動(dòng)物疫病鑒別檢測(cè)技術(shù) 第2部分：兔出血癥病毒經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型-地方標(biāo)準(zhǔn)草案報(bào)批稿

ICS11.220CCSB4137在提交反饋意見(jiàn)時(shí)，請(qǐng)將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。IDB37/TXXXX—XXXX本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》給出的規(guī)定起草。本文件是DB37/TXXXX《動(dòng)物疫病鑒別檢測(cè)技術(shù)》的第2部分。DB37/TXXXX已經(jīng)發(fā)布了以下部分：——第1部分：豬瘟強(qiáng)毒與豬瘟疫苗弱毒；——第2部分：兔出血癥病毒經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型；——第3部分：禽腺病毒Ⅰ群與禽腺病毒Ⅲ群。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并組織實(shí)施。本文件由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。DB37/TXXXX—XXXX動(dòng)物疫病是影響山東省畜牧業(yè)健康發(fā)展的重要因素之一。不同病原或者相同病原的不同血清型/基因型引起疫病的臨床病癥具有一定程度的相似性，同時(shí)，有些疫病弱毒疫苗的使用干擾了病原的檢測(cè)。動(dòng)物疫病鑒別檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的建立，規(guī)定了對(duì)不同病原、相同病原的不同血清型/基因型以及弱毒疫苗株的鑒別檢測(cè)，為山東省動(dòng)物疫病精準(zhǔn)防控提供了技術(shù)支持，對(duì)于促進(jìn)畜牧業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。兔出血癥（Rabbithaemorrhagicdisease，RHD）是由杯狀病毒科（Caliciviridae）、兔病毒屬（Lagovirus）成員兔出血癥病毒（Rabbithaemorrhagicdiseasevirus，RHDV）引起的一種急性、強(qiáng)傳染性、病死率高達(dá)40%～90%的傳染病，其典型病變包括呼吸系統(tǒng)出血，實(shí)質(zhì)器官淤血、腫大、出血等，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫?。ㄖ腥A人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第573號(hào)嚴(yán)重威脅著我國(guó)養(yǎng)兔業(yè)的健康發(fā)展。1984年，由RHDV經(jīng)典型引起的RHD首先在我國(guó)暴發(fā)，繼而在各大洲廣泛流行，并不斷發(fā)生遺傳演變，但抗原性保持相對(duì)穩(wěn)定。2010年，由RHDV2變異型引發(fā)的兔出血癥首先在法國(guó)暴發(fā)，不僅導(dǎo)致育肥兔大量死亡，以RHDV經(jīng)典型株制備的滅活疫苗無(wú)法提供完全免疫保護(hù)，可見(jiàn)其抗原性發(fā)生較大變異，之后RHDV2在歐洲、非洲、大洋洲部分國(guó)家開(kāi)始流行，在瑞典、葡萄牙、澳大利亞等國(guó)，RHDV2變異型已經(jīng)取代RHDV經(jīng)典型成為主要流行毒株。我國(guó)于2020年5月在四川省確診了由RHDV2變異型引發(fā)的疫病，作為世界第一養(yǎng)兔大國(guó)，若該變異毒株發(fā)生大規(guī)模流行，勢(shì)必加大防控難度。因此，建立一種可鑒別HDV經(jīng)典型與RHDV2型的檢測(cè)技術(shù)對(duì)于該病的防控具有重要意義。《動(dòng)物疫病鑒別檢測(cè)技術(shù)》擬由三個(gè)部分構(gòu)成：——第1部分：豬瘟強(qiáng)毒與豬瘟疫苗弱毒。目的在于規(guī)范豬瘟強(qiáng)毒與豬瘟疫苗弱毒SYBRGreenI熒光RT-PCR鑒別檢測(cè)技術(shù)的操作，便于檢測(cè)技術(shù)在豬瘟臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查、檢驗(yàn)檢疫、豬瘟疫苗質(zhì)量控制等方面的穩(wěn)定應(yīng)用?！?部分：兔出血癥病毒經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型。目的在于規(guī)范兔出血癥病毒經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR鑒別檢測(cè)技術(shù)的操作，便于檢測(cè)技術(shù)在兔瘟臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查、檢驗(yàn)檢疫等方面的穩(wěn)定應(yīng)用?！?部分：禽腺病毒Ⅰ群與禽腺病毒Ⅲ群。目的在于規(guī)范禽腺病毒Ⅰ群與Ⅲ群PCR鑒別檢測(cè)技術(shù)的操作，便于檢測(cè)技術(shù)在禽腺病毒病臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查、檢驗(yàn)檢疫等方面的穩(wěn)定應(yīng)用。1DB37/TXXXX—XXXX動(dòng)物疫病鑒別檢測(cè)技術(shù)第2部分：兔出血癥病毒經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型本文件描述了兔出血癥病毒（Rabbithaemorrhagicdiseasevirus,RHDV）經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型（Rabbithaemorrhagicdiseasevirus2,RHDV2）實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Real-timeRT-PCR）鑒別檢測(cè)方法。本文件適用于兔及其產(chǎn)品中RHDV經(jīng)典型與RHDV2型的鑒別檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范DB63/T1652病害動(dòng)物及病害動(dòng)物產(chǎn)品無(wú)害化處理技術(shù)規(guī)程3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4試驗(yàn)原理在游離狀態(tài)下，SYBRGreenI染料只發(fā)出微弱的熒光，與雙鏈DNA結(jié)合后熒光信號(hào)大幅度增強(qiáng)。在PCR反應(yīng)過(guò)程中，SYBRGreenI染料與擴(kuò)增的雙鏈DNA產(chǎn)物結(jié)合后發(fā)出熒光，且伴隨擴(kuò)增產(chǎn)物的指數(shù)型上升，熒光強(qiáng)度也隨之上升并被熒光PCR儀檢測(cè)從而獲得熒光擴(kuò)增曲線，之后進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫度（Tm）曲線分析，由于擴(kuò)增產(chǎn)物GC含量差異導(dǎo)致Tm值不同。本文件引物可通用檢測(cè)RHDV經(jīng)典型與RHDV2型靶基因，但由于RHDV擴(kuò)增產(chǎn)物GC含量高于RHDV2擴(kuò)增產(chǎn)物，導(dǎo)致Tm值明顯高于后者，并依此適用于RHDV經(jīng)典型與RHDV2型的鑒別檢測(cè)。5試劑或材料除非另有說(shuō)明，所用試劑均為分析純。5.1水：GB/T6682，一級(jí)。5.2TRIzol試劑。5.3氯仿。5.4異丙醇。5.5反轉(zhuǎn)錄酶M-MuLV及5×反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)緩沖液：反轉(zhuǎn)錄酶濃度200U/μL，均-20℃保存。5.6RNA酶抑制劑：50U/μL，-20℃保存。2DB37/TXXXX—XXXX5.7脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）：為dATP、dGTP、dCTP、dTTP混合物，均為10mmol/L。5.82XSYBRGreenPCRMix：-20℃保存。5.975%乙醇：取無(wú)水乙醇75mL，加滅菌水至100mL，混勻，室溫保存。高壓滅菌15min，4℃保存?zhèn)溆谩?.11磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：取NaCl8g，KCl0.2g，KH2PO40.2g，Na2HPO4.12H2O2.9g，依次溶于800mL水中，用鹽酸調(diào)pH值至7.4，定容至1000mL，置于高壓滅菌鍋121℃滅菌20min，4℃保存。5.12乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝劑：取EDTA-K2·2H2O1.5g，溶于80mL水中，充分溶解后定容至100mL，置于高壓滅菌鍋121℃滅菌20min，室溫保存。5.13一次性無(wú)菌注射器（2.5mL）。5.14無(wú)核酸酶離心管（1.5mL）。5.15商品化病毒核酸提取試劑盒。5.16陽(yáng)性對(duì)照樣品和陰性對(duì)照樣品：RHDV陽(yáng)性對(duì)照樣品為RHDVAV34株（購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）肝組織毒，-20℃保存，RHDV2陽(yáng)性樣品為VP60基因體外轉(zhuǎn)錄的無(wú)感染性RNA，-80℃保存；陰性對(duì)照樣品為RHDV、RHDV2陰性的兔肝組織懸液，-20℃保存。5.17檢測(cè)RHDV與RHDV2的通用引物：Primer-F5’-CAACCGGACTGTTTGTGATGGC-3’；Primer-R5’-ACGCGAACATGATGGGTGTGTT-3’。6儀器設(shè)備6.1Ⅱ級(jí)生物安全柜A型。6.2電子天平：精度0.01g。6.3高速冷凍離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥12000r/min。6.4微型低速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速6000r/min。6.5冰箱：-20℃。6.6超低溫冰箱：-80℃。6.7高壓滅菌鍋。6.8熒光PCR檢測(cè)儀。7樣品7.1肝組織樣品病死兔的病變肝組織樣品采集、保存和運(yùn)輸按照NY/T541執(zhí)行。7.2血液樣品活兔血液樣品采集：將活兔固定，選擇耳緣靜脈清晰的一側(cè)耳朵，剃毛并消毒，壓迫耳根使靜脈充盈，用一次性無(wú)菌注射器（2.5mL）針頭穿刺靜脈采血1.8mL，并將新鮮血液與乙二胺四乙酸二鉀抗凝劑混合，體積比為9:1（V:V）。血液樣品保存和運(yùn)輸按照NY/T541執(zhí)行。8試驗(yàn)步驟8.1樣品處理3DB37/TXXXX—XXXX8.1.1肝臟樣品在Ⅱ級(jí)生物安全柜A型處理。電子天平稱取1.00g±0.05g樣品，剪碎后加入10倍體積PBS，充分研磨成組織勻漿，裝入1.5mL無(wú)核酸酶離心管中，置高速冷凍離心機(jī)4℃、12000r/min離心5min，取上清液提取核酸。8.1.2血液樣品12000r/min離心5min，取上清液提取核酸。8.1.3檢畢樣品按照DB63/T1652處理。8.2核酸提取8.2.1核酸提取方法說(shuō)明待檢樣品、陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照樣品的RNA可使用TRIzol試劑提取，也可使用商品化病毒核酸提取試劑盒并按照說(shuō)明書(shū)提取。8.2.2TRIzol試劑提取樣品RNA8.2.2.1根據(jù)待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的份數(shù)總和取1.5mL無(wú)核酸酶離心管，編號(hào)后每管加入8.2.2.2將待檢樣品、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照樣品上清液各200μL加到相應(yīng)離心管中，顛倒充分混勻。8.2.2.3每管加入氯仿200μL，顛倒充分混勻，4℃、12000r/min離心15min。8.2.2.4吸取8.2.3各管中的上清液（避免吸出中間層）400μL，轉(zhuǎn)移至新的編號(hào)離心管中，每管加入等體積-20℃預(yù)冷30min的異丙醇，顛倒充分混勻。8.2.2.54℃、12000r/min離心15min，棄去上清液，倒置于吸水紙上瀝干，不同樣品離心管應(yīng)在吸水紙的不同位置瀝干。8.2.2.6逐管加入-20℃預(yù)冷30min的75%乙醇1mL，顛倒洗滌。8.2.2.74℃、12000r/min離心10min，棄去上清液，倒置于吸水紙上瀝干，不同樣品離心管應(yīng)在吸水紙的不同位置瀝干。8.2.2.8微型低速離心機(jī)4000r/min離心10s，將管壁上的殘余液體甩至管底部，用微量移液器吸棄。8.2.2.9室溫干燥3min，每管加入焦碳酸二乙酯（DEPC）水25μL溶解RNA，冰浴備用。提取的RNA應(yīng)盡快進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，長(zhǎng)時(shí)間保存放置-80℃超低溫冰箱。8.3熒光RT-PCR檢測(cè)8.3.1反轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20μL。引物Primer-R（10μmol/L）1.0μL，無(wú)核酸酶水2.5μL，65℃作用5min，然后冰浴2min。b）第二階段：依次加入5×反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)緩沖液4μL、RNA酶抑制劑（40U/μL）0.5μL、反轉(zhuǎn)錄酶M-MuLV（200U/μL）1.0μL，混勻后低速離心10s，50℃反應(yīng)30min，然后85℃作用5min終止反應(yīng)。c）反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物應(yīng)在20min內(nèi)進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，剩余產(chǎn)物應(yīng)放置-80℃冰箱保存，以便復(fù)核（如有必要）。8.3.2熒光PCR檢測(cè)8.3.2.1反應(yīng)體系的配制4DB37/TXXXX—XXXX樣品檢測(cè)反應(yīng)體系為20.0μL，配制見(jiàn)表1。表1熒光PCR檢測(cè)反應(yīng)液體系水8.3.2.2加樣將制備的陰性對(duì)照、待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照RT產(chǎn)物各2μL依次分別加入對(duì)應(yīng)熒光PCR檢測(cè)反應(yīng)管中，扣緊管蓋，混勻后低速離心10s。8.3.2.3測(cè)定選擇熒光PCR檢測(cè)儀SYBRGreenI檢測(cè)通道，將配制好的熒光PCR管按順序放入熒光PCR檢測(cè)儀。反應(yīng)程序如下：——第一階段：95℃2min；——第二階段：95℃20s，55℃10s，72℃20s，40個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)72℃延伸時(shí)收集熒光信——第三階段：熔解曲線分析，按照各品牌儀器設(shè)備推薦程序進(jìn)行。9結(jié)果判定9.1結(jié)果分析條件設(shè)定根據(jù)儀器噪聲情況對(duì)閾值設(shè)定進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好過(guò)陰性對(duì)照樣品的擴(kuò)增曲線最高點(diǎn)為準(zhǔn)。9.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)滿足以下條件，試驗(yàn)有效，否則無(wú)效。a）陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)Ct（或Cp）值或Ct（或Cp）>35，且無(wú)特異性熔解曲線。擴(kuò)增曲線與熔解曲線見(jiàn)附錄A的A.1）。c）RHDV2陽(yáng)性對(duì)照的Ct（或Cp）值應(yīng)≤30，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線及熔解曲線，且Tm=82.60℃（RHDV2擴(kuò)增曲線與熔解曲線見(jiàn)附錄A的A.2）。9.3結(jié)果描述及判定9.3.1被檢樣品是否感染RHDV描述及判定檢測(cè)結(jié)果符合以下描述時(shí)，分別判定RHDV陰性或RHDV陽(yáng)性。5DB37/TXXXX—XXXXa）無(wú)Ct（或Cp）值或Ct（或Cp）>35，判為陰性；若Ct（或Cp）值≤35，且無(wú)特異性熔解曲線，判為陰性。b）Ct（或Cp）值≤30，出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，且熔解曲線Tm值為85.0℃±0.5℃,表示樣品中存在RHDV核酸，判為陽(yáng)性（RHDV樣品擴(kuò)增曲線與熔解曲線見(jiàn)附錄A的A.3）。c）30<Ct（或Cp）值≤35，且熔解曲線與陽(yáng)性對(duì)照相符，判定為疑似，再次檢測(cè)仍介于此區(qū)間，判定為陽(yáng)性。9.3.2被檢樣品是否感染RHDV2描述及判定檢測(cè)結(jié)果符合以下描述時(shí)，分別判定RHDV2陰性或RHDV2陽(yáng)性。a）無(wú)Ct（或Cp）值或Ct（或Cp）>35，判為陰性；若Ct（或Cp）值≤35，且無(wú)特異性熔解曲線，判為陰性。b）Ct（或Cp）值≤30，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，熔解曲線Tm值為83.0℃±0.4℃,表示樣品中存在RHDV2核酸，判為陽(yáng)性（RHDV2樣品擴(kuò)增曲線與熔解曲線見(jiàn)附錄A的A.3）。c）30<Ct（或Cp）值≤35，且熔解曲線與陽(yáng)性對(duì)照相符，判定為疑似，再次檢測(cè)仍介于此區(qū)間，判定為陽(yáng)性。9.3.3RH