DB51∕T 2404-2017 大熊貓種群遺傳檔案建立技術(shù)規(guī)程

DB51DB51/T2404—2017大熊貓種群遺傳檔案建立技術(shù)規(guī)程2017-09-19發(fā)布2017-10-01實施四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I 1 1 1 1 2 2 3 4 5 61DB51/T2288-2016野生大熊貓微衛(wèi)星序列microsatellite是指基因組中由1-6個核苷酸為基本重復單元組成的DNA串聯(lián)重復序列，例如（AC）n、（A大熊貓線粒體控制區(qū)PCR擴增引物(ZhangGTr,5’-ACTCTCCACAATGTCTACGGT-3’2ZX1-F：5’-CTACATAGCCCCAACCCCTTTTC-3’ZX1-R：5’-GGTTCTGGCCGCTGTCTCTACTAT-3’ZFX-F：5’-ATAATCACATGGAGAGCCACAAGCT-3’ZFX-R：5’-CTCCTTTTTCCTTATGCACC-3’號為基本標記，16-30號為備選標記，可根據(jù)工作目標選用合適數(shù)量的微衛(wèi)星標記。只有當基本標使用4.1規(guī)定的線粒體標記引物對每個DNA樣品進行PCR擴增，各取PCR產(chǎn)物2-5μL，用濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳來檢測是否擴增成功，只有當PCR擴增成功的樣品才進入后續(xù)分析。若如有多份DNA樣品來自同一個體，選一份或多份參加后續(xù)分析，但必須注明樣品編號，3℃退火45s,72℃延伸50s；最后在72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物在4℃中保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝4到135bp和354bp兩個片段。因此，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現(xiàn)兩條帶的是雄性，出現(xiàn)一當同時擴增鋅指蛋白基因和SRY基因時，PCR擴增所得產(chǎn)物片段長度為130bp和130bp的片段來自X染色體，長度為210bp的片段來自Y染色體，即雌性樣品擴增得到一個130bp的片段，而雄性樣品擴增得到130bp和210bp兩個片段。因此，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現(xiàn)兩條當PCR擴增完成后，取PCR產(chǎn)物5μL，經(jīng)1.5%-2%瓊脂糖凝膠電泳檢5當兩個樣品的微衛(wèi)星標記分型結(jié)果中只有一個標記差異時，對出現(xiàn)9.1分子標記的使用6F:GGAAGCATTAAGGAAAF:AAGCAGTTGTTTTTGC7F:AGGCAGATTTCCCACAR:GTGTCTTGACCACCAGTGATGF:CCTACCTATTTACCTACTTAF:AGGCAGATTTCCCACAF:ACGGGAAGCCTGCTTCTR:AGACACCCAACCGACTF:AACATCCTGGGTATTCTR:TGCAGAGTGAGGACCT