AbMole-巨人之肩ChemBridge奠定全新SIK2抑制劑的發(fā)現(xiàn)

AbMole推薦—巨人之肩，ChemBridge奠定全新SIK2抑制劑的發(fā)現(xiàn)由蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科的FangWang，YiZhang，JinhuaZhou團(tuán)隊(duì)發(fā)表的名為“AnovelSIK2inhibitorSIC-19exhibitssyntheticlethalitywithPARPinhibitorsinovariancancer”的論文中，研究人員從ChemBridge化合物庫中篩選出能夠與鹽誘導(dǎo)激酶2（SIK2）結(jié)合的全新抑制劑SIC-19，該抑制劑通過泛素化途徑促進(jìn)SIK2蛋白降解。SIC-19不僅在多種卵巢癌細(xì)胞系上體現(xiàn)較好的抑制活性，還在卵巢癌類器官和SKOV3異種移植體內(nèi)模型中增強(qiáng)了PARP抑制劑Olaparib的抑癌效果。SIK2是一種屬SNF1/AMP家族的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能調(diào)節(jié)多種生物學(xué)功能，并在不同途徑中充當(dāng)信號傳遞的角色。SIK2能通過促進(jìn)糖酵解、抑制氧化磷酸化及糖異生來增強(qiáng)Warburg效應(yīng)，并促進(jìn)脂肪合成和脂肪酸β-氧化以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝，最終誘導(dǎo)卵巢癌的生長、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移。已有的SIK2抑制劑特異性不強(qiáng)，因此需要尋找到特異性更強(qiáng)的SIK2抑制劑。一、篩選新型SIK2蛋白抑制劑研究人員使用MolecularOperatingEnvironment（MOE）軟件進(jìn)行SIK2蛋白的同源建模。通過BLAST分析確定模板晶體結(jié)構(gòu)，通過Ramachandran圖分析驗(yàn)證了模型的準(zhǔn)確性。接下來，研究人員使用調(diào)整好的蛋白模型進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選。定義SIK2蛋白的PDIG別構(gòu)位點(diǎn)為結(jié)合位點(diǎn)，先對ChemBridge化合物庫進(jìn)行高通量剛性篩選，得到排名靠前的15000個化合物。然后，研究人員對這些化合物進(jìn)行柔性對接和多中心對接，得到評分最高前100個化合物。隨后，從Chembridge化合物庫中獲得前20個化合物用于進(jìn)一步篩選。之前的研究表明SIK2可誘導(dǎo)AKT在Ser473處和MYLK在Ser343處的磷酸化，因此作者通過檢測上述特定位點(diǎn)處的磷酸化水平來評估所開發(fā)的SIK2抑制劑的功效。結(jié)果顯示，與其他組相比，ChemBridge化合物SIC-19更顯著地降低了AKT在Ser473處的磷酸化水平，甚至效果要優(yōu)于陽性對照ARN-3236。對MYLK-Ser343的磷酸化檢測也驗(yàn)證了這一結(jié)果。圖1.新型SIK2抑制劑的設(shè)計(jì)與篩選二、探究SIC-19對SIK2的抑制機(jī)理隨后作者通過計(jì)算機(jī)模擬分析了SIC-19對SIK2的作用機(jī)制，并且還發(fā)現(xiàn)經(jīng)過SIC-19處理后，SIK2的蛋白表達(dá)水平明顯降低，而相同濃度的ARN-3236則無明顯變化。并且SIC-19還可縮短SIK2蛋白的半衰期。作者還通過設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)證明了SIC-19介導(dǎo)的SIK2降解依賴蛋白酶體，并且SIC-19可增加SIK2的泛素化修飾。綜上，SIC-19通過泛素化-蛋白酶體的途徑誘導(dǎo)SIK2的降解。隨后為了評估SIC-19對腫瘤細(xì)胞的功效，研究人員檢測了SIC-19對6種卵巢癌細(xì)胞系的IC50值，范圍為2.13μM至9.74μM，而且該IC50值與SIK2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。圖2.SIC-19通過泛素化途徑促進(jìn)SIK2蛋白降解三、SIC-19可增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對PARP抑制劑的敏感性已知SIK2會降低AKT-（pS473）的磷酸化并增加γH2AX，而后者又是DNA雙鏈斷裂（DSB）損傷的重要標(biāo)志。因此，作者對SIC-19能否增加卵巢癌細(xì)胞對PARP抑制劑的敏感性進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示與對照組相比，SIC-19處理可明顯降低奧拉帕利（Olaparib）和尼拉帕利（Niraparib）的IC50，這與直接敲除SIK2的結(jié)果是相似的?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測實(shí)驗(yàn)等結(jié)果也證實(shí)了上述猜想。并且研究人員通過彗星實(shí)驗(yàn)證明了SIC-19處理增加了PARP抑制劑造成的細(xì)胞損傷。綜上，SIC-19通過降解SIK2并且利用\o"LearnmoreaboutDNArepairfromScienceDirect'sAI-generatedTopicPages"DNA修復(fù)缺陷來增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對PARP抑制劑的敏感性。隨后，用SIC-19和各種濃度的Olaparib對類器官進(jìn)行5天的組合處理，并計(jì)算細(xì)胞存活率。結(jié)果表明，當(dāng)用SIC-19和Olaparib的組合處理時，具有高SIK2表達(dá)的類器官表現(xiàn)出顯著的活性降低。圖3.SIC-19在體外提高了卵巢癌對PARP抑制劑的敏感性四、SIC-19增強(qiáng)PARP介導(dǎo)的DNA損傷和凋亡為驗(yàn)證SIC-19可引起DNA損傷和凋亡，作者設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)。DNA損傷常表現(xiàn)為微核的增加，DAPI染色的結(jié)果表明，SIC-19處理和直接敲除SIK2含微核的細(xì)胞百分比顯著增加。γH2AX染色和彗星試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在卵巢癌SKOV3細(xì)胞中敲除SIK2和SIC-19處理后，病灶形成率均有所增加；彗星試驗(yàn)結(jié)果顯示，敲除SIK2和SIC-19處理后，尾部中DNA的量增加。圖4.SIC-19增強(qiáng)PARP介導(dǎo)的DNA損傷和凋亡為進(jìn)一步研究SIK2對同源重組（HR）介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)的影響，在穩(wěn)定表達(dá)野生型BRCA1/2的SKOV3、OVCAR8和A2780細(xì)胞中進(jìn)行了HR報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，發(fā)現(xiàn)SIK2敲除和SIC-19處理都導(dǎo)致GFP+細(xì)胞比例下降，表明HR介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)受損。上述發(fā)現(xiàn)表明，靶向SIK2會誘導(dǎo)DSB損傷，阻礙卵巢癌細(xì)胞的同源重組修復(fù)（圖4）。SIC-19可增強(qiáng)體內(nèi)卵巢癌對PARP抑制劑的敏感性隨后作者還分別驗(yàn)證了SIK2可易位至細(xì)胞核、SIC-19可阻斷核微絲的形成，以及SIK2通過磷酸化RAD50的Ser635位點(diǎn)調(diào)控MRN復(fù)合體和核微絲。并對SIC-19與PARP抑制劑Olaparib組合的體內(nèi)效果進(jìn)行評估。SKOV3異種移植中，用SIC-19或奧拉帕尼單獨(dú)處理顯著抑制腫瘤生長（P<0.05），而二者聯(lián)合后效果更加顯著（P<0.01），且大大提高生存率。而這些結(jié)果與在OVCAR8異種移植模型中觀察到的結(jié)果一致。SKOV3和OVCAR8異種移植腫瘤的免疫組化分析進(jìn)一步驗(yàn)證了之前的體外結(jié)果，用SIC-19處理增加γH2AX水平，并且當(dāng)與Olaparib組合時，效果進(jìn)一步增強(qiáng)。并且在SIC-19處理的腫瘤中，SIK2表達(dá)及其直接下游效應(yīng)物pRAD50-Ser635均有所降低（圖5）。圖5SIC-19增強(qiáng)體內(nèi)卵巢癌對PARP抑制劑的敏感性六、總結(jié)圖6.基于ChemBridge數(shù)據(jù)庫的SIK2抑制劑篩選在本研究中，研究者模擬了SIK2在體內(nèi)的蛋白模型，并從ChemBridge化合物數(shù)據(jù)庫的1400000個化合物中篩選出全新的SIK2抑制劑。在此過程中，ChemBridge多樣性好且成藥性強(qiáng)的化合物庫為實(shí)現(xiàn)這一重大突破提供了堅(jiān)實(shí)的支持。最終，研究人員在ChemBridge化合物庫中篩選出結(jié)合好、活性高的化合物，并應(yīng)用到了抑制卵巢癌的體內(nèi)外研究中！鳴謝：WangF,YuX,QianJ,Cao