DB45T 1951-2019 水牛胚胎冷凍保存技術操作規(guī)程

DB45水牛胚胎冷凍保存技術操作規(guī)程Manipulationregulationforcryopreservationofem廣西壯族自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布I II 1 1 1 2 2 3 3 4 4 6 8 9II1水牛胚胎冷凍保存技術操作規(guī)程3.1超低溫保存cryopreservation3.23.3水牛胚胎體外生產技術invitr3.4體外受精invitrofertilization,IVF23.5胞漿內單精子注射技術intracytopl3.6體細胞核移植somaticcellnucleartransfer,SCNT4.1試劑4.2耗材4.3設備4.4實驗室要求5.1各胚胎發(fā)育階段和質量等級的標記5.2不同種類胚胎的標記5.3胚胎細管標記5.3.1細管上標記的胚胎信息含冷凍時間、胚胎種類、胚胎個數、發(fā)育階段、質量。具體標記見如下3A101。而如果是當天冷凍兩枚A級體細胞核移植擴張胚胎，其細胞供體牛的序號為4001,則標記為5.3.2同時做好詳盡的胚胎冷凍表格，注明胚胎所有的相關信息，胚胎信息登記表見附錄C。6冷凍載體的準備6.1程序化細管的準備程序化冷凍細管材料應無毒、耐低溫，細管規(guī)格以0.25mL為宜，細管外觀正常、無變形、無裂痕，封口嚴密。6.2玻璃化冷凍載體的準備可以采用商業(yè)化的玻璃化冷凍載體；也可以采用0.25mL細管，用刀片將其一端斜切，形成一截斜切面，以此切面作為玻璃化冷凍的載體，如圖1所示。圖1玻璃化冷凍載體7胚胎的冷凍7.1胚胎的程序化冷凍7.1.1胚胎的洗滌7.1.2胚胎的平衡程序化胚胎冷凍液成分見附錄B。將洗滌后的胚胎放入冷凍液中，室溫下平衡15min~20min。7.1.3胚胎的裝管將平衡后的胚胎裝入0.25mL細管中，裝管順序為：冷凍液(2cm~3cm)→氣泡(0.2cm~0.5cm)口。每支細管可裝1～2枚發(fā)育狀況與供體相同的胚胎，如圖2所示。棉塞冷凍液氣泡棉塞冷凍液氣泡冷凍液和胚胎氣泡冷凍液封口圖2胚胎的裝管順序47.1.4冷凍程序率降至-7℃,用鑷子纏好滅菌棉，浸入液氮，迅速接觸細管棉塞和冷凍液的交界面進行植冰。植冰后7.2胚胎的玻璃化冷凍7.2.1液氮的準備7.2.2冷凍平衡液和冷凍液的準備7.2.3冷凍胚胎的平衡7.2.4玻璃化冷凍步驟8.1貯存凍胚和液氮的生物容器均不可疊放。用液氮生物容器貯存時，細管應完全浸沒到液氮中。液8.2移動液氮生物容器時，應輕拿輕放，防止沖撞、震動和傾倒。9.1程序化冷凍胚胎的解凍9.1.1解凍液的準備9.1.2細管的解凍59.2玻璃化冷凍胚胎的解凍將帶有胚胎的一端放入微滴內輕輕晃動，在體視顯微鏡下見胚胎脫出后，將胚胎取出用解凍9.3胚胎的復蘇檢測6A.1.1試劑名稱A.1.2試劑要求A.1.3胚胎體外培養(yǎng)液3A.1.4血清的滅活處理）：）