乙型肝炎病毒核苷（酸）類似物耐藥的檢測

乙型肝炎病毒核苷(酸)類似物耐藥的監(jiān)測

繆曉輝2009.5一、HBV耐藥的有關(guān)定義

病毒學(xué)突破（virologicbreakthrough）病毒反跳（viralrebound）生化學(xué)突破（biochemicalbreakthrough）HBV基因型耐藥（genotypicresistance）HBV表型耐藥（phenotypicresistance）臨床耐藥（clinicalresistance）HBV耐藥的有關(guān)定義

病毒學(xué)突破（virologicbreakthrough）指在核苷類藥物治療過程中，患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在繼續(xù)治療中血清HBVDNA水平與最低值相比上升或超過1個log10（10倍）。HBV耐藥的有關(guān)定義

病毒反跳（viralrebound）指核苷類藥物治療過程中患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在繼續(xù)治療中血清HBVDNA升高至＞2×104IU/mL或高于治療前水平。

HBV耐藥的有關(guān)定義

生化學(xué)突破（biochemicalbreakthrough）指在核苷類藥物治療過程中血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平一度復(fù)常，但在繼續(xù)治療中血清ALT水平又再次升高。肝臟生活指標(biāo)很多，但是在此僅指ALT。HBV耐藥的有關(guān)定義

HBV基因型耐藥（genotypicresistance）指HBV基因組中的某些位點發(fā)生改變，導(dǎo)致這種藥物對HBV的抑制作用下降或消失。這種HBV基因變異與HBV的耐藥性有直接因果關(guān)系，通過這些變異位點的檢測可判斷HBV有無耐藥性。HBV耐藥的有關(guān)定義

HBV表型耐藥（phenotypicresistance）通過體外細(xì)胞培養(yǎng)方法，直接測定HBV對某種藥物的敏感性，或者在體外直接測定HBV聚合酶的活性，敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐藥，即表型耐藥。通常以IC50來評估IC50＜5倍:敏感IC50在5～10倍:部分耐藥IC50

＞10倍:耐藥HBV耐藥的有關(guān)定義

臨床耐藥（clinicalresistance）指臨床出現(xiàn)病毒復(fù)制不能被抑制，或HBV復(fù)制一度被抑制后又出現(xiàn)HBVDNA反跳，同時伴有ALT升高，或肝炎復(fù)發(fā)的其他臨床證據(jù)。病毒學(xué)反跳或突破的監(jiān)測HBV基因型耐藥監(jiān)測HBV表型耐藥檢測臨床耐藥監(jiān)測病毒學(xué)反跳或突破的監(jiān)測HBV基因型耐藥監(jiān)測時機(jī)非必須不主張常規(guī)、廣泛應(yīng)用基因型耐藥相關(guān)變異的命名基因型耐藥相關(guān)變異

在HBV多聚酶序列中的位置直接測序法末端終止法化學(xué)裂解法DNA測序自動化使用特異性引物與單鏈模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)，用ddNTP終止，用PAGE區(qū)分長度僅相差1個核苷酸的ssDNA，從而完成測序的方法。用化學(xué)試劑在A、G、C、T處特定的裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈，經(jīng)過PAGE放射自顯影可直讀DNA順序。類似末端終止法，所不同的是用熒光染料標(biāo)記，計算機(jī)自動讀出。優(yōu)點簡便、迅速、應(yīng)用廣泛。不需酶促反應(yīng)，可以對寡核苷酸測序。①簡便、快速、準(zhǔn)確可靠。②安全、無放射性污染。③模板用量大大減少。④測序能力增強(qiáng)。HBVYMDD變異直接測序結(jié)果圖譜直接DNA測序的局限性克隆測序法克隆測序法

堿基變異可能導(dǎo)致：①原有位點消失②產(chǎn)生新的位點③識別位點移位

利用錯配引物使PCR產(chǎn)物中產(chǎn)生特異的酶切位點結(jié)果:酶切片段長、短變化和多、少變化限制性內(nèi)切核酸酶的作用它們能識別DNA的特異序列，并在識別序列內(nèi)或其旁切割雙鏈DNA。如：NdeI限制酶的識別序列和切割位點：CA

TATGGTATACNlaIll限制酶的識別序列和切割位點：CATGNNNGTACNNNPCR-RFLP檢測HBVYMDD變異PCR錯配引物設(shè)計PCR-RFLP檢測HBVYMDD變異PCR-RFLP檢測HBVYMDD變異INNO—LiPA診斷HBVYMDD變異BiologicalSampleAnalyzedataScannermicroarray“Hybridize”arrayerMicroarrayfabricationSamplepreparationMolecularhybridizationDetectionandanalysisDetectionofYMDDMotifMutantsbyOligonucleotideChipsinLamivudine-UntreatedPatientswithChronicHepatitisBVirusInfection。JKoreanMedSci2004;19:541-546.實時熒光定量PCR在基因變異中的應(yīng)用HBVDNA>105copies/mlW:M=1:1HBVDNA>105copies/mlW:M=10:1HBVDNA<105copies/mlW:M=10:1：W：M

優(yōu)點不足

靈敏度高需要相對較貴的熒光PCR儀特異性好需要多條熒光探針，成本高費時短影響因素多，存在一定誤判熔解曲線法檢測YMDD變異特異性探針，其Tm值不同溶解曲線分析基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)原理MALDI-TOFMS檢測

HBVYMDD變異的原理酶切分子量.JPG基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)優(yōu)點：高靈敏度、準(zhǔn)確度、分辨率能發(fā)現(xiàn)相對比例小于1%的變異株。局限性：設(shè)備昂貴，目前國內(nèi)難以用于臨床檢測。AdvancesinMolecularDiagnosisofHBVInfectionandDrugResistance。Int.J.Med.Sci.20052(1)：8-161Sensitivityherereferstothelowestlevel(%)atwhichanassaycandetectmixturesofmutantandwild-typevirus.2Informationcontentisconsideredasameasureofatest’sabilitytoprovidebroad,relevantinformationaboutpossiblenewmutations.3Updateabilityassessestheeaseatwhichatestcanbedaptedtoincorporatethedetectionofanewmutation.na,notapplicable.nd,notdetermined.HBV表型耐藥檢測有兩種途徑：1.細(xì)胞外HBV聚合酶活性分析。2.細(xì)胞藥物敏感性實驗。細(xì)胞外HBV聚合酶活性分析目前常用的研究HBV聚合酶活性模型是將HBV基因組插入桿狀病毒載體，繼而轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞而表達(dá)HBV顆粒，應(yīng)用親和層析法純化HBV顆粒后，在細(xì)胞外評價藥物對聚合酶活性的影響。細(xì)胞外HBV聚合酶活性分析細(xì)胞藥物敏感性實驗該方法類似于細(xì)菌藥物敏感試驗。目前多采用病毒載體將含有被檢測的含HBV變異位點的全基因組導(dǎo)入肝細(xì)胞源性細(xì)胞株，然后將各種濃度的核苷類藥物加入培養(yǎng)液，經(jīng)過一定時間培養(yǎng)后檢測細(xì)胞上清中的HBVDNA含量。

細(xì)胞藥物敏感性實驗細(xì)胞藥物敏感性實驗臨床耐藥監(jiān)測YMDD變異前后病毒載量和ALT的變化HBVMDD變異與病毒學(xué)突破判斷臨床耐藥時的建議1.結(jié)合核苷類藥物的應(yīng)用史、起始病毒載量、是否合并其他肝病等。2.注意甄別依從性不良。3.結(jié)合基因變異位點。三、需要重視的幾個問題YMDD自然變異的幾組數(shù)據(jù)本實驗室關(guān)于YMDD自然變異

的2組數(shù)據(jù)196例CHB患者中，檢出存在YMDD變異毒株者共21例，檢出率為10.7%。其中YVDD陽性20例，YIDD陽性1例，YVDD和YIDD同時陽性者0例。183例CHB患者中，檢出