生化實(shí)驗(yàn)緒論及蛋白質(zhì)沉淀變性反應(yīng)講課文檔

生化實(shí)驗(yàn)緒論及蛋白質(zhì)沉淀變性反應(yīng)第一頁，共38頁。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則（2）6、乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加熱，遠(yuǎn)離火源操作及放置。7、所有廢液、廢棄物等，均收集在指定容器內(nèi)，不得倒在水槽內(nèi)或到處亂仍。強(qiáng)酸和強(qiáng)堿不能直接倒在水槽中，應(yīng)先稀釋，然后倒入水槽，再用大量自來水沖洗水槽及下水道。8、室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙！煤氣、水管用完即關(guān)。Longhairshouldbetiedbacktoavoidburns.Inaddition,avoidwearingloosearticlesofclothingsuchastiesordanglingjewelrythatmaycomeintocontactwithlaboratorysurfaces.第二頁，共38頁。實(shí)驗(yàn)室安全--安全用電使用電學(xué)儀器時(shí)，要注意電壓、電流是否符合儀器的要求，必要時(shí)需使用穩(wěn)壓設(shè)備。嚴(yán)格按照電器使用規(guī)程操作，不能隨意拆卸，擺弄電器。嚴(yán)防觸電。絕不可用濕手或眼睛旁視時(shí)開電閘和電器開關(guān)。檢查電器設(shè)備是否漏電時(shí)，應(yīng)使用試電筆。凡是漏電儀器一律不能使用。第三頁，共38頁。實(shí)驗(yàn)室安全--防止火災(zāi)起火的原因：有電流短路，不安全地使用電爐、煤氣燈和易燃易爆藥物著火。實(shí)驗(yàn)必須配備一定數(shù)量的消防器材，請(qǐng)按消防規(guī)定保管使用，最重要的是每個(gè)實(shí)驗(yàn)者都應(yīng)有實(shí)驗(yàn)室安全觀念，時(shí)刻保持警惕。第四頁，共38頁。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)禁貯存大量的易燃物(如乙醚、丙酮、乙醇，苯等)。必須存放的少量即將使用的易燃物，也應(yīng)將它放在遠(yuǎn)離火源處，火焰熄滅后才可大量傾倒這些液體。低沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑不準(zhǔn)在火焰上直接加熱，只能利用帶回流冷凝管的裝置在水浴上加熱或蒸餾。實(shí)驗(yàn)室安全--防止火災(zāi)第五頁，共38頁。實(shí)驗(yàn)室安全--防止火災(zāi)東南大學(xué)蘭州理工大學(xué)第六頁，共38頁。名稱沸點(diǎn)/℃閃點(diǎn)/℃自燃點(diǎn)/℃乙醚34.5－40180丙酮56－17538二硫化碳46－30100苯80－11－乙醇7812400閃點(diǎn)：液體表面的蒸汽和空氣的混合物在遇明火或火花時(shí)著火的最低溫度。自燃點(diǎn)：液體蒸汽在空氣中自燃時(shí)的溫度。常見有機(jī)溶劑的易燃性不能放冰箱中儲(chǔ)存！不能在火源附近儲(chǔ)存、操作！第七頁，共38頁。易燃物蒸汽在空氣中的爆炸極限名稱爆炸極限(體積百分?jǐn)?shù))乙醚1.9～36.5丙酮2.6～13乙醇3.3～19氫氣4.1～74.2甲醇6.7～36.5乙炔3～82實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)禁貯存大量的易燃物！第八頁，共38頁。實(shí)驗(yàn)室安全--嚴(yán)防中毒化學(xué)試劑有相對(duì)無毒、中度毒性和劇毒之分，在處理劇毒藥物時(shí)要特別謹(jǐn)慎、小心。國際上常用某些標(biāo)志標(biāo)示不同毒型的化學(xué)藥品。。使用毒性物質(zhì)和致癌物必須根據(jù)試劑瓶上標(biāo)簽說明嚴(yán)格操作，安全稱量、轉(zhuǎn)移和保管。操作戴手套，必要時(shí)戴口罩或防毒面具，并在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。沾過毒性、致癌物的容器應(yīng)單獨(dú)清洗、處理。第九頁，共38頁。實(shí)驗(yàn)室安全--嚴(yán)防中毒水銀溫度計(jì)、氣量計(jì)等汞金屬設(shè)備破損時(shí)必須立即采取措施回收汞，并在污染處撒上一層硫磺粉以防汞蒸氣中毒，注意室內(nèi)通風(fēng)。第十頁，共38頁。警告標(biāo)志有輻射性

安全布告生物危險(xiǎn)品第十一頁，共38頁。高度可燃的爆炸性的危險(xiǎn)化學(xué)藥品標(biāo)志有毒的腐蝕性的刺激性有害的有氧化作用的第十二頁，共38頁。氯化鈉優(yōu)級(jí)純化學(xué)藥品的質(zhì)量標(biāo)簽第十三頁，共38頁。氯化鈉分析純化學(xué)藥品的質(zhì)量標(biāo)簽第十四頁，共38頁。氯化鈉化學(xué)純化學(xué)藥品的質(zhì)量標(biāo)簽第十五頁，共38頁。實(shí)驗(yàn)室安全--避免燒傷和創(chuàng)傷

使用玻璃、金屬器材時(shí)注意防止割傷及機(jī)械創(chuàng)傷。如發(fā)生意外，找實(shí)驗(yàn)室工作人員(少量急用藥物備用)。濃酸、濃堿腐蝕性很強(qiáng)，必須極為小心地操作。用吸量管量取這些試劑(包括有毒物)時(shí)，必須使用橡皮球，絕對(duì)不能用口吸取。第十六頁，共38頁。

實(shí)驗(yàn)室安全--預(yù)防生物危害

微生物、動(dòng)物的組織、細(xì)胞培養(yǎng)物、血液和分泌物都可能存在細(xì)菌和病毒感染的潛在危害，處理生物材料必需小心謹(jǐn)慎，做完實(shí)驗(yàn)必須用肥皂、洗滌劑或消毒液洗手。

被污染的物品，必須進(jìn)行高壓消毒或燒成灰燼。

被污染的玻璃用具應(yīng)在清洗和高壓消毒前立即浸泡在適當(dāng)?shù)南疽褐?。第十七頁，?8頁。實(shí)驗(yàn)室急救1機(jī)械損傷：立即止血，到醫(yī)院診治。強(qiáng)堿：先用大量自來水沖洗，再用5%硼酸溶液或

2%乙酸溶液涂洗。強(qiáng)酸：大量自來水沖洗，再以5%碳酸氫鈉溶液洗滌。酚：用酒精洗滌。煤氣中毒：立即到室外，嚴(yán)重者就醫(yī)。第十八頁，共38頁。實(shí)驗(yàn)室急救2玻璃割傷：檢查傷口內(nèi)有無玻璃碎片，硼酸水洗凈，

涂擦碘酒或紅汞水，必要時(shí)用紗布包扎。燙傷：濃酒精消毒，涂上苦味酸軟膏。觸電：關(guān)閉電源用干木棍使電線與被害者分開。著火：汽油、乙醚等有機(jī)溶劑：石棉布、沙土電線：切斷電源或用四氯化碳滅火器衣服：勿奔走，濕衣包裹或躺地滾動(dòng)。第十九頁，共38頁。實(shí)驗(yàn)報(bào)告的撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告分為以下幾部分：原理實(shí)驗(yàn)步驟結(jié)果與討論問答實(shí)驗(yàn)成績的評(píng)定：實(shí)驗(yàn)報(bào)告平時(shí)操作、表現(xiàn)姓名，班級(jí)，學(xué)號(hào)，課室，實(shí)驗(yàn)時(shí)間、實(shí)驗(yàn)教師第二十頁，共38頁。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及安排(

72學(xué)時(shí))1、緒論、蛋白質(zhì)沉淀、變性反應(yīng)

9月26-272、蛋白質(zhì)濃度測(cè)定—考馬斯亮藍(lán)法 10月10-113、

陽離子交換樹脂層析分離氨基酸10月17-184、血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳 10月24-255、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白

10月31-11月16、影響酶促反應(yīng)速度因素—最適pH、激活劑（抑制劑）

11月7-87、脂肪酶活性的測(cè)定

11月14-158、過氧化氫酶米氏常數(shù)測(cè)定

11月21-22第二十一頁，共38頁。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及安排（續(xù)）9、糖的定量測(cè)定11月28-2910、

維生素C的定量測(cè)定

12月5-611、

脂肪酸B氧化作用12月12-1312、轉(zhuǎn)氨基作用12月19-2013、魚類DNA的提取

12月26-2714 、核酸濃度測(cè)定－UV吸收法 1月2-315 、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 1月2-316 、DNA的瓊脂糖凝膠電泳

1月9-10第二十二頁，共38頁。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解蛋白質(zhì)的一些理化性質(zhì)，認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)的

可逆反應(yīng)和不可逆反應(yīng)。2、了解蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)、變性作用和凝固作用的原理及它們的相互關(guān)系。實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)沉淀、變性反應(yīng)第二十三頁，共38頁。

蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的大分子化合物,其分子量頗大，介于一萬到百萬之間，是一種親水膠體。

蛋白質(zhì)分子表面的親水基團(tuán)（-OH,-COOH,-NH3,以及肽鍵）等，在水溶液中能與水分子起水化作用（Hydration），使蛋白質(zhì)分子表面形成一個(gè)水化層。每克蛋白質(zhì)分子能結(jié)合0.3-0.5克水。蛋白質(zhì)分子表面上的可解離基團(tuán)，在適當(dāng)?shù)腜H條件下，都帶有相同的凈電荷，與其周圍的反離子構(gòu)成穩(wěn)定的雙電層。二、實(shí)驗(yàn)原理第二十四頁，共38頁。

由于蛋白質(zhì)溶液具有水化層和雙電層兩方面的穩(wěn)定因素，所以膠體系統(tǒng)是相當(dāng)穩(wěn)定的。

在一定物理化學(xué)因素(如鹽析、重金屬離子、有機(jī)酸、無機(jī)酸和加熱)影響下,蛋白質(zhì)顆粒失去電荷，脫水，甚至變性，以固態(tài)形式從溶液中析出，這個(gè)過程稱為蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)。這種反應(yīng)可分為兩種類型：1、可逆沉淀反應(yīng)：蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)并未發(fā)生顯著變化，基本保持原有的性質(zhì)，沉淀因素除去后，能溶于原來的溶劑中。2、不可逆沉淀反應(yīng)：蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)象遭到破壞，失去原來的天然性質(zhì)。第二十五頁，共38頁。蛋白質(zhì)溶液的沉淀

穩(wěn)定是相對(duì)的，有條件的。

如果條件發(fā)生改變，破壞了蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)就會(huì)從溶液中沉淀出來。第二十六頁，共38頁。蛋白質(zhì)分子表面水化層雙電層穩(wěn)定的親水膠脫水，失去電荷沉淀反應(yīng)可逆沉淀反應(yīng)（不變性沉淀反應(yīng)）如：鹽析作用…不可逆沉淀反應(yīng)（變性沉淀反應(yīng)）如：重金屬鹽沉淀作用…第二十七頁，共38頁。蛋白質(zhì)沉淀變性的常見方法

常用方法原理常用試劑實(shí)用鹽析破壞蛋白質(zhì)膠體溶液的水化層和電荷層(NH4)2S04、Na2S04、Na3P04、NaCl、MgS04常用此法來分離和純化蛋白質(zhì)。有機(jī)試劑鹽析脫水作用；降低水的介電常數(shù)和蛋白質(zhì)溶解度；蛋白質(zhì)析出乙醇、丙酮、甲醇低溫乙醇提取血液中的蛋白質(zhì)組分強(qiáng)酸、強(qiáng)堿沉淀破壞蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生蛋白質(zhì)變性鹽酸,硫酸,硝酸、氫氧化鈉

滅活病毒加熱變性雞蛋、肉類等加工重金屬鹽沉淀變性；生成不溶性鹽Ag+，Hg2+，Cu2+和Pb2+臨床上常用蛋清或牛乳解救誤服重金屬鹽的病人有機(jī)酸沉淀生成不溶性鹽苦味酸、鞣酸、三氯醋酸、磺基水楊酸等生物堿試劑沉淀蛋白濾液等第二十八頁，共38頁。三、實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備蛋白質(zhì)溶液：取10ml鮮雞蛋清，用蒸餾水稀釋至100ml，攪拌后用4-8層紗布過濾，新鮮配制。蛋白質(zhì)氯化鈉溶液：取20ml蛋清，加蒸餾水200ml和飽和氯化鈉溶液l00ml，充分?jǐn)噭蚝笥?-8層紗布濾去不溶物（加氯化鈉的目的是溶解球蛋白）。1.材料第二十九頁，共38頁。2.試劑3%硝酸銀，0.5%乙酸鉛，10%三氯乙酸溶液，飽和硫酸銨溶液，10%氫氧化鈉溶液，濃鹽酸，濃硫酸，濃硝酸，5%磺基水楊酸，0.1%硫酸銅，飽和硫酸銅溶液，0.1%乙酸，10%乙酸，飽和氯化鈉溶液，硫酸銨粉。3.器材水浴鍋,漏斗,濾紙,吸管,試管及試管架,量筒等。第三十頁，共38頁。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.蛋白質(zhì)的可逆反應(yīng)——蛋白質(zhì)的鹽析步驟現(xiàn)象解釋結(jié)論取一支試管，加入3mL蛋白質(zhì)氯化鈉溶液和等量的飽和硫酸銨溶液，混勻，靜置10分鐘觀察有無蛋白質(zhì)（球蛋白）的沉淀過濾后，向?yàn)V液中加入硫酸銨粉末，邊加邊用玻璃棒攪拌，直至粉末不再溶解，直至飽和觀察有無沉淀（清蛋白）析出靜置，棄去上清液，取出部分清蛋白，加少量蒸餾水觀察沉淀的再溶解第三十一頁，共38頁。操作現(xiàn)象操作現(xiàn)象Tube1①1mL蛋白質(zhì)溶液②3-4滴3%硝酸銀溶液③過量的硝酸銀Tube2①1mL蛋白質(zhì)溶液②1-3滴0.5%乙酸鉛③過量的乙酸鉛Tube3①1mL蛋白質(zhì)溶液②3-4滴0.1%硫酸銅③過量的硫酸銅2.蛋白質(zhì)的不可逆反應(yīng)2.1.重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)（3支試管）第三十二頁，共38頁。操作現(xiàn)象Tube1①0.5mL蛋白質(zhì)溶液②數(shù)滴10%三氯乙酸溶液

Tube2①0.5mL蛋白質(zhì)溶液②數(shù)滴5%磺基水楊酸2.蛋白質(zhì)的不可逆反應(yīng)2.2有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)（2支試管）第三十三頁，共38頁。操作現(xiàn)象操作現(xiàn)象Tube115滴濃鹽酸

②沿管壁加入6滴蛋白質(zhì)溶液，

勿搖③振蕩Tube2①15滴濃硫酸沿管壁加入6滴蛋白質(zhì)溶液，勿搖

③振蕩Tube3①15滴濃硝酸②沿管壁加入6滴蛋白質(zhì)溶液，

勿搖③振蕩2.蛋白質(zhì)的不可逆反應(yīng)2.3無機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)（3支試管）第三十四頁，共38頁。2.蛋白質(zhì)的不可逆反應(yīng)2.4加熱沉淀蛋白質(zhì)

試劑管號(hào)

蛋白質(zhì)溶液0.1%乙酸1