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文檔簡介
第八章環(huán)境毒理學
常用研究方法
11/24/20241哈爾濱工業(yè)大學王立主要內(nèi)容5.25.35.4研究方法概述5.1實驗材料研究內(nèi)容染毒技術(shù)毒理學的3R原則5.5研究方法概述5.1通用研究方法包括:體外試驗
體內(nèi)試驗
流行病學調(diào)查體外試驗體外試驗法(invitrotest):以器官、組織、細胞和生物大分子為試驗對象,在離體狀態(tài)下進行染毒試驗。可以從器官水平、細胞水平、分子水平上研究.(1)器官水平包括器官灌流和組織培養(yǎng)兩種方法。器官灌流技術(shù)是將受試化學物質(zhì)經(jīng)過血管流經(jīng)特定的臟器,觀察環(huán)境污染物在臟器內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化和毒性作用。(2)細胞水平細胞培養(yǎng)在毒理學研究中應(yīng)用極廣泛,所應(yīng)用的細胞包括已建株的細胞系(株)和原代細胞。細胞培養(yǎng)可用于外來化學物質(zhì)的毒性和致癌性的各種篩選試驗。(3)分子水平近代環(huán)境毒理學將生物化學和分子生物學的最近、新技術(shù)引用到實驗研究中:有關(guān)酶、核酸、蛋白質(zhì)的理論滲透到環(huán)境毒理學的多個領(lǐng)域;PCR基因擴增、DNA序列分析、以及單克隆技術(shù)等分子生物學的概念和方法已成為環(huán)境毒理學研究的重要工具,形成生化和分子毒理學分支。
體內(nèi)試驗體內(nèi)試驗(invivotest)多用整體動物進行,也稱整體動物實驗。按人體可能接觸的劑量和途徑使實驗動物在一定時間內(nèi)接觸環(huán)境污染物,然后觀察動物出現(xiàn)的形態(tài)和功能的變化。一般采用的試驗動物有大鼠、小鼠、家兔、狗、猴等哺乳動物,也可采用水蚤等水生生物及魚類。按染毒的持續(xù)時間不同分為急性、亞急性(或亞慢性)和慢性試驗。
①急性毒性試驗:其目的是探明環(huán)境污染物與機體作短時間接觸后所引起的損害作用,找出污染物的作用途徑、劑量與效應(yīng)的關(guān)系,并為進行各種動物實驗提供設(shè)計依據(jù)。一般用半數(shù)致死量(LD50)、半數(shù)致死濃度(LC50)或半數(shù)有效量(ED50)來表示急性毒作用的程度。(24h以內(nèi))
②亞急性毒性試驗:研究環(huán)境污染物反復(fù)多次作用于機體引起的損害。通過這種試驗,可以初步估計環(huán)境污染物的最大無作用劑量和中毒閾劑量,了解有無蓄積作用,確定作用的靶器官,并為設(shè)計慢性毒性試驗提供依據(jù)。(1-3個月)
③慢性毒性試驗:探查低劑量環(huán)境污染物長期作用于機體所引起的損害,確定一種環(huán)境污染物對機體的最大無作用劑量和中毒閾劑量,為制訂環(huán)境衛(wèi)生標準提供依據(jù)。(大于6個月)
流行病學調(diào)查——人群調(diào)查流行病調(diào)查方法是世界環(huán)境毒理學廣泛采用的研究方法.根據(jù)動物試驗的結(jié)果及對環(huán)境污染物毒理作用的預(yù)測或假設(shè),選用適當?shù)挠^察指標對接觸該環(huán)境污染物的人群進行調(diào)查,分析環(huán)境污染與人群健康損害的關(guān)系。人群調(diào)查可以獲得污染物對人體毒性作用的直接觀察資料,但由于人群往往同時接觸多種環(huán)境污染物,加之吸煙、飲酒、用藥、營養(yǎng)等生活習慣和社會生態(tài)條件的不同和變化,對調(diào)查結(jié)果評定時必須去偽存真.三種方法的比較體內(nèi)試驗:反映環(huán)境污染物的綜合生物學效應(yīng);反映在動物整體狀態(tài)下環(huán)境污染物的各種生物學效應(yīng)。多用于檢測外源化學物的一般毒性。體外試驗:多用于對機體急性毒作用的初步篩選,作用機制和代謝轉(zhuǎn)化的深入研究。體外試驗的特點是簡單、快速、經(jīng)濟、條件易于控制。缺點是體外試驗于整體試驗相比較缺乏神經(jīng)—體液調(diào)節(jié)因素的控制,不能全面反映整體狀況下的生物學效應(yīng)。調(diào)查研究:以已有試驗結(jié)果、已有知識為基礎(chǔ),采用醫(yī)學流行病學的調(diào)查方法。人群調(diào)查結(jié)果的評定與試驗研究進行綜合分析,才能得出正確結(jié)論。
實驗材料植物非哺乳類動物哺乳動物微生物實驗材料5.2生態(tài)毒理學環(huán)境毒理學一、實驗動物的準備選擇原則——種屬選擇:1)在機體反應(yīng)上盡量近似于人體,滿足試驗要求。2)易獲得、易飼養(yǎng)、易管理的動物作為實驗材料。3)根據(jù)受檢物質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)選用最敏感、最合適的動物。選擇原則——個體選擇:1)年齡。幼齡-敏感;成年-急性中毒試驗。2)性別。各半。3)生理狀態(tài)。生殖功能的影響-大鼠、小鼠。4)健康狀況。排除對實驗結(jié)果的影響。動物準備——其他事項:1)實驗動物標記編號。染色、耳緣減口、烙印、號牌。2)實驗動物捕捉、固定。兔、鼠。3)實驗動物麻醉。開放法、封閉法。二、毒物的準備1.毒物物理常數(shù):在評價毒理實驗結(jié)果和采用估算方法去推算最高容許濃度時,常需要知道毒物的某些物理常數(shù)。2.劑型及溶劑:為使毒物能夠通過一定途徑染毒,需要制成不同的劑型,水溶液、混懸液、油劑、乳化劑、軟膏、糊劑等。作為溶劑或助劑的物質(zhì)應(yīng)滿足條件:1.其本身毒性要小,LD50一般應(yīng)大于15000ppm2.不與受檢毒物產(chǎn)生增毒或減毒作用3.不影響毒物的吸收4.無特殊的應(yīng)激性或氣味三、生物材料的采集和制備(一)血液的采集采血方法主要根據(jù)實驗?zāi)康暮退柩恳约皠游锓N類進行選擇。注意:采血場所有充足的光線,室溫適宜;采血用具和采血部位一般需進行消毒;采血用的注射器和試管必須保持清潔干燥;若需抗凝全血,在注射器或試管內(nèi)需預(yù)加抗凝劑。(二)尿液的收集尿液的連續(xù)收集:一次性尿液的收集:收集尿液的注意事項:(三)糞便的收集目的是分析糞便中的毒物及其代謝產(chǎn)物的含量,或者是測定蛋白質(zhì)和脂肪經(jīng)腸道的吸收率,以了解毒物對消化功能的作用??衫么x籠和糞尿分離器,必要時可采用灌腸法。(四)呼出氣的收集收集動物呼出氣進行毒物濃度、氧和二氧化碳的分析,以研究毒物的吸收和代謝以及毒物對肺功能的影響。用玻璃面罩將動物的鼻和嘴扣住,再把面罩與呼吸活瓣相連,呼吸活瓣可使進氣和呼出氣分開,并從不同的管口排出。(五)其他體液的收集精液的收集:唾液的收集:胃液的采集:膽汁、胰液、腸液的收集:(六)實驗動物組織勻漿的收集應(yīng)用于酶活力分析的組織勻漿制備應(yīng)用于組織毒物萃取的組織勻漿制備四、預(yù)備實驗預(yù)備實驗一般主要解決的問題:選擇合適的實驗動物設(shè)計染毒劑量及其分組操作技術(shù)的檢驗和訓練發(fā)現(xiàn)新線索、新指標一、染毒途徑的選擇二、吸入染毒三、經(jīng)口染毒四、注射染毒染毒技術(shù)5.3一、染毒途徑的選擇1、人群接觸環(huán)境毒物的實際情況2、毒物的理化性質(zhì)3、受檢毒物的來源4、實際情況需要二、吸入染毒法1、動式吸入染毒(補充圖)2、靜式吸入染毒3、面罩染毒法三、經(jīng)口染毒法1、喂飼法:將毒物和食物混在一起做成毒餌喂給動物2、滴入:將有毒物質(zhì)直接滴入動物口腔3、吞咽:毒物按一定劑量裝入膠囊,直接送至動物口腔4、灌胃:用于確定某種化學物質(zhì)的絕對毒性灌胃法在急性試驗中,經(jīng)口給藥多用灌胃法,此法劑量準確,適用于小白鼠、大白鼠、家兔等動物。1.小鼠、大鼠(或豚鼠)用輸血針頭,將其尖端斜面磨平,用焊錫在針尖周圍焊一圓頭,注意勿堵塞針孔,即成灌胃針;亦可用燒成圓頭的硬質(zhì)玻璃毛細管或特制的塑料毛細管,作為導管。灌胃時將針按在注射器上,吸入藥液。左手抓住鼠背部及頸部皮膚將動物固定,右手持注射器,將灌胃針插入動物口中,沿咽后壁徐徐插入食道。動物應(yīng)固定成垂直體位,針插入時應(yīng)無阻力。若感到阻力或動物掙扎時,應(yīng)立即停止進針或?qū)⑨槹纬?,以兔損傷或穿破食道以及誤入氣管。2.狗、兔、貓、猴
灌胃時,先將動物固定,再將特制的擴口器放入動物口中,擴口器之寬度可視動物口腔大小而定,如狗的擴口器可用木料制成長方形,長約10-15cm,粗細應(yīng)適合狗嘴,約2-3cm,中間粘一小孔,孔的直途為5-10cm。灌胃時將擴口器放于上述動物上下門牙之后,并用繩將它固定于嘴部,將帶有彈性的橡皮導管(如導尿管),經(jīng)擴口器上的小圓孔插入,沿咽后壁而進入食道,此時應(yīng)檢查導管是否正確插入食道,可將導管外口置于一盛水的燒杯中,如不發(fā)生氣泡,即認為此導管是在食道中,未誤入氣管,即可將藥液灌入。圖8-1狗灌胃方法經(jīng)驗方法:給狗、兔等動物灌胃時,可不用擴口器也能順利將藥液灌入胃內(nèi)。狗灌胃時,用12號灌胃管,左手抓住狗嘴,右手中指由右嘴角插入,摸到最后一對臼齒后的天然空隙,胃管由此空隙順食管方向不斷插入約20cm,可達胃內(nèi),將胃管另一端插入水中,如不出氣泡,表示確已進入胃,而沒誤入氣管內(nèi),即可灌入。兔灌胃時,將兔固定在木制固定盒內(nèi)左手虎口卡住并固定好兔嘴,右手取14號細導尿管,由右側(cè)唇裂避開門齒,將導管慢慢插入,如插管順利,動物不掙扎,插入約15cm時,即表示插入胃內(nèi),將藥液注入。各種動物一次灌胃能耐受的最大容積小鼠為0.5-1.0ml,大鼠4-7ml,豚鼠為4-7ml,家兔為80-150ml,狗為200-500ml。四、注射染毒法1、皮下注射2、皮內(nèi)注射3、肌肉注射4、腹腔注射5、靜脈注射6、淋巴囊注射7、脊髓腔內(nèi)8、小腦延髓池9、腦內(nèi)給藥10、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注意:要求毒物對局部損害不能太大(一)皮下注射注射時以左手拇指和食指提起皮膚,將連有5(1/2)號針頭的注射器刺入皮下。皮下注射部位一般狗、貓多在大腿外側(cè),豚鼠在后大腿的內(nèi)側(cè)或小腹部;大白鼠可在側(cè)下腹部。兔在背部或耳根部注射。蛙可在脊背部淋巴腔注射。(二)皮內(nèi)注射皮內(nèi)注射時需將注射的局部脫去被毛,消毒后,用左手拇指和食指按住皮膚并使之繃緊,在兩指之間,用結(jié)核菌素注射器連4(1/2)細針頭,緊貼皮膚表層刺入皮內(nèi),然后再向上挑起并再稍刺入,即可注射藥液,此時可見皮膚表面鼓起一白色小皮丘。(三)肌肉注射肌肉注射應(yīng)選肌肉發(fā)達,無大血管通過的部位,一般多選臀部。注射時垂直迅速刺入肌肉,回抽針栓如無回血,即可進行注射。給小白鼠、大白鼠等小動物作肌肉注射時,用左手抓住鼠兩耳和頭部皮膚,右手取連有5(1/2)針頭的注射器,將針頭刺入大腿外側(cè)肌肉,將藥液注入。(四)腹腔注射用大、小白鼠做實驗時,以左手抓住動物,使腹部向上,右手將注射針頭于左(或右)下腹部刺入皮下,使針頭向前推
0.5~1.0cm,再以45度角穿過腹肌,固定針頭,緩緩注入藥液(圖8-2),為避免傷及內(nèi)臟,可使動物處于頭低位,使內(nèi)臟移向上腹。若實驗動物為家兔,進針部位為下腹部的腹白線離開1cm處。圖8-2小鼠腹腔注射方法
(五)靜脈注射
1.兔:兔耳部血管分布清晰。兔耳中央為動物,耳外緣為靜脈。內(nèi)緣靜脈深不易固定,故不用。外緣靜脈表淺易固定,常用。先拔去注射部位的被毛,用手指彈動或輕揉兔耳,使靜脈充盈,左手食指和中指夾住靜脈的近端,拇指繃緊靜脈的遠端,無名指及小指墊在下面,右手持注射器連6號針頭盡量從靜脈的遠端刺入,移動拇指于針頭上以固定針頭,放開食指和中指,將藥液注入(圖8-3),然后拔出針頭,用手壓迫針眼片刻。圖8-3家兔耳緣靜脈注射方法
2.小白鼠和大白鼠:一般采用尾靜脈注射,鼠尾靜脈有三根,左右兩側(cè)及背側(cè)各一根,左右兩側(cè)尾靜脈比較容易固定,多采用,背側(cè)一根也可采用,但位置容易固定。操作時先將動物固定在鼠筒內(nèi)或扣在燒杯中,使尾巴露出。圖8-4小鼠尾部固定
圖
8-5小鼠尾靜脈注射方法
尾部用45~50℃的溫水浸潤半分鐘或用酒精擦拭使血管擴張,并可使表皮角質(zhì)軟化,以左手拇指和食指捏住鼠尾兩側(cè),使靜脈充盈,用中指從下面托起尾巴,以無名指和小指夾住尾巴的末梢,右手持注射器連4(1/2)號細針頭,使針頭與靜脈平行(小于30℃),從尾下四分之一處(約距尾尖2-3厘米)處進針,此處皮薄易于刺入,先緩注少量藥液,如無阻力,表示針頭已進入靜脈,可繼續(xù)注入。注射完畢后把尾部向注射側(cè)彎曲以止血。如需反復(fù)注射,應(yīng)盡可能從末端開始,以后向尾根部方向移動注射(圖8-5)。3.狗:狗靜脈注射多選前肢內(nèi)側(cè)皮下頭靜脈(圖8-6)或后肢小隱靜脈(圖8-7)注射。注射前由助手將動物側(cè)臥,剪去注射部位的被毛,用膠皮帶扎緊(或用手抓緊)靜脈近端,使血管充盈,從靜脈的遠端將注射針頭平行刺入血管,待有回血后,松開綁帶(或兩手),緩緩注入藥液。圖8-6狗前肢頭靜脈注射
圖
8-7狗后肢小隱靜脈注射4.蛙(或蟾蜍):將蛙或蟾蜍腦脊髓破壞后,仰臥固定于蛙板上,沿腹中線稍左剪開腹肌,可見到腹靜脈貼著腹壁肌肉下行,將注射針頭沿血管平行方向刺入即可(8-8)。圖
8-8蛙腹壁靜脈注射
(六)淋巴囊注射蛙類常采用此法,因其皮下有數(shù)個淋巴囊,注入藥物甚易吸收。腹部淋巴囊和頭背淋巴囊常作為蛙類給藥途徑。一般多選用腹部淋巴囊給藥。注射時將針頭從蛙大腿上端刺入,經(jīng)大腿肌層入腹壁肌層,再進入腹壁皮下,即進入淋巴囊,然后注入藥液。有時也可采用胸淋巴囊給藥。方法是將針頭刺入口腔,使穿過下頜肌層入胸淋巴囊內(nèi)注入藥液,一次最大注射量為1毫升。蛙全身分布為咽、胸、背、腹側(cè)、腹、大腿和腳等七個淋巴囊(圖8-9)。圖8-9蛙全身淋巴囊分布(七)脊髓腔內(nèi)給藥此法主要用于椎管麻醉或抽取腦脊液。家兔椎管內(nèi)注射方法:將家兔作自然俯臥式,盡量使其尾向腹側(cè)屈曲,用粗剪將第七腰椎周圍背毛剪去,用3%碘酊消毒,干后再用79%酒精將碘酒擦去。在兔背部髕骨脊連線之中點稍下方摸動第七腰椎間隙(第七腰椎與第一骶骨椎之間),插入腰椎穿刺針頭。當針到達椎管內(nèi)時(珠網(wǎng)膜下腔),可見到兔的后肢跳動,即證明穿刺針頭已進入椎管。這時不要再向下刺,以兔損傷脊髓。固定好針頭,即可將藥物注入。(八)小腦延髓池給藥此種給藥都是在動物麻醉情況下進行的。而且常采用大動物如狗等,小動物很少采用。將狗麻醉后,使狗頭盡量向胸部屈曲,用左手摸到其第一頸椎上方的凹陷(枕骨大孔),固定位置,右手取7號鈍針頭(將針頭尖端麻鈍),由此凹陷的正中線上,順平行狗的方向,小心地刺入小腦延髓池。當針頭正確刺入小腦延髓池時,注射者會感到針頭再向前穿時無阻力,同時可以聽到很輕的“咔嚓”一聲,即表示針頭已穿過硬腦膜進入小腦延髓池,而且可抽出清亮的腦脊液,注射藥物前,先抽出一些腦脊液,抽取量根據(jù)實驗需要注入多少藥液決定,即注入多少抽取多少,以保持原來腦脊髓腔里的壓力(圖8-10)。圖
8-10狗小腦延髓池給藥
(九)腦內(nèi)給藥此法常用于微生物學動物實驗,將病原體等接種于被檢動物腦內(nèi),然后觀察接種后的各種變化。小鼠腦內(nèi)給藥時,選套有塑料管、針尖露出2mm深的5(1/2)針頭,由鼠正中額部刺入腦內(nèi),注入藥物或接種物。給豚鼠、兔、狗等進行腦內(nèi)注射時,須先用穿顱鋼針穿透顱骨,再用注射器針頭刺入腦部,再徐徐注入被檢物。注射速度一定要慢,避免引起顱內(nèi)壓急驟升高。(十)關(guān)節(jié)腔內(nèi)給藥此種方法常用于關(guān)節(jié)炎的動物模型復(fù)制。兔給藥時,將兔仰臥固定于兔固定臺上,剪去關(guān)節(jié)部被毛,用碘酒或酒精消毒,然后用手從下方和兩旁將關(guān)節(jié)固定,把皮膚稍移向一側(cè),在臏韌帶附著點處上方約0.5厘米處進針。針頭從上前方向下后方傾斜刺進,直至針頭遇阻力變小,然后針頭稍后退,以垂直方向推到關(guān)節(jié)腔中。針頭進入關(guān)節(jié)腔時,通??捎泻孟蟠唐票∧さ母杏X,表示針頭已進入膝關(guān)節(jié)腔內(nèi),即可注入藥液。(十一)其它途徑給藥皮膚給藥為了鑒定藥物或毒物經(jīng)皮膚的吸收作用、局部作用、致敏作用和光感作用等,均需采用經(jīng)皮膚給藥方法。如家兔和豚鼠常采用背部一定面積的皮膚脫毛后,將一定藥液涂在皮膚上,經(jīng)皮膚吸收。直腸內(nèi)給藥此種給藥方法常用于動物麻醉。家兔直腸內(nèi)給藥時,取灌腸用的膠皮管或用14號導尿管代替。在膠皮管或?qū)蚬茴^上涂上凡士林,由助手使兔蹲臥于桌上,以左臂及左腋輕輕按住兔頭及前肢,以左手拉住兔尾,露出肛門,并用右手輕握后肢,實驗者將橡皮管插入家兔肛門內(nèi),濃度約7~9cm,如為雌性動物,注意勿誤插入陰道(肛門緊接尾根)。橡皮管插好后,將注射器與橡皮管套緊,即可灌注藥液。“
三性試驗”
-急性毒性試驗
-亞慢性毒性試驗
-慢性毒性試驗5.4研究內(nèi)容
-繁殖試驗
-蓄積試驗
-代謝試驗“三致”試驗
-致癌變
-致畸變
-致突變急性毒性試驗急性毒性:是生物機體一次或24小時內(nèi)多次接觸外源化學物所引起的毒性效應(yīng),這種毒性效應(yīng)可以反應(yīng)在不同的組織水平上,包括組織、器官和系統(tǒng)的傷害,出現(xiàn)臨床癥狀,甚至死亡。關(guān)鍵點:
半致死量(LD50)和半致死濃度(LC50)的測定1.動物準備
一般采用小動物,如小鼠等。實驗動物應(yīng)預(yù)先觀察7天左右,以了解其健康情況及正?;顒訝顟B(tài)。正式實驗時,按隨機分組原則,一般分成5-6個實驗組,每組5-10只動物。
2.劑量選擇
LD50或LC50的測定需通過若干劑量組同時給藥,最后經(jīng)數(shù)理統(tǒng)計算出。通常用5一6個劑量組,各組間劑量差距可按等差或等比級數(shù)設(shè)計,組距大小隨毒物的毒作用帶寬窄而異,常按等比級數(shù)1.2一1.5設(shè)計,目的是使各劑量組動物的死亡率分布在50%上下。對于沒有測試記錄的化學物,其劑量選擇可先按同系物毒性或文獻資料加以估計,也可先用少量動物(比如每組2只)以組距較大的二系列劑量進行預(yù)備試驗,找出致死作用劑量范圍后,再設(shè)計出正式實驗的劑量組。如倒置現(xiàn)象十分顯著,則應(yīng)從動物選擇、藥液配制、操作技術(shù)及實驗條件等方面查找原因并加以克服,重復(fù)實驗。3.藥液配制及染毒實-驗給藥的劑型,可根據(jù)受檢化學物的溶解性能,采用水溶液、混懸液、油劑或乳劑由于許多化學毒物不溶或難溶于水,也不易溶于油脂,而有機溶劑又多具有一定毒性,故常配制成乳劑或混懸劑。在非吸人染毒實驗中,各劑量組多按單位體重給予等容量藥液的方法給藥,所以需要首先確定單位體重給藥容量L,然后按實驗設(shè)計的最大劑量組藥液濃度,計算配制5Oml乳劑所需毒物量,配成第1號藥液,再按設(shè)計組距,逐組稀釋,分別配制出第Ⅱ號、第皿號、第W號、第V號藥液。等容量給藥法可以保證不同劑量組動物接受相同容量的藥液,排除容量差別可能造成的影響。給藥時可按每相差1g體重增減0.Olml計算。急性毒性測定一般可不用對照組,但如配制實驗用液中用到新溶劑、新助劑,或?qū)嶒灲K結(jié)需做病理組織學觀察時,則應(yīng)有對照組。4.癥狀觀察染毒開始后應(yīng)觀察并記錄實驗動物的中毒表現(xiàn)、生理狀況變化和死亡情況。觀察時間可根據(jù)實驗?zāi)康摹⒍咀饔锰攸c等,確定為幾小時、幾天、一周或兩周,但一般不超過兩周。由于不同毒物的毒性作用特征各不相同,故除了觀察一般狀況及呼吸、循環(huán)功能的改變外,還應(yīng)注意某些特異征象。5.病理學檢查及其他指標觀察
中毒可導致實驗動物病理組織學改變,因此應(yīng)對中毒死亡動物進行及時的病理學檢查,觀察器官是否有淤血、出血、水腫或其他變化,并對有變化的臟器做病理組織學檢查。對存活動物在觀察期滿后也應(yīng)做病理學檢查。如果需要,毒性實驗可進一步增加觀察項目,如對體溫、心跳和腦電的測試以及某些理化指標的檢查。但需注意:這些指標的測試和檢查,不能使用測試半致死量的動物,
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