高效液相色譜技術(shù)

7.1基本原理

加樣流動相流動相

固定相

流動相A

C

BB

CA

固定相——柱內(nèi)填料，流動相——洗脫劑。

HPLC是利用樣品中的溶質(zhì)在固定相和流動相之間分配系數(shù)的不同，進(jìn)行連續(xù)的無數(shù)次的交換和分配而達(dá)到分離的過程。第1頁/共20頁按溶質(zhì)（樣品）在兩相分離過程的物理化學(xué)性質(zhì)可以作如下的分類：分配色譜：——分配系數(shù)親和色譜：——親和力吸附色譜：——吸附力離子交換色譜：——離子交換能力凝膠色譜（體積排阻色譜）：——分子大小而引起的體積排阻第2頁/共20頁分配色譜又可分為：

正相色譜：固定相為極性，流動相為非極性。

反相色譜：固定相為非極性，流動相為極性。用的最多，約占60～70％。固定相（柱填料）：

固定相又分為兩類：①一類是使用最多的微粒硅膠；②另一類是使用較少的高分子微球：

優(yōu)點(diǎn)是強(qiáng)度大、化學(xué)惰性、使用pH范圍大(pH=1～14)；

缺點(diǎn)是柱效較小，常用于離子交換色譜和凝膠色譜。第3頁/共20頁最常使用的全孔微粒硅膠（3～10μm）是化學(xué)鍵合相硅膠，這種固定相要占所有柱填料的80％。它是通過化學(xué)反應(yīng)把某種適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)官能團(tuán)（例如各種有機(jī)硅烷），鍵合到硅膠表面上，取代了羥基（－OH）而成。它是近代高效液相色譜技術(shù)中最重要的柱填料類型。使用微粒硅膠要特別注意它的使用pH范圍是2～7.5，若過堿（＞pH8），硅膠會粉碎或溶解；若過酸（＜pH1），鍵合相的化學(xué)鍵會斷裂。有些特殊的健合相可以用于pH9～11。

鍵合相使用硅膠作基質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是：①硅膠的強(qiáng)度大；②微粒硅膠的了孔結(jié)構(gòu)和表面積易人為控制；③化學(xué)穩(wěn)定性好。第4頁/共20頁

硅膠(SiO2?nH2O)：OHOH—Si—O—Si—

｜｜重要的鍵合相是：硅烷化鍵合相，它是硅膠與有機(jī)硅烷反應(yīng)的產(chǎn)物。最常用的鍵合相鍵型是：｜｜—Si—O—Si—C｜｜｜R1

｜R1—Si—OH+

X—Si—R—Si—O—Si—R

+HX｜R2

｜R2

硅膠有機(jī)硅烷鍵合相

X━Cl，CH3O，C2H5O等。

R━烷：C8H17（即C8填料），C10H21，C18H37等。

R1、R2

━X、CH3等。第5頁/共20頁最常用的“萬能柱”填料為“C18”，簡稱“ODS”柱，即十八烷基硅烷鍵合硅膠填料（Octadecylsilyl，簡稱ODS）。這種填料在反相色譜中發(fā)揮著極為重要的作用，它可完成高效液相色譜70～80％的分析任務(wù)。由于C18(ODS)是長鏈烷基鍵合相，有較高的碳含量和更好的疏水性，對各種類型的生物大分子有更強(qiáng)的適應(yīng)能力，因此在生物化學(xué)分析工作中應(yīng)用的最為廣泛，近年來，為適應(yīng)氨基酸、小肽等生物分子的分析任務(wù)，又發(fā)展了CH、C3、C4等短鏈烷基鍵合相和大孔硅膠（20～40μm）。按鍵合到基質(zhì)上的官能團(tuán)可分為：⑴反相柱：填料為非極性，官能團(tuán)為烷烴，例如：C18(ODS)、C8、C4等。⑵正相柱：填料為極性，官能團(tuán)為－CN氰基、－NH2氨基等。⑶離子交換鍵合相：陽離子官能團(tuán)：－SO3H磺酸基、－COOH羧基等。陰離子官能團(tuán)：―R4N＋季銨基、-氨基等。(由于硅膠基質(zhì)的鍵合相只能在pH＝2～7.5的范圍內(nèi)使用，而離子交換色譜要求有更寬的pH范圍，因此其基質(zhì)現(xiàn)在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯。)第6頁/共20頁流動相：1.反相色譜最常用的流動相及其沖洗強(qiáng)度如下：H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜異丙醇＜四氫呋喃最常用的流動相組成是：“甲醇—H2O”和“乙腈—H2O”，由于乙腈的劇毒性，通常優(yōu)先考慮“甲醇—H2O”流動相。2.正相色譜常用的流動相及其沖洗強(qiáng)度的順序是：

正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜異丙醇最常用的是正已烷，雖然其價(jià)格較貴，但80％的順、反和鄰位、對位異構(gòu)體仍然要用正相色譜來進(jìn)行分離。第7頁/共20頁反相色譜中，溶質(zhì)按其疏水性大小進(jìn)行分離，極性越大疏水性越小的溶質(zhì)，越不易與非極性的固定相結(jié)合，所以先被洗脫下來。流動相的pH對樣品溶質(zhì)的電離狀態(tài)影響很大，進(jìn)而影響其疏水性，所以在分離肽類和蛋白質(zhì)等生物大分子的過程中，經(jīng)常要加入修飾性的離子對物質(zhì)，最常用的離子對試劑是三氟乙酸（TFA），使用濃度為0.1％，使流動相的pH值為2～3，這樣可以有效地抑制氨基酸上α羧基的離介，使其疏水性增加，延長洗脫時(shí)間，提高分辨率和分離效果。完全離子化的溶質(zhì)，例如強(qiáng)酸或強(qiáng)堿，其在反相鍵合相上的保留值很低，近于死時(shí)間流出，不能進(jìn)行分析。根據(jù)離子對色譜的原理將一種與樣品離子電荷（A＋）相反的離子（B－），稱為對離子，加入到流動相中，使其與樣品離子結(jié)合生成弱極性的離子對，即中性締合物，從而增強(qiáng)了樣品的疏水性，加大了保留值，改善了分離效果。第8頁/共20頁流動相的選擇原則是：①樣品易溶，且溶解度盡可能大。②化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不損壞柱子。③不妨礙檢測器檢測，紫外波長處無吸收。④粘度低，流動性好。⑤易于從其中回收樣品。⑥無毒或低毒，易于操作。⑦易于制成高純度，即色譜純。⑧廢液易處理，不污染環(huán)境。第9頁/共20頁7.2基本參數(shù)1.

保留值

進(jìn)樣

t0

tR

⑴保留時(shí)間“tR”：進(jìn)樣至出峰的時(shí)間。⑵死時(shí)間“t0”：不被柱子吸附的惰性物質(zhì)的出峰時(shí)間。死時(shí)間“t0”的測定通常是使用不被柱子保留而又有紫外吸收的惰性物質(zhì)，例如：正相色譜常用四氯化碳，反相色譜常用甲醇、尿嘧啶、NaNO3等。第10頁/共20頁⑶容量因子“k’”：

或：“k’”是比“tR”還常用的保留值，它與柱子的大小及流速無關(guān)，只與溶質(zhì)在固定相和流動相的分配性質(zhì)、柱溫以及相空間比（即固定相和流動相之體企積比）有關(guān)?！発’”又定義為在分配平衡時(shí)某溶質(zhì)在兩相中絕對量之比，消除了保留值的波動因素，而平衡常數(shù)“K”是平衡時(shí)物質(zhì)在兩相中的濃度比。

k’值的范圍：0.4＜k’＜20～30k’＝2～5為佳，過大則耗時(shí)太長。第11頁/共20頁⑷保留體積：VR＝tR?FC(FC---流動相的流速mL/min)

VR是在

tR時(shí)間內(nèi)流動相流過柱子的體積。調(diào)整保留時(shí)間：tR’＝tR－t0

調(diào)整保留體積：VR’＝VR－VR0＝tR’?FC⑸選擇性指標(biāo)“α’”和相對保留值“α”

α’

可以更直觀和方便地反映色譜峰分離的好壞：進(jìn)樣tR(1)tR(2)

相對保留值α(分離因子)：(α＞1.1為好)第12頁/共20頁2.

柱效率：定義：理論塔板數(shù)：(每米柱)

?—標(biāo)準(zhǔn)偏差，曲線拐點(diǎn)處峰寬的1/2h2?

一半，即峰高0.607處峰寬的一半。

W1/2為便于測量，改用半峰寬：1/2h

W1/2(或2×△t1/2)

Wb最常用的計(jì)算式：另一計(jì)算式：(Wb不如W1/2容易測量，因而此式用的較少。)第13頁/共20頁理論塔板高度：(L—

柱長)經(jīng)驗(yàn)式：

H＝2dP(dP＝10μH＝20μN(yùn)＝5萬)(dP＝5μH＝10μN(yùn)＝10萬)

dP—柱填料的顆粒直徑

柱效的測定和計(jì)算：以反相柱為例，流動相用87％(V/V)的甲醇:水，樣品用苯、聯(lián)苯、萘等，加快記錄儀的走紙速度，測出半峰寬W1/2，并由走紙速度換算為與tR相同的單位“分”或“秒”，代入公式，計(jì)算出柱效N。提高柱效的方法：①固定相填料要均一，顆粒細(xì)，裝填均勻。②流動相粘度低。③低流速。④升高柱溫。第14頁/共20頁3.

不對稱因子“Tf”：

用于形容色譜峰拖尾和前伸的程度，多數(shù)為拖尾峰。

h進(jìn)樣進(jìn)樣

A

B

0.1h

拖尾

前伸(A、B如上圖所示)通常Tf＝1.2～1.3，若Tf＞2則峰不合格。峰拖尾的原因是硅膠基質(zhì)上的Si－OH羥基未被全部鍵合而與溶質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。改進(jìn)拖尾要用封尾技術(shù)：即用小分子的含甲基的物質(zhì)再次對硅膠進(jìn)行鍵合，封閉硅羥基；還可在流動相中加入帶–NH2氨基(對羥基敏感)的物質(zhì)，將殘余的羥基掩閉。第15頁/共20頁分辨率：

tR(1)tR(2)

進(jìn)樣W1/2(1)W1/2(2)

tW1tW24.分離度K1和K3

HPLC的目的和要求是：峰要盡可能窄（W1/2?。彘g距大（tR相差大）。

⑴基線分離度K1

：(基線分離時(shí)用K1。)

H

h

⑵峰高分離度：

(K3＝1基線分離，K3更反映了實(shí)際分離度。)

第16頁/共20頁5.

線速度：溶劑在柱中移動的速度。

mm/sec(L─柱長t0─死時(shí)間)

H(μm)

粗粒如右圖所示，用實(shí)驗(yàn)可找到最佳的線速度：細(xì)粒即圖中的A點(diǎn)：u＝1mm/sec

此處不用流量而用線速度，是因?yàn)榱髁颗c柱徑有關(guān)，而線速度與柱徑無關(guān)。請記住不同柱內(nèi)徑的最佳流量：ABu(1mm/sec)

柱內(nèi)徑流量線速度5mm1.0mL/min1mm/sec(B奌：u＝2mm/sec)2mm0.2mL/min1mm/sec1mm50μL/min1mm/sec由“1mm/sec”最佳線速度可計(jì)算出適合各種柱徑的最佳流量。由上表可以看出，用5mm柱，一天要用一并昂貴的乙腈，若用1mm柱，則一個(gè)月才用一并。第17頁/共20頁5.

保留值方程：

正相色譜：lnk’＝a＋blnCb＋cCb反相色譜：lnk’＝a＋cCb

離子交換色譜：lnk’＝a＋blnCb

(Cb─強(qiáng)沖洗劑濃度)

(對于不同溶質(zhì)a、b、c系數(shù)不同)(反相色譜是線性方程)正相色譜：反相色譜：

lnk’lnk’

CbCb

第18頁/共20頁lnk’lnk’