生化實驗緒論及蛋白質沉淀變性反應講課文檔

生化實驗緒論及蛋白質沉淀變性反應第一頁，共38頁。生物化學實驗室規(guī)則（2）6、乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加熱，遠離火源操作及放置。7、所有廢液、廢棄物等，均收集在指定容器內，不得倒在水槽內或到處亂仍。強酸和強堿不能直接倒在水槽中，應先稀釋，然后倒入水槽，再用大量自來水沖洗水槽及下水道。8、室內嚴禁吸煙！煤氣、水管用完即關。Longhairshouldbetiedbacktoavoidburns.Inaddition,avoidwearingloosearticlesofclothingsuchastiesordanglingjewelrythatmaycomeintocontactwithlaboratorysurfaces.第二頁，共38頁。實驗室安全--安全用電使用電學儀器時，要注意電壓、電流是否符合儀器的要求，必要時需使用穩(wěn)壓設備。嚴格按照電器使用規(guī)程操作，不能隨意拆卸，擺弄電器。嚴防觸電。絕不可用濕手或眼睛旁視時開電閘和電器開關。檢查電器設備是否漏電時，應使用試電筆。凡是漏電儀器一律不能使用。第三頁，共38頁。實驗室安全--防止火災起火的原因：有電流短路，不安全地使用電爐、煤氣燈和易燃易爆藥物著火。實驗必須配備一定數(shù)量的消防器材，請按消防規(guī)定保管使用，最重要的是每個實驗者都應有實驗室安全觀念，時刻保持警惕。第四頁，共38頁。實驗室內嚴禁貯存大量的易燃物(如乙醚、丙酮、乙醇，苯等)。必須存放的少量即將使用的易燃物，也應將它放在遠離火源處，火焰熄滅后才可大量傾倒這些液體。低沸點的有機溶劑不準在火焰上直接加熱，只能利用帶回流冷凝管的裝置在水浴上加熱或蒸餾。實驗室安全--防止火災第五頁，共38頁。實驗室安全--防止火災東南大學蘭州理工大學第六頁，共38頁。名稱沸點/℃閃點/℃自燃點/℃乙醚34.5－40180丙酮56－17538二硫化碳46－30100苯80－11－乙醇7812400閃點：液體表面的蒸汽和空氣的混合物在遇明火或火花時著火的最低溫度。自燃點：液體蒸汽在空氣中自燃時的溫度。常見有機溶劑的易燃性不能放冰箱中儲存！不能在火源附近儲存、操作！第七頁，共38頁。易燃物蒸汽在空氣中的爆炸極限名稱爆炸極限(體積百分數(shù))乙醚1.9～36.5丙酮2.6～13乙醇3.3～19氫氣4.1～74.2甲醇6.7～36.5乙炔3～82實驗室內嚴禁貯存大量的易燃物！第八頁，共38頁。實驗室安全--嚴防中毒化學試劑有相對無毒、中度毒性和劇毒之分，在處理劇毒藥物時要特別謹慎、小心。國際上常用某些標志標示不同毒型的化學藥品。。使用毒性物質和致癌物必須根據(jù)試劑瓶上標簽說明嚴格操作，安全稱量、轉移和保管。操作戴手套，必要時戴口罩或防毒面具，并在通風櫥中進行。沾過毒性、致癌物的容器應單獨清洗、處理。第九頁，共38頁。實驗室安全--嚴防中毒水銀溫度計、氣量計等汞金屬設備破損時必須立即采取措施回收汞，并在污染處撒上一層硫磺粉以防汞蒸氣中毒，注意室內通風。第十頁，共38頁。警告標志有輻射性

安全布告生物危險品第十一頁，共38頁。高度可燃的爆炸性的危險化學藥品標志有毒的腐蝕性的刺激性有害的有氧化作用的第十二頁，共38頁。氯化鈉優(yōu)級純化學藥品的質量標簽第十三頁，共38頁。氯化鈉分析純化學藥品的質量標簽第十四頁，共38頁。氯化鈉化學純化學藥品的質量標簽第十五頁，共38頁。實驗室安全--避免燒傷和創(chuàng)傷

使用玻璃、金屬器材時注意防止割傷及機械創(chuàng)傷。如發(fā)生意外，找實驗室工作人員(少量急用藥物備用)。濃酸、濃堿腐蝕性很強，必須極為小心地操作。用吸量管量取這些試劑(包括有毒物)時，必須使用橡皮球，絕對不能用口吸取。第十六頁，共38頁。

實驗室安全--預防生物危害

微生物、動物的組織、細胞培養(yǎng)物、血液和分泌物都可能存在細菌和病毒感染的潛在危害，處理生物材料必需小心謹慎，做完實驗必須用肥皂、洗滌劑或消毒液洗手。

被污染的物品，必須進行高壓消毒或燒成灰燼。

被污染的玻璃用具應在清洗和高壓消毒前立即浸泡在適當?shù)南疽褐小５谑唔?，?8頁。實驗室急救1機械損傷：立即止血，到醫(yī)院診治。強堿：先用大量自來水沖洗，再用5%硼酸溶液或

2%乙酸溶液涂洗。強酸：大量自來水沖洗，再以5%碳酸氫鈉溶液洗滌。酚：用酒精洗滌。煤氣中毒：立即到室外，嚴重者就醫(yī)。第十八頁，共38頁。實驗室急救2玻璃割傷：檢查傷口內有無玻璃碎片，硼酸水洗凈，

涂擦碘酒或紅汞水，必要時用紗布包扎。燙傷：濃酒精消毒，涂上苦味酸軟膏。觸電：關閉電源用干木棍使電線與被害者分開。著火：汽油、乙醚等有機溶劑：石棉布、沙土電線：切斷電源或用四氯化碳滅火器衣服：勿奔走，濕衣包裹或躺地滾動。第十九頁，共38頁。實驗報告的撰寫實驗報告分為以下幾部分：原理實驗步驟結果與討論問答實驗成績的評定：實驗報告平時操作、表現(xiàn)姓名，班級，學號，課室，實驗時間、實驗教師第二十頁，共38頁。實驗內容及安排(

72學時)1、緒論、蛋白質沉淀、變性反應

9月26-272、蛋白質濃度測定—考馬斯亮藍法 10月10-113、

陽離子交換樹脂層析分離氨基酸10月17-184、血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳 10月24-255、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白

10月31-11月16、影響酶促反應速度因素—最適pH、激活劑（抑制劑）

11月7-87、脂肪酶活性的測定

11月14-158、過氧化氫酶米氏常數(shù)測定

11月21-22第二十一頁，共38頁。實驗內容及安排（續(xù)）9、糖的定量測定11月28-2910、

維生素C的定量測定

12月5-611、

脂肪酸B氧化作用12月12-1312、轉氨基作用12月19-2013、魚類DNA的提取

12月26-2714 、核酸濃度測定－UV吸收法 1月2-315 、聚合酶鏈式反應（PCR） 1月2-316 、DNA的瓊脂糖凝膠電泳

1月9-10第二十二頁，共38頁。一、實驗目的1、了解蛋白質的一些理化性質，認識蛋白質的

可逆反應和不可逆反應。2、了解蛋白質的沉淀反應、變性作用和凝固作用的原理及它們的相互關系。實驗一蛋白質沉淀、變性反應第二十三頁，共38頁。

蛋白質是由氨基酸組成的大分子化合物,其分子量頗大，介于一萬到百萬之間，是一種親水膠體。

蛋白質分子表面的親水基團（-OH,-COOH,-NH3,以及肽鍵）等，在水溶液中能與水分子起水化作用（Hydration），使蛋白質分子表面形成一個水化層。每克蛋白質分子能結合0.3-0.5克水。蛋白質分子表面上的可解離基團，在適當?shù)腜H條件下，都帶有相同的凈電荷，與其周圍的反離子構成穩(wěn)定的雙電層。二、實驗原理第二十四頁，共38頁。

由于蛋白質溶液具有水化層和雙電層兩方面的穩(wěn)定因素，所以膠體系統(tǒng)是相當穩(wěn)定的。

在一定物理化學因素(如鹽析、重金屬離子、有機酸、無機酸和加熱)影響下,蛋白質顆粒失去電荷，脫水，甚至變性，以固態(tài)形式從溶液中析出，這個過程稱為蛋白質的沉淀反應。這種反應可分為兩種類型：1、可逆沉淀反應：蛋白質分子內部結構并未發(fā)生顯著變化，基本保持原有的性質，沉淀因素除去后，能溶于原來的溶劑中。2、不可逆沉淀反應：蛋白質分子內部結構、空間構象遭到破壞，失去原來的天然性質。第二十五頁，共38頁。蛋白質溶液的沉淀

穩(wěn)定是相對的，有條件的。

如果條件發(fā)生改變，破壞了蛋白質溶液的穩(wěn)定性，蛋白質就會從溶液中沉淀出來。第二十六頁，共38頁。蛋白質分子表面水化層雙電層穩(wěn)定的親水膠脫水，失去電荷沉淀反應可逆沉淀反應（不變性沉淀反應）如：鹽析作用…不可逆沉淀反應（變性沉淀反應）如：重金屬鹽沉淀作用…第二十七頁，共38頁。蛋白質沉淀變性的常見方法

常用方法原理常用試劑實用鹽析破壞蛋白質膠體溶液的水化層和電荷層(NH4)2S04、Na2S04、Na3P04、NaCl、MgS04常用此法來分離和純化蛋白質。有機試劑鹽析脫水作用；降低水的介電常數(shù)和蛋白質溶解度；蛋白質析出乙醇、丙酮、甲醇低溫乙醇提取血液中的蛋白質組分強酸、強堿沉淀破壞蛋白質分子結構發(fā)生蛋白質變性鹽酸,硫酸,硝酸、氫氧化鈉

滅活病毒加熱變性雞蛋、肉類等加工重金屬鹽沉淀變性；生成不溶性鹽Ag+，Hg2+，Cu2+和Pb2+臨床上常用蛋清或牛乳解救誤服重金屬鹽的病人有機酸沉淀生成不溶性鹽苦味酸、鞣酸、三氯醋酸、磺基水楊酸等生物堿試劑沉淀蛋白濾液等第二十八頁，共38頁。三、實驗材料及設備蛋白質溶液：取10ml鮮雞蛋清，用蒸餾水稀釋至100ml，攪拌后用4-8層紗布過濾，新鮮配制。蛋白質氯化鈉溶液：取20ml蛋清，加蒸餾水200ml和飽和氯化鈉溶液l00ml，充分攪勻后用4-8層紗布濾去不溶物（加氯化鈉的目的是溶解球蛋白）。1.材料第二十九頁，共38頁。2.試劑3%硝酸銀，0.5%乙酸鉛，10%三氯乙酸溶液，飽和硫酸銨溶液，10%氫氧化鈉溶液，濃鹽酸，濃硫酸，濃硝酸，5%磺基水楊酸，0.1%硫酸銅，飽和硫酸銅溶液，0.1%乙酸，10%乙酸，飽和氯化鈉溶液，硫酸銨粉。3.器材水浴鍋,漏斗,濾紙,吸管,試管及試管架,量筒等。第三十頁，共38頁。四、實驗內容1.蛋白質的可逆反應——蛋白質的鹽析步驟現(xiàn)象解釋結論取一支試管，加入3mL蛋白質氯化鈉溶液和等量的飽和硫酸銨溶液，混勻，靜置10分鐘觀察有無蛋白質（球蛋白）的沉淀過濾后，向濾液中加入硫酸銨粉末，邊加邊用玻璃棒攪拌，直至粉末不再溶解，直至飽和觀察有無沉淀（清蛋白）析出靜置，棄去上清液，取出部分清蛋白，加少量蒸餾水觀察沉淀的再溶解第三十一頁，共38頁。操作現(xiàn)象操作現(xiàn)象Tube1①1mL蛋白質溶液②3-4滴3%硝酸銀溶液③過量的硝酸銀Tube2①1mL蛋白質溶液②1-3滴0.5%乙酸鉛③過量的乙酸鉛Tube3①1mL蛋白質溶液②3-4滴0.1%硫酸銅③過量的硫酸銅2.蛋白質的不可逆反應2.1.重金屬離子沉淀蛋白質（3支試管）第三十二頁，共38頁。操作現(xiàn)象Tube1①0.5mL蛋白質溶液②數(shù)滴10%三氯乙酸溶液

Tube2①0.5mL蛋白質溶液②數(shù)滴5%磺基水楊酸2.蛋白質的不可逆反應2.2有機酸沉淀蛋白質（2支試管）第三十三頁，共38頁。操作現(xiàn)象操作現(xiàn)象Tube115滴濃鹽酸

②沿管壁加入6滴蛋白質溶液，

勿搖③振蕩Tube2①15滴濃硫酸沿管壁加入6滴蛋白質溶液，勿搖

③振蕩Tube3①15滴濃硝酸②沿管壁加入6滴蛋白質溶液，

勿搖③振蕩2.蛋白質的不可逆反應2.3無機酸沉淀蛋白質（3支試管）第三十四頁，共38頁。2.蛋白質的不可逆反應2.4加熱沉淀蛋白質

試劑管號

蛋白質溶液0.1%乙酸1