(新版)靶向高通量測序在感染性疾病中應用與實踐專家共識

高通量測序(NGS)技術為臨床感染性疾病提供了高通量檢測技術手段，主要包括宏基因組高通量測序(mNGS)、靶向高通量測序(tNGS)和全基因組測序(WGS)。tNGS和mNGS通量高，可一次性檢測百種以上病檢病原，但易受人源背景干擾。而tNGS通過特異性引物擴增或者雜交捕獲的方式靶向富集目標病原體或基因，測序量僅為mNGS百分之一，成tNGS按照技術路線可分為多重PCR擴增法和探針捕獲法。多重PCR擴增法通過設計特異性引物進行超多重PCR擴增富集目標病原體的靶核苷酸序列，而探針捕獲法則通過探針雜交捕獲的方式進行富集。多重PCR擴增法比探針捕獲法成本更低且速度更快，工更少，但覆蓋的靶病原體不如探針捕獲法多。探針捕獲的靶區(qū)范圍更廣，顯著減少PCR冗余擴增導致的完全重復序列[4]。盡管tNGS已用流程、報告發(fā)放和結果判讀的共識，可為感要依據(jù)。為此，中國醫(yī)療保健國際交流促進物學檢驗、感染病學、呼吸病學、流行病學等領共識，以助力tNGS的規(guī)范化應用。tNGS與等一致之處，本共識不再贅述，具體可參考mNGS相關團體標準和專家一、共識制訂過程next-generationsequencing"“infection”“moleculardiagnostictechnology"“molecularantimicrobialsusceptibilitytesting”為關萬方數(shù)據(jù)知識服務平臺和維普數(shù)據(jù)庫自建庫至2024年9月的中、英文文獻，經(jīng)去重和同類文獻優(yōu)選等處理，最終納入符合本共識主題的文獻31議，再由執(zhí)筆小組進行多輪修改，形成修改稿，并進行兩次專家評議會，第一輪評議專家22位，其中臨床專業(yè)(包括感染、呼吸、重癥專業(yè))8生物信息專業(yè))5位。初稿推薦共識條目38條。刪除12條爭議比較大的第二輪評議專家31位，其中臨床專業(yè)(包括感染、呼吸、重癥專業(yè))15位，微生物學專業(yè)11位，其他專業(yè)(包括基礎醫(yī)學、公共衛(wèi)生、生命科學、生物信息專業(yè))5位。評議選項包括：同意、不同意、棄權。規(guī)則：90%以上評議專家同意則該共識描述為“建議”;70%~90%同意則該共識描述為“考慮”;70%以下同意則不納入共識。(一)病原診斷適應證道感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等常見病原譜不同，因此tNGS微生物靶標設病原體，不建議納入某癥候群中無臨床意義的微生傳統(tǒng)微生物學檢測陰性時，考慮送檢tNGS;病情危重或新發(fā)突發(fā)傳染病時，考慮送檢mNGS。方法。tNGS相比PCR方法靶標范圍更廣[9]。肺部感染的患者中，tNGS相比傳統(tǒng)檢測方法具有更高的陽性率(96.7%比36.8%)[10]。共識2:針對不同的感染部位，建議覆蓋相應病原譜的tNGS,比如肺部一項納入177名受試者201份支氣管肺泡灌洗液(BALF)標本的研究顯和67.1%[11]。此外，102例肺部感染患者的痰液和BALF的研究中，tNGS(82.2%,106/129)與mNGS陽性率(86.5%,109/126)結果顯示，培養(yǎng)、PCR和tNGS分別鑒定出13、19和62種微生物，這提示tNGS比常規(guī)檢測方法檢出了更多病原[13]。共識4:建議根據(jù)臨床需求和醫(yī)療花費選擇不同tNGS方法。多重PCR多重PCR擴增tNGS方法通?；谂R床已知致病病原序列設計，且相比共識5:臨床高度懷疑結核分枝桿菌感染或抗酸染色陽性需鑒別非結核分枝桿菌(NTM)感染時，考慮選用包括結核分枝桿菌復合群及致病性NTM的tNGS。結核病患者的早期發(fā)現(xiàn)和分診具有重要的臨床和流行病學意義[14]。tNGS有助于從(亞)種或復合群水平區(qū)分結核分枝桿菌和NTM。一項納入370株分離株、73個種/復合群的研究顯示，tNGS與基于表型、rpoB和(或)16SrDNA一代測序的復合參比方法相比，292株結果在(亞)種或復合群水平完全一致。在103、102和101基因組拷貝的梯度稀釋條件下，tNGS成功鑒定結核分枝桿菌的比例分別為16/16、13/16和0/16,成功鑒定胞內分枝桿菌的比例為3/3、3/3和2/3[15]。(二)微生物耐藥適應證測序深度難以分析亞型，因此不建議mNGS常規(guī)用于耐藥基因檢測。而tNGS檢測的靶標相對確定，可將水解酶亞型特定區(qū)段作為富集靶標，且相比mNGS的耐藥基因檢測限更低。使用臨床標本進行tNGS耐藥基因共識6:結核分枝桿菌培養(yǎng)和藥敏試驗時間長，建議tNGS用于呼吸道標2024年，WHO推薦tNGS用于結核分枝桿菌分子藥敏檢測[16]。經(jīng)細菌學確診的肺結核患者，可在呼吸道標本(痰液、BALF等)中使用tNGS技術檢測利福平、異煙肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺和氟喹諾酮類的耐藥性；相關藥物的耐藥基因靶點應至少包括第一級耐藥基因(如rpoB、inhA、katG、embA、embB、pncA、gyrA、gyrB等),可參考WHO指南推薦[17]。經(jīng)細菌學確診的利福平耐藥肺結核患者，可在呼吸道標本(痰液、BALF等)中使用tNGS技術檢測異煙肼、乙胺丁醇、吡此外，當患者體內存在異質性耐藥時，研究發(fā)現(xiàn)tNGS技術通過擴增靶標能力和標本中細菌載量相關[15]。-內酰胺酶(ESBLs)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、萬古霉素美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)M100文件推薦部分微生物中對以下位點可進行分子檢測[20],但tNGS需要積累更多證據(jù)，且應盡可啶-阿維巴坦敏感)和酶抑制劑耐藥型(對頭孢他啶-阿維巴坦耐藥)等，結果和表型藥敏在部分標本中一致[11],但實際臨床應用尚需更多測[24],后逐漸擴展至人感染相關的其他病原[25]及環(huán)境(一)引物/探針設計共識9:建議tNGS引物或探針設計遵循特異、保守、堿基均勻的原則，引物/探針及目的片段大小應控制在適當?shù)姆秶?，如擴增子長度宜在200bp內，探針長度宜介于80~120bp。引物和探針需完成干實驗和濕實驗引物/探針的數(shù)量及組合，應考慮但不限于病原鑒定的特異性、敏感性、包容性等。引物/探針的序列應能夠特異性識別目標病原體微生物的基因引物/探針序列中的ATCG堿基應均勻分含量為40%~60%,避免出現(xiàn)連續(xù)重復序列和嚴重的二級結構[14],引物和探針的長度越引物和探針的性能評價需通過生物信息分析如采用PrimerBLAST等軟(二)防污染措施1.實驗室防污染措施共識10:tNGS實驗過程中靶標被極大富集，核酸污染場地要求建議參考已發(fā)表的專家共識和團體標準中的mNGS檢測病原微程的質量控制要求可參考已發(fā)表的高通量測序專家共識[29]。2.生物信息降噪措施共識11:試劑工程菌、背景環(huán)境菌、環(huán)境中的氣溶膠可能導致假陽性結基線數(shù)據(jù)庫主要包括陰性對照基線和歷史檢測基于當批陰性質量控制(質控)樣本檢測到微生物數(shù)據(jù)建立同批次對照基對照基線。與基線數(shù)據(jù)比較，進一步確認檢測結(三)性能確認共識12:tNGS檢測中引物/探針、酶等關鍵原材料或檢測流程中關鍵參標本前處理方法、提取試劑、測序試劑等發(fā)生變化都會影響tNGS檢測結果。確認滿足預期技術要求和臨床需求的檢測試劑和流程不應輕易改變。性能確認時應選用各種類型的代表性物種進行實驗，至少應覆蓋DNA病(四)質控共識13:建議進行全流程質控，包含陰性對照、陽性對照、內參、數(shù)據(jù)臨床標本規(guī)范采集的要求與mNGS無差異，可參考已有專家共識和行業(yè)(一)核酸提取共識14:核酸提取試劑盒應兼顧不同病原類型的提取效率，試劑工程菌標本前處理要求和核酸提取注意事項與mNGS無差異，建議參考已發(fā)表(二)建庫和測序共識15:根據(jù)不同癥候群、靶標范圍、擴增富集效率等因素確定文庫長特點制定合適的讀長和數(shù)據(jù)量是保證分析結果準確的關鍵。長讀長(如≥量根據(jù)不同癥候群、擴增或捕獲效率等研究確測限95%檢出率所需要的最低序列數(shù)。(三)生物信息學分析共識16:為確保數(shù)據(jù)質量可滿足后續(xù)分析要求，建議實驗室對原始測序特征(如常見的引物、探針的二級結構)識別或去除人源序列。此外，基于多重PCR的tNGS,應建立引物量比對數(shù)據(jù)庫以及陽性判斷閾值建立和驗證[14]。共識17:建議實驗室在國際/國內公認的公共數(shù)據(jù)庫的基礎上篩選高質量數(shù)據(jù)庫建立可參考團體標準和專家共識[5,8]。在比對分析時，應關注富集區(qū)段的單核苷酸多態(tài)性(SNP)變化，這些區(qū)段可能包含病原(四)陽性判斷值確定共識18:實驗室綜合考慮標本類型、靶標類型、富集效率等因素，設立陽性判斷值的確定應包括以下步驟，(1)檢出病原二次驗證，明確該病原進一步驗證。(2)陽性判斷值建立：考慮到tNGS方法學靶標較多(通常超過100種)且覆蓋較多的罕見病原，對每種病原(特別是罕見)建立陽性判斷值較為困難?？筛鶕?jù)病原類型、檢出效率或同源的引物/探針進行曲線分析以確定陽性判斷值和分析性能[14]。(3)結合影像學、病斷性能。共識19:實驗室應建立用于監(jiān)測和管理生物信息學分析程序、流程及數(shù)共識20:實驗室應對生物信息分析的結果進行解釋和驗證，包括解釋檢共識21:測序數(shù)據(jù)可考慮以fastq或bam格式雙份存儲于不同的儲存介比mNGS,在報告發(fā)放和解讀的過程中應額外考慮tNGS的病原覆蓋范基因信息判讀、多學科會診和總結(必要時)。(一)報告發(fā)放2.病原微生物注解致病性分級(二)責任病原體臨床判讀和處置1.責任病原體臨床判讀共識23:建議結合標本類型、病原種類、均一化序列數(shù)等指標進行報告理論上，針對不同癥候群的tNGS在設計時已排除不相關的微生物，但仍/少見病原，可查詢文獻、CAP-CHINA等網(wǎng)站，尋找文獻支持；并及時能性，必要時可尋求其他臨床證據(jù)。應注意，不同標本的tNGS序列數(shù)不2.責任病原體臨床處置如確定為致病微生物，根據(jù)tNGS報告的結果進行針對性治療。應密切關注患者治療效果，如已采取針對性治積極與其他病因相鑒別，重復采樣、或送檢不同部位標本、或更換其他(三)陰性結果臨床判讀和決策共識24:陰性結果不建議單獨作為排除依據(jù)，應結合tNGS的靶標覆蓋濕實驗技術問題導致：破壁困難導致核酸未徹底釋放、微生物含量過低、標本采樣不規(guī)范、存儲或運輸不當?shù)龋?3)干實驗問題導致：微生物序列(四)耐藥基因判讀共識25:建議結合相對應的病原微生物均一化序列數(shù)、耐藥機制、tNGS對于結核分枝桿菌耐藥檢測，耐藥結果顯示陽性共識26:tNGS報告單建議標注使用的tNGS方法(探針捕獲/多重PCR擴增),并可考慮分為以下主要部分：臨床診斷、標本信息、病原微生物多重PCR擴增tNGS方法，建議報告：病原類型、中英文名稱、耐藥基因、毒力基因、均一化序列數(shù)、擴增的引物數(shù)/靶標預設的引物數(shù)、陽性判斷值、特異性序列長度和致病性(掃描二維碼可瀏覽附錄1:多重PCR擴增tNGS