科復合種的系統(tǒng)發(fā)育分析中,Kuperus等用ITS進行蝗科蚌蛻亞科的系統(tǒng)發(fā)育關系分析[8]。3.2mtDNA 線粒體DNA(mitochondrialDNAmtDNA)為雙鏈閉環(huán)分子，昆蟲的線粒體DNA大小為15.4-16.3kb左右，其中含有編碼2個核糖體RNA(12SrRNA人16SrRNA),22個tRNA,1個細胞色素b，3個細胞色素氧化,6個NADH降解和2個ATP酶的基因[9]。由于線粒體DNA在分子進化中有許多獨特的優(yōu)越性:mtDNA的提取類似于質粒，相對于核基因的分離較為容易，基因組小，具高拷貝數(shù)目;基因組中不含間隔區(qū)和內(nèi)含子，重復序列，在遺傳過程中不發(fā)生基因重組、倒位、易位等突變;遺傳過程中遵守嚴格的母系遺傳方式，從而避免了雙親遺傳方式引起的隨機性;而目，雖然線粒體基因組的基因排列順序高度保守，結構穩(wěn)定，但mtDNA序列的取代速率卻比核DNA高5-10倍，因此，由于以上結構和進化上的特點，mtDNA已成為研究進化的貢要材料。最先用mtDNA的基因對昆蟲綱10個進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，其后不少學者采用mtDNA對昆蟲不同階元類群進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，研究范圍從種內(nèi)種群之間至高級階元之間的系統(tǒng)發(fā)育分析均有。通常用于系統(tǒng)發(fā)育分析的基因是16SrRNA，其它基因也有應用，尤其是控制區(qū)(A-T豐富區(qū))已開始受到重視。3.3其它基因利用rDNA或mtDNA基因進行系統(tǒng)學研究，擁有技術條件優(yōu)勢，并有適用于分類學大范圍使用的PCB保守引物可利用，還有前人研究的大量數(shù)據(jù)也可利用，因此，大多數(shù)分子系統(tǒng)發(fā)育研究都采用rDNA或mtDNA的基因。但兩者也有不足:mtDNA由于堿基組成的偏愛及沉默位點(silentsites)的多替代，所以mtDNA較少用于較高級階元的系統(tǒng)發(fā)育分析;而rDNA基因則排序較為困難。因此，有的學者試圖子找能更好地用于昆蟲分子系統(tǒng)學研究的新基因c編碼核蛋白的基因(Nuclearproteincodinggenes)具有易于排定、能明確確定迅速進化位點，而目在選擇適當進化速率的適合某一系統(tǒng)學問題的基因上具有靈活性，因此目前已經(jīng)有一些編碼核蛋白的基因被應用于昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育分析中[10]。Soto-Adames等用葡萄糖，6-磷酸脫氫酶基因(glucose6-phosphatedehydrogenasegene,G6pdh)研究12種昆蟲，結果表明Gbpdh基因用于屬或目級水平的系統(tǒng)發(fā)育研究是很有用的，但不能用于近緣種的系統(tǒng)發(fā)育分析。而Begum卻用Gbpdh研究果蠅的地理種群分化。Russo等用乙醇脫氫酶基因(alcoholdehydrogenasegene,Adh)研究果蠅及其相關屬的系統(tǒng)發(fā)育分析。Cho等Mitchell等用延長因子基因分析鱗翅目夜蛾類的系統(tǒng)發(fā)育。Danforth等研究蜜蜂了EF-la,認為它是一個用于昆蟲系統(tǒng)發(fā)育分析的很好的基因。Friedlander等將磷酸烯醇內(nèi)酮酸梭激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase)基因用于鱗翅b高級階元的系統(tǒng)發(fā)育分析。綜上所述，編碼核蛋白的基因用