《缺血性腦卒中動物模型評價技術(shù)規(guī)范 第1部分：嚙齒類動物》（征求意見稿）

1T/GDPMAAXXXX—2024缺血性腦卒中動物模型評價技術(shù)規(guī)范第1部分：嚙齒類動物本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了實(shí)驗(yàn)小鼠、大鼠缺血性腦卒中模型制備的動物質(zhì)量、飼養(yǎng)要求、制備方法、評價方法和結(jié)果判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于嚙齒類動物缺血性腦卒中模型構(gòu)建及應(yīng)用評價。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB14922實(shí)驗(yàn)動物微生物、寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測GB/T14924.2實(shí)驗(yàn)動物配合飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB14924.3實(shí)驗(yàn)動物配合飼料營養(yǎng)成分GB14925實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境及設(shè)施3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1缺血性腦卒中cerebralischemicstroke是指各種原因?qū)е碌哪X組織血液供應(yīng)障礙，并由此產(chǎn)生的缺血缺氧性壞死，進(jìn)而出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙的一類臨床綜合征。3.2神經(jīng)功能評價量表neurologicalfunctionassessmentscale用于評估動物模型神經(jīng)功能缺損程度和恢復(fù)情況的工具，評價內(nèi)容包括意識水平、感覺系統(tǒng)、運(yùn)動系統(tǒng)和骨骼肌協(xié)調(diào)等。3.3動物行為評價annimalbehavioralassessment以實(shí)驗(yàn)動物為對象，在自然界或?qū)嶒?yàn)室內(nèi)，以觀察和實(shí)驗(yàn)方式對動物的行為信息進(jìn)行采集、分析和處理，評價動物行為信息的生理和病理意義。3.4運(yùn)動能力評價motorfunctionassessment利用不同動物運(yùn)動評價設(shè)備，如步態(tài)分析系統(tǒng)等，觀察動物在不同情境下的運(yùn)動行為變化，用于測試和評價動物的運(yùn)動能力。4動物質(zhì)量及飼養(yǎng)要求4.1動物質(zhì)量應(yīng)符合GB14922的要求。4.2飼養(yǎng)環(huán)境應(yīng)符合GB14925的要求。4.3飼料應(yīng)符合GB/T14924.2和GB14924.3的要求。5模型制備方法2T/GDPMAAXXXX—2024實(shí)驗(yàn)嚙齒類動物缺血性腦卒中模型制備方法包括栓塞法、光化學(xué)法和電凝法等。5.1栓塞法實(shí)驗(yàn)小鼠/大鼠缺血性卒中模型構(gòu)建的經(jīng)典方法，通過頸外動脈插入線栓或血栓等，導(dǎo)致大腦中動脈阻塞和再灌注。具體操作如下：1)術(shù)前準(zhǔn)備。選擇小鼠（體重控制在25-30g）、大鼠（體重控制在250至300g術(shù)前動物禁食12小時，自由飲水。進(jìn)行麻醉、備皮、消毒等準(zhǔn)備工作。2)麻醉。通常采用吸入類麻醉劑進(jìn)行麻醉，手術(shù)過程中保溫。3)手術(shù)。從頸部正中切開皮膚，利用鑷子鈍性分離頸部腺體組織、筋膜，暴露并分離頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA）。使用血管夾夾閉CCA和ICA分叉的近心端，結(jié)扎ECA遠(yuǎn)心端和近心端（留長線頭），并從兩個結(jié)扎點(diǎn)中間剪斷ECA。然后在ECA近分叉處用眼科剪45°剪一小斜口并插入線栓，松開ICA動脈夾，緩慢向ICA推入線栓，當(dāng)線栓遇到輕微阻力時即可停止，線栓插入深度一般根據(jù)小鼠和大鼠體重和實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整，小鼠常見深度為9-10mm（25-30g大鼠常見深度為18-22mm（250-300g）。插入過程中避免用力過猛導(dǎo)致血管破裂或線栓彎曲，同時防止線栓誤入翼腭動脈（PPA）。當(dāng)線栓到達(dá)位置后松開CCA結(jié)扎，縫合皮膚。阻斷血流造成腦局部缺血60分鐘后，拔出線栓實(shí)現(xiàn)再灌注。術(shù)后，注意保持傷口清潔干燥，防止感染。4)術(shù)后護(hù)理。術(shù)后將動物放置于加熱墊上保暖，直至完全復(fù)蘇。注意觀察小鼠的生命體征變化，如呼吸、心率等。5.2光化學(xué)法實(shí)驗(yàn)小鼠/大鼠皮層缺血性腦卒中模型構(gòu)建的常用方法，實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)簡單。利用光敏劑（如玫瑰紅）在特定強(qiáng)度光照下發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，在大腦的照射局部產(chǎn)生腦水腫和血小板微血栓，形成局灶性腦梗死。具體操作如下：1)術(shù)前準(zhǔn)備。術(shù)前動物禁食12小時，自由飲水。進(jìn)行麻醉、備皮、消毒等準(zhǔn)備工作。2)麻醉。通常采用注射類麻醉劑進(jìn)行麻醉，手術(shù)過程中保溫。3)手術(shù)。將小鼠/大鼠頭部固定于腦立體定位儀上，在前囟旁劃定圓形區(qū)域，該區(qū)域以外進(jìn)行避光處理。從動物眼底注射玫瑰紅溶液，開啟激光發(fā)射器（532nm），對圓形區(qū)域進(jìn)行激光照射8分鐘，形成局部永久缺血，縫合頭皮。4)術(shù)后護(hù)理。術(shù)后將動物放置于加熱墊上保暖，直至完全復(fù)蘇。5.3電凝法實(shí)驗(yàn)小鼠和大鼠缺血性腦卒中永久閉塞模型構(gòu)建方法。利用開顱手術(shù)暴露嚙齒類動物腦中動脈并進(jìn)行永久性阻斷。具體方法如下：1)術(shù)前準(zhǔn)備。術(shù)前動物禁食12小時，自由飲水。進(jìn)行麻醉、備皮、消毒等準(zhǔn)備工作。2)麻醉。通常采用吸入類麻醉劑進(jìn)行麻醉，手術(shù)過程中保溫。3)手術(shù)。在無菌條件下進(jìn)行手術(shù)操作，切開小鼠/大鼠頭部皮膚，暴露顱骨。使用微型電凝器，將電凝探頭置于小鼠/大鼠大腦中動脈的適當(dāng)位置，使大腦中動脈永久性阻斷。注意控制電凝時間和強(qiáng)度，避免損傷周圍組織。4)術(shù)后護(hù)理。術(shù)后將動物放置于加熱墊上保暖，直至完全復(fù)蘇。注意觀察小鼠的生命體征變化，如呼吸、心率等。6評價方法6.1腦血流檢測采用激光散斑血流儀檢測動物腦缺血情況。動物麻醉后俯臥，頭部備皮消毒后，切開皮膚，暴露顱骨，在激光散斑成像儀下，觀察腦血流圖像，選定損傷側(cè)缺血區(qū)域，測定10s內(nèi)平均血流值，同時，選定非損傷側(cè)相同區(qū)域測定血流值，評價大腦中動脈阻斷后的缺血情況。6.2神經(jīng)損害嚴(yán)重程度評分3T/GDPMAAXXXX—2024造模前先按照附錄A對動物進(jìn)行神經(jīng)功能評分，排除不滿足評分要求的動物。造模后2小時，動物完全清醒后，在安靜環(huán)境中，進(jìn)行神經(jīng)神經(jīng)損害嚴(yán)重程度評價。逐項(xiàng)評分，所有單項(xiàng)分?jǐn)?shù)相加則為動物神經(jīng)損害程度評分，總分為18分。一般選擇3名觀察人員進(jìn)行量表評價，統(tǒng)計3名觀察員的平均值作為神經(jīng)功能評分量值。6.3運(yùn)動行為評價采用疲勞轉(zhuǎn)棒裝置進(jìn)行運(yùn)動行為評價。轉(zhuǎn)速設(shè)置從0rpm緩慢加速至40rpm，測試時間為300秒，測試時將動物置于旋轉(zhuǎn)棒上，記錄動物從旋轉(zhuǎn)棒上掉落的時間。造模前，按照上述參數(shù)設(shè)置對動物進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，待動物從旋轉(zhuǎn)棒上掉落的時間穩(wěn)定后，則訓(xùn)練完成，即可開展造模。造模后，待動物恢復(fù)正常運(yùn)動，按照上述參數(shù)設(shè)置開展疲勞轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)，記錄動物從轉(zhuǎn)棒上掉落的時間，每天進(jìn)行3次試驗(yàn)，每次間隔30分鐘。根據(jù)3次測定的平均掉落時間評價動物運(yùn)動能力。6.4腦梗死體積測定采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色評價動物腦梗死體積。動物安樂死后取腦，并在腦模具中將腦切成厚度相同的切片，隨后將切片置于TTC染液中，避光37℃烘箱孵育。待正常腦組織呈現(xiàn)出鮮紅色，腦梗部位呈現(xiàn)出蒼白色后，將腦片置于4%多聚甲醛中固定后拍照，并將圖像導(dǎo)入醫(yī)學(xué)圖像處理軟件ImageJ分別計算每張腦切片的面積，所有切片梗死灶所在半腦正常腦組織面積、對側(cè)正常半腦面積相加后乘以切片厚度，得到梗死灶所在半腦正常腦組織體積及對側(cè)正常半腦體積，并利用公式計算腦梗死體積比。6.5組織病理診斷動物麻醉后放血，分別用生理鹽水和多聚甲醛對腦組織進(jìn)行灌注，分離腦組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋制成蠟塊，在組織切片機(jī)上將蠟塊切成厚度為4μm的切片，切片應(yīng)包含整個梗死灶及周邊半暗帶組織，然后進(jìn)行蘇木素-伊紅或尼氏染色并封片。由實(shí)驗(yàn)動物病理學(xué)專家進(jìn)行雙盲閱片診斷，觀察梗死灶和半暗帶組織神經(jīng)元壞死及炎癥細(xì)胞活化情況。7結(jié)果判定7.1模型活體評價指標(biāo)1)腦血流。造模后，可見動物腦缺血區(qū)域血管內(nèi)血流信號明顯減弱，表明動物出現(xiàn)腦局部缺血。2)神經(jīng)損害嚴(yán)重程度評分。神經(jīng)損害嚴(yán)重程度評分越高說明損傷越嚴(yán)重，其中，1-6分為輕度損傷，7-12分為中度損傷，13-18分為嚴(yán)重?fù)p傷。造模后，模型組動物神經(jīng)評分應(yīng)至少達(dá)到輕度損傷或以上。3)運(yùn)動功能。造模后，模型組動物從旋轉(zhuǎn)棒上掉落時間平均值應(yīng)顯著低于造模前。4)磁共振成像。必要時，造模小鼠通過磁共振掃描顯示典型的梗死特征。7.2腦梗死體積動物處死后，TTC染色顯示腦梗死部位明顯的蒼白色?？赏ㄟ^下列公式計算動物腦梗死體積百分比，腦梗死體積比（%）=（對側(cè)正常半腦體積-梗死灶所在半腦正常腦組織體積）×100%÷對側(cè)正常半腦體積。7.3組