博士專題：基因功能研究技術(shù)之基因敲除及基因編輯技術(shù).ppt

1、a,1,博士專題：基因功能研究技術(shù)之 基因敲除、基因編輯技術(shù),劉惠榮 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,a,2,II、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失,基因敲除，又稱基因打靶，是一種遺傳工程技術(shù)，是在轉(zhuǎn)染細胞中發(fā)生外源打靶基因與核基因組目標基因之間的DNA同源重組，能夠使外源基因定點地整合到核基因組的特定位置上，從而達到改變細胞遺傳特性的目的。 傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)依賴于細胞內(nèi)自然發(fā)生的同源染色體的隨機交換，但在體細胞內(nèi)，基因同源重組的效率特別低（低于10-6），增加了實際操作的工作量，限制了該項技術(shù)的應用。 1987年，Thompsson首次建立了完整的ES細胞基因敲除的小鼠模型，此后基因敲除技術(shù)

2、得到進一步的發(fā)展和完善，目前該技術(shù)已經(jīng)成為研究基因功能最直接、最有效的方法之一。,a,3,基因敲除技術(shù)分為完全基因敲除、條件型基因敲除、誘導型基因敲除。 完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細胞或動物個體中的靶基因活性。 條件型基因敲除是指通過定位重組系統(tǒng)實現(xiàn)特定時間和空間的基因敲除。 誘導型基因敲除是通過對誘導劑給予時間的控制，在動物的一定發(fā)育階段和一定組織細胞中實現(xiàn)對特定基因進行敲除的技術(shù)。,a,4,基因載體的構(gòu)建：把目的基因和與細胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA 分子都重組到帶有標記基因(如neo 基因，TK 基因等)的載體上，成為重組載體?；蚯贸菫榱耸鼓骋换蚴テ渖砉δ?，所以一

3、般設計為替換型載體。,（一）完全基因敲除,a,5,基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制： 有些重要的靶基因被敲除后會引起胚胎早期死亡，使得無法分析該基因在胚胎發(fā)育晚期和成年期的功能；某些基因在不同的細胞類型中執(zhí)行不同的功能，完全敲除會導致突變小鼠出現(xiàn)復雜的表型，使研究者很難判斷異常的表型是由一種細胞引起的，還是由幾種細胞共同引起的。,a,6,（二）條件型基因敲除,條件型基因敲除法可定義為將某個基因的敲除限制于小鼠某些特定類型的細胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法。 該系統(tǒng)在80年代被引入后，已成功被應用于酵母菌、植物、哺乳動物細胞及小鼠身上。 現(xiàn)階段條件型基因敲除以噬菌體的C

4、re/Loxp系統(tǒng)和釀酒酵母的FLP/FRT系統(tǒng)應用最為廣泛。,a,7,Cre-LoxP重組酶系統(tǒng),Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)在新型基因打靶中獲得廣泛應用，是條件型基因打靶、誘導型基因打靶、時空特異性基因打靶策略的技術(shù)核心。,a,8,Cre-LoxP重組酶系統(tǒng),Cre重組酶：于1981年從P1噬菌體中發(fā)現(xiàn)，屬于 Int酶超基因家族。Cre重組酶基因編碼區(qū)序列全長1029bp（EMBL數(shù)據(jù)庫登錄號X03453），編碼38kDa蛋白質(zhì)。Cre 重組酶是一種由 343 個氨基酸組成的單體蛋白。它不僅具有催化活性，而且與限制酶相似，能識別特異的 DNA 序列，即 loxP 位點，使 loxP位點間的基

5、因序列被刪除或重組。Cre重組酶有70%的重組效率，不借助任何輔助因子，可作用于多種結(jié)構(gòu)的 DNA 底物，如線形、環(huán)狀甚至超螺旋 DNA。,a,9,Cre-LoxP重組酶系統(tǒng),LoxP（locus ofX-overP1）序列：來源于P1噬菌體，是有兩個13bp反向重復序列和中間間隔的8bp序列共同組成，8bp的間隔序列同時也確定了LoxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過程中與DNA共價結(jié)合，13bp的反向重復序列是Cre酶的結(jié)合域。其序列如下 ： 5 - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3 3 - TATTGAAGCATAT - TACA

6、TACG - ATATGCTTCAATA - 5,a,10,Cre-LoxP系統(tǒng)的特性,a,11,條件性基因敲除法可定義為將某個基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法。它實際上是在常規(guī)的基因敲除的基礎上，利用重組酶Cre介導的位點特異性重組技術(shù)，在對小鼠基因修飾的時空范圍上設置一個可調(diào)控的“按鈕”，從而使對小鼠基因組的修飾的范圍和時間處于一種可控狀態(tài)。,a,12,a,13,a,14,Cre/loxP系統(tǒng)作用原理示意圖,a,15,FLPFRT 系統(tǒng),該系統(tǒng)與CreloxP系統(tǒng)相同，也是由一個重組酶 和一段特殊的DNA序列組成。從進化的角度上考慮，F(xiàn)lp

7、FRT系統(tǒng)是CreloxP系統(tǒng)在真核細胞內(nèi)的同源系統(tǒng)。其中，重組酶Flp是酵母細胞內(nèi)的一個由423個氨基酸組成的單體蛋白。與Cre相似，F(xiàn)lp發(fā)揮作用也不需要任何輔助因子，同時在不同的條件下具有良好的穩(wěn)定性。該系統(tǒng)的另一個成分Flp識別位點(Flp recognition target，F(xiàn)RT)與loxP位點非常相似，同樣由兩個長度為13bp的反向重復序列和一個長度為8 bp的核心序列構(gòu)成。在該系統(tǒng)發(fā)揮作用時，F(xiàn)RT位點的方向決定了目的片段的缺失還是倒轉(zhuǎn)。這兩個系統(tǒng)比較明顯的區(qū)別是它們發(fā)揮作用的最佳溫度不同，Cre重組酶發(fā)揮作用的最佳溫度為37，而Flp重組酶為30。因此，CreloxP系統(tǒng)最

8、適宜在動物體內(nèi)使用。loxP和FRT位點的序列如圖所示,a,16,這一技術(shù)亦存在一些缺點： 費用太高 周期較長 許多基因在剔除后并未產(chǎn)生明顯的表型改變，可能是這些基因的功能為其他基因代償所致,條件型基因打靶的優(yōu)勢： 克服了重要基因被敲除所導致的早期致死 并能客觀、系統(tǒng)地研究基因在組織器官發(fā)生、發(fā)育以及疾病發(fā)生、治療過程中的作用和機制,a,17,（三）誘導型基因敲除,誘導型基因敲除法也是利用Cre/Loxp系統(tǒng)為基礎，利用控制Cre表達的啟動子的活性或所表達的Cre酶活性具有可誘導的特點，通過對誘導劑給予時間的控制從而在動物的一定發(fā)育階段和組織細胞中實現(xiàn)對特定基因的敲除。,a,18,由Cre/L

9、oxp系統(tǒng)和誘導系統(tǒng)兩個部分組成。Loxp轉(zhuǎn)基因動物是用常規(guī)基因打靶技術(shù)構(gòu)建成的，基因組中待修飾區(qū)域兩端各攜帶1個Loxp位點的轉(zhuǎn)基因動物。誘導系統(tǒng)是指所攜帶的Cre基因的表達或所表達的Cre的酶活性具有可誘導性的轉(zhuǎn)基因動物。人們可以通過對誘導劑給予時間的預先設計來對動物基因敲除的時空特異性進行人為控制，以避免出現(xiàn)死胎或動物出生后不久即死亡的現(xiàn)象。 常見的幾種誘導型基因敲除類型有：四環(huán)素誘導型；干擾素誘導型；激素誘導型；腺病毒介導型。,a,19,III、基因編輯技術(shù),ZFN系統(tǒng) TALEN系統(tǒng) CRISPR/Cas 系統(tǒng),a,20,（一）ZFN技術(shù)系統(tǒng),a,21,ZFN 技術(shù)原理,鋅指核酸酶（

10、Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸內(nèi)切酶，利用不同的鋅指結(jié)構(gòu)識別特異DNA序列，利用核酸酶切斷靶DNA。,鋅指結(jié)構(gòu)中每一個螺旋可以特異識別3-4個堿基； 人工設計識別特異DNA序列的螺旋采用如上的通用序列，通過改變其中7個X來實現(xiàn)識別不同的三聯(lián)體堿基，TGEK是多個螺旋間的連接序列； 構(gòu)建成對人工鋅指結(jié)構(gòu)域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定區(qū)域切斷DNA雙鏈。,a,22,單個ZFN的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域一般包含3-6個Cys2-His2鋅指結(jié)構(gòu)域，每個鋅指結(jié)構(gòu)域能特異識別1個三聯(lián)體堿基，與鋅指蛋白相連接的非特異性核酸內(nèi)切酶來自FokI的C端96個氨基酸

11、殘基組成的DNA剪切域，每個FokI單體與一個鋅指蛋白組相連構(gòu)成一個ZFN，識別特定的位點，但2個識別位點相距6-8bp距離時，2個單體ZFN相互作用產(chǎn)生酶切功能。在此特異位點產(chǎn)生1個DNA雙鏈切口，然后利用固有的同源重組或非同源末端連接修復機制進行切口修復。從而達到對精確位點進行定點修飾的目的。,a,23,ZFN 技術(shù),鋅指核酸酶介導的定向染色體刪除,研究人員可以利用ZFN技術(shù)進行各種基因編輯，比如基因敲除。已建立有ZFN庫，識別多種DNA序列，但還不能達到識別任意靶DNA的目的，其應用受到一定的限制。,a,24,ZFN技術(shù)已成功應用于黑長尾猴、大鼠、小鼠、中國倉鼠、斑馬魚、果蠅、海膽、家蠶

12、、擬南芥、煙草、玉米、豬、牛、人類iPS細胞等，此外，該技術(shù)已經(jīng)有用于治療HIV的ZFN藥物進入二期臨床實驗。 但是，該技術(shù)制備復雜，成本昂貴，而且其技術(shù)專利被少數(shù)幾家商業(yè)公司控制。,a,25,（二）,a,26,嶄新的技術(shù) - TALEN 經(jīng)典的挑戰(zhàn) 染色體DNA序列的人工編輯修改 （點）突變：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除，Knockout） 片段刪除 片段插入 目的與用途：生物模型；表達工具；基因治療,嶄新的技術(shù)解決經(jīng)典的挑戰(zhàn),a,27,靶向基因技術(shù),經(jīng)典方法 ： 自殺質(zhì)粒，同源重組 幾率低(1 HR event per 106 ce

13、lls），難！ 飽含希望與失望的技術(shù)： ZFN，被Sigma公司壟斷 新的里程碑： TALEN,a,28,TALEN技術(shù),基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases，類轉(zhuǎn)錄因子效應物核酸酶)的靶向基因敲除技術(shù)是一種嶄新的分子生物學工具，現(xiàn)已應用于細胞、酵母、斑馬魚與大鼠等各類研究對象。 技術(shù)原理： 表達一個重組核酸酶，在靶點識別結(jié)構(gòu)域的作用下，核酸酶識別靶點核酸序列，并發(fā)揮內(nèi)切酶活性，從而打斷目標基因，完成基因敲除的過程。,a,29,1989年 植物病原體黃單胞菌屬 （Xanthomonas spp.） avrB

14、s3 基因被克隆。 2007年 發(fā)現(xiàn)其序列特異性核酸結(jié)合特性， avrBs3 TA 2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列與核酸靶序列的對應關系被破譯 由34個aa組成一個單元模塊，重復17 -18次 34個aa中的第12和13個氨基酸（Repeat Variant Di-residue, RVD) 對應識別一個目標堿基,TALEN 發(fā)展過程,a,30,人工構(gòu)建TALE模塊識別指定核酸序列,102堿基模塊單元, 14 18個重復,真核表達,特異識別指定的14 -18 個核酸序列并與之結(jié)合,34氨基酸單元,a,31,TALEN 發(fā)展過程,a,32,TALEN (TALE+FOK I)

15、 表達質(zhì)粒對,TALEN 基因敲除,X 2,TALEN 表達質(zhì)粒對轉(zhuǎn)染、表達 切割靶位點,切割誘發(fā)DNA損傷修復機制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修過程中總是有一定的錯誤率存在。在修復中發(fā)生移碼突變錯誤的個體即形成目標基因敲除突變體,a,33,TALEN介導的同源重組,同源重組發(fā)生率升高幾個數(shù)量級,HR,Left arm,Right arm,Left arm,Right arm,點突變,片段刪除,基因敲入,a,34,2011年8月， Nature Biotechnology 上同時發(fā)表了用TALEN 技術(shù)進行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇綜述。 一

16、篇人類干細胞 Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases 一篇大鼠 Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs 兩篇斑馬魚 Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs 一篇綜述 Move over ZF

17、N,TALEN的最前沿,a,35,TALEN靶向（基因敲除）技術(shù) 基本流程,選擇、確定靶點 2. TALE識別模塊串聯(lián)構(gòu)建 3. TALEN真核表達質(zhì)粒構(gòu)建 4. TALEN真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入（卵）細胞，表達TALEN重組蛋白 5. 檢測突變效率，篩選（移碼）突變體,X 2,X 2,X 2,a,36,靶點的DNA序列特征： 相隔17-18bp的兩段14-18bp序列作為靶點 參考文獻：Cermak et al., Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DN

18、A targeting, Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 12, e82. 在線靶點選擇設計軟件：/node/add/talef-off/,選擇確定TALE靶點,a,37,TAL的核酸識別單元為34aa模塊中的雙連氨基酸（RVD） RVD與A、G、C、T有恒定的對應關系，即NI識別A，NG識別T，HD識別C，NN識別G，非常簡單明確 欲使TALEN特異識別某一核酸序列（靶點），只須按照靶點序列將相應TAL單元（14 -18個）串聯(lián)克隆即可。,TALE識別模塊串聯(lián)構(gòu)建,a,38,具專利

19、保護的克隆構(gòu)建系統(tǒng),a,39,具專利保護的克隆構(gòu)建系統(tǒng),步驟一：靶點識別單元串聯(lián),a,40,步驟二：TALEN表達質(zhì)粒構(gòu)建,具專利保護的克隆構(gòu)建系統(tǒng),a,41,將靶點識別模塊克隆入真核表達載體，得到Talen質(zhì)粒對 靶點識別模塊串接成功后需克隆入真核表達載體中。此真核表達載體含有TAL的其它必需結(jié)構(gòu)域并在C端融合有FokI序列。 目前，TALEN系統(tǒng)利用FokI的內(nèi)切酶活性打斷目標基因。因FokI需形成2聚體方能發(fā)揮活性，在實際操作中需在目標基因中選擇兩處相鄰（間隔17堿基）的靶序列（14 - 18個堿基）分別進行TAL識別模塊構(gòu)建。,X 2,真核表達TALEN質(zhì)粒對,a,42,步驟三. 將T

20、ALEN質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細胞中實現(xiàn)靶基因敲除 TALEN質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細胞后，其表達的融合蛋白即可分別找到其DNA靶位點并與靶位點特異結(jié)合。此時，兩個TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性，于兩個靶位點之間打斷目標基因。,FOKI 內(nèi)切酶打斷靶點區(qū),a,43,內(nèi)切酶的切割誘發(fā)DNA損傷修復機制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修過程中總是有一定的錯誤率存在。在修復中發(fā)生移碼突變錯誤的個體即形成目標基因敲除突變體。,突變體形成,a,44,PCR 酶切法 利用靶點設計時挑選的，位于相鄰靶位點之間的特異性內(nèi)切酶位點，進行PCR產(chǎn)物酶切

21、鑒定。 當左右靶點之間沒有合適的酶切位點時可使用CEL-I核酸酶檢測。 經(jīng)驗規(guī)律：= 2%可用，=10%很好,TALEN切割效率檢測,a,45,TALEN切割效率檢測,啟動子 ABCDEF stop-Target site - DEFHIJK,啟動子 ABCDEFHIJK,共轉(zhuǎn)染 熒光素酶檢測質(zhì)粒 + TALEN質(zhì)粒 1 + TALEN質(zhì)粒 2,熒光素酶檢測法,發(fā)光倍數(shù)與切割效率之間的定量關系尚缺乏充分研究。 有文獻表明，發(fā)光倍數(shù)達1.5至2倍即可有效獲得突變體。,a,46,突變體篩選,有限稀釋法獲得單細胞克隆 PCR-酶切法鑒定 PCR測序確認,a,47,基本工具質(zhì)粒,14 18bp靶點序列

22、,怎樣做TALEN,1單元模塊質(zhì)粒：A，G，C, T共4種 2單元模塊質(zhì)粒：4X4=16種 TALEN表達載體：基于PCS2質(zhì)粒2種,a,48,怎樣做TALEN,a,49,怎樣做TALEN,a,50,TALEN技術(shù)成功率影響因素,重組TALEN模塊與靶位點的 親合力 靶點序列設計原則來自20個天然TLAE的統(tǒng)計規(guī)律 細胞系固有特性 K562容易，293中等，MC-10困難 細胞轉(zhuǎn)染效率 不同細胞系轉(zhuǎn)染效率不同，293高， HeLa低 所期待的目標 Heterozygous？Homozygous？Exact point mutation？Selection marker insertion？,a

23、,51,TALE技術(shù)應用范圍,細菌：尚無報道，已另有多種高效靶向技術(shù)。 真菌：有報道，TALE原理可行。 植物：TALE原理發(fā)現(xiàn)于植物，需特定轉(zhuǎn)基因技術(shù)。 動物細胞：TALE原理可行，各細胞系效率不一。 斑馬魚：有TALEN基因敲除報道，尚無點突變與敲入報道。 小鼠、大鼠原理肯定可行，但尚無報道（技術(shù)太新，轉(zhuǎn)基因動物構(gòu)建實驗周期較長）。 TALEN應用擴展的技術(shù)關鍵： 切實可靠的表達系統(tǒng)。 高效的轉(zhuǎn)基因及克隆篩選技術(shù)。,a,52,TALEN的植物應用,Ting Li et. al. High-efficiency TALEN-based gene editing produces diseas

24、e resistant rice， volume 30 number 5 may 2012 Nature Biotechnology 背景 水稻病原菌 Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)導致細菌性白葉枯病。 細菌天然 TALE AvrXa7 or PthXo3 與水稻Os11N3基因 啟動子結(jié)合，調(diào)控（hijack）此基因上調(diào)表達，促進細胞內(nèi)糖份向細胞外轉(zhuǎn)運，便于病原菌利用。 策略 以TALEN對細菌TALE靶點區(qū)做突變，使細菌TALE無法與水稻Os11N3基因 啟動子結(jié)合。 結(jié)果 突變水稻獲得抵御細菌感染的能力,a,53,TALEN與主要類同技術(shù)比較,si

25、RNA 優(yōu)于TALEN 可瞬時轉(zhuǎn)染快速觀察效果 Knockdown效果確實，可用于必須基因 遜于TALEN 瞬時轉(zhuǎn)染效果短暫 不是徹底knockout 慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)發(fā)生染色體隨機整合 ZFN 優(yōu)于TALEN 經(jīng)驗積累多，技術(shù)較成熟 遜于TALEN 技術(shù)復雜，難度高，被Sigma公司壟斷 靶點序列要求高，難找 Off-targeting現(xiàn)象嚴重 經(jīng)常有顯著細胞毒性,a,54,基因組精密工程,今年來自梅奧醫(yī)學中心的研究人員第一次利用人工酶切割一段基因序列中的部分DNA，并用合成DNA取代它們，對斑馬魚基因組部分序列進行了定制修改。這種技術(shù)稱為轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶（transcription a

26、ctivator-like effector nucleases ，TALENs）方法，相比ZFNs和 morpholinos，TALENs具有幾個優(yōu)勢：它們更便宜、更有效，尤其是以一種開發(fā)活性形式應用時。ZFNs只能靶向特異序列，而TALENs有潛力對任何的DNA序列起作用。Morpholinos的效應是短暫的，而TALENs可造成永久性的改變。隨后科學家們在蟾蜍等其它動物中展開了這方面的研究，證明這種技術(shù)與已證實的基因靶向技術(shù)一樣有效。國內(nèi)清華大學的施一公和顏寧等人也于今年在Science雜志上報道了TALE特異識別DNA的分子機理，這提供了TALE蛋白的改造基礎，極大地拓寬了TALE蛋白

27、在生物技術(shù)應用上的前景。,a,55,2012年，TALEN被科學雜質(zhì)評為十大科學突破之一。,a,56,新技術(shù)介紹,（三）CRISPR-Cas系統(tǒng)基因修飾技術(shù) Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)9,a,57,Biotechnology: Rewriting a genome Nature 495, 5051 (07 March 2013) doi:10.1038/495050a,a,58,1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)：,1987年，日本大阪大學（O

28、saka University）在對E.coli K12編碼的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因進行研究時，發(fā)現(xiàn)在這個基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，這些片段是由簡單的重復序列組成的，而且在片段的兩端還存在一段不太長的特有的序列。2002年，科學家將其正式命名為Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)。 隨著基因組測序，發(fā)現(xiàn)90%的古細菌、40%的細菌基因組中含有CRISPR位點。有的甚至含有2-3個位點。 2013以后，研究者們在包括science和nature

29、 biotechnology等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹CRISPR-Cas系統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實現(xiàn)精確的基因修飾。,a,59,CRISPR-Cas主要由兩部分組成：,識別,切割,2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的組成：,CRISPR-Cas是很多細菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)，通過對入侵的病毒和核酸進行特異性的識別，利用Cas蛋白進行切割，從而達到對自身的免疫。,a,60,2.1 CRISPR位點的結(jié)構(gòu),CRISPR： （clustered regularly interspaced short palindromic repeats） CRISPR 是一個特殊的DNA

30、重復序列家族, 廣泛分布于細菌和古細菌基因組中。CRISPR 位點由一個前導區(qū)（leader）、多個高度保守的重復序列（repeat）和多個間隔區(qū)（spacer）組成，重復序列的長度通常 2148 bp, 間隔序列2672 bp (spacer) 。重復序列具有二重對稱性，部分間區(qū)序列與某些已知的質(zhì)粒、噬菌體序列相匹配。CRISPR就是通過這些間隔序列（space）與靶基因進行識別。,a,61,a,62,2.2 Cas家族,Cas（CRISPR associated）： 存在于CRISPR位點附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在guide RNA引導下對靶位點進行切割。它與folk酶功能類似，但

31、是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。,a,63,根據(jù)Cas 基因核心元件序列的不同, CRISPR/Cas 免疫系統(tǒng)被分為3 種類型：型、型和型。 型和型CRISPR/Cas 免疫系統(tǒng)需要多個Cas 蛋白形成復合體切割DNA 雙鏈, 而型CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)只需要一個Cas9 蛋白來切割DNA 雙鏈,目前型系統(tǒng)是被改造的最為成功的人工核酸酶。,a,64,CRISPR/Cas 的基因座結(jié)構(gòu)相對簡單。以產(chǎn)膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes SF370)的典型Type CRISPR/Cas 為例，其基因座結(jié)構(gòu)可分別三部分，5 端為tracrRNA 基因，中間為一系列Cas

32、蛋白編碼基因， 包括Cas9、Cas1、Cas2 和Csn2，3 端為CRISPR 基因座，由啟動子區(qū)域和眾多的間隔序列(spacers)和重復序列(direct repeats)順序排列組成。,3. Type CRISPR/Cas 系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及作用機理,a,65,crRNAs： CRISPR 位點的第一個重復序列上游有CRISPR 前導序列(Leader sequence),該前導序列可以作為啟動子, 啟動CRISPR 序列的轉(zhuǎn)錄。 多個研究表明CRISPR 基因座首先被轉(zhuǎn)錄成前體CRISPR RNA(pre-crRNA)，然后在Cas 蛋白或是核酸內(nèi)切酶的作用下被剪切成一些小的RNA 單元

33、，這些小RNA 即為成熟crRNA，由一個間隔序列和部分重復序列組成，被命名為CRISPRRNAs(crRNAs), 這些crRNA和Cas 蛋白共同參與 CRISPR 免疫防御過程 。,a,66,tracrRNA： 他們發(fā)現(xiàn)tracrRNA (trans-activating crRNA)對靶點的識別和切割是必需的，tracrRNA 的5 端與成熟的crRNA 3 端有部分序列(約13 bp)能夠配對進而形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，對維持crRNA 與靶點的配對可能十分重要。其指導RNase和Cas9 完成前體crRNA 的成熟，隨后tracrRNA 還能與成熟的crRNA 的重復序列配對形成RNA 二聚

34、體，進而和Cas9 蛋白結(jié)合成核糖核蛋白復合體，發(fā)揮識別和降解入侵的外源DNA 功能。 根據(jù)tracrRNA 與crRNA 的結(jié)構(gòu)特性，他們將tracrRNA 和crRNA 表達為一條嵌合的向?qū)NA(guide RNA， gRNA)， 并在體外證明gRNA 可以發(fā)揮tracrRNA 和crRNA 的功能，在目的基因處切割,形成DSBs, 該過程是CRISPR/Cas 對基因組進行編輯的基礎。,a,67,a,68,Cas9： 體外實驗證明Cas9 基因是參與CRISPR 免疫系統(tǒng)的唯一必需基因, Cas9 是由1 409 個氨基酸組成的多結(jié)構(gòu)域蛋白, 含有2 個核酸酶結(jié)構(gòu)域：氨基端的RuvC-

35、like 結(jié)構(gòu)域及位于蛋白中間位置的HNH 核酸酶結(jié)構(gòu)域, HNH 核酸酶結(jié)構(gòu)域可以切割與crRNA 互補配對的模板鏈, 切割位點位于原型間隔序列毗鄰基序(Protospacer adjacent motif, PAM)上游3nt 處,RuvC-like 結(jié)構(gòu)域可以對另一條鏈進行切割, 切割位點位于PAM 上游38nt 處。在crRNA 與tracrRNA 形成的雙鏈RNA 的指導下, Cas9 蛋白對靶位點進行切割。 此外，他們還證明，將RuvC 或是HNH 活性突變后Cas9 只有單鏈切割活性，類似于切口酶。,a,69,到目前為止, 雖然CRISPR/Cas 系統(tǒng)的詳細作用機制尚未完全闡明

36、, 但已基本明確了該作用機制的整個過程, 該過程大體分為3 個階段： 1. 在噬菌體入侵的起始階段, Cas 蛋白復合物靶向并裂解噬菌體基因組中的原型間隔序列(protospacer), protospacer接下來整合到宿主基因組的CRISPR 位點的5端; 2. 然后這些短的摻入的protospacer 被轉(zhuǎn)錄成crRNA; 3. 最后階段是在Cas 蛋白復合物的參與下, 靶向和干擾侵入的噬菌體DNA 序列。 當同種噬菌體再次入侵時, CRISPR的repeats 序列截取和保留的入侵噬菌體的某些DNA 片段形成spacers, spacers 會轉(zhuǎn)錄形成一些小的crRNA, 這些crRN

37、A 會與trans-activatingcrRNA(tracrRNA)形成一種雙鏈二級結(jié)構(gòu), 以此招募Cas 蛋白, crRNA、tracrRNA 以及Cas 蛋白形成復合體, 識別緊隨protospacer 序列后的PAM 序列,Cas 蛋白的核酸酶結(jié)構(gòu)域?qū)εccrRNA 互補的雙鏈DNA 進行切割, 從而使細菌具有對抗同類噬菌體再次入侵的能力。CRISPR 基因座在沒有受到外界壓力的情況下表達水平很低，當外源的質(zhì)粒或是噬菌體入侵宿主菌時CRISPR 的表達很快被誘導上調(diào)。,a,70,a,71,a,72,a,73,a,74,噬菌體或是質(zhì)粒上與間隔序列對應的序列被稱為protospacer，通常

38、protospacer 的5或是3 端延伸幾個堿基序列很保守， 被稱為PAM(protospacer adjacent motifs)，它的長度一般為25堿基，一般與protospacer 相隔14 堿基。 新間隔序列的獲得可能分為三步：首先識別入侵的核酸和掃描外源DNA 潛在的PAM，將臨近PAM 的序列作為候選protospacer；然后在CRISPR 基因座的5端合成重復序列；最后新的間隔序列整合到兩個重復序列之間。,a,75,a,76,4. CRISPR/Cas 系統(tǒng)的應用,CRISPR/Cas 系統(tǒng)的作用特性與限制性核酸內(nèi)切酶相似，它對序列的特異性切割主要依賴于crRNA 與Cas

39、蛋白形成的核糖核蛋白復合物識別靶序列上的PAM 以及protospacer 。 根據(jù)CRISPR/Cas 系統(tǒng)這一特性，將其用于設計人工的核酸內(nèi)切酶(engineered endonuclease，EEN)，用來對我們感興趣的基因位點進行修飾 三類CRISPR/Cas 系統(tǒng)中Type型系統(tǒng)的核糖核蛋白復合物相對簡單，除crRNA 和tracrRNA 外，只有Cas9 一個蛋白目前，產(chǎn)膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes SF370)的Type型系統(tǒng)是被改造的最為成功的人工核酸內(nèi)切酶，已經(jīng)在人類細胞、小鼠、斑馬魚中成功實現(xiàn)了基因組定點修飾。,a,77,a,78,4.1 CRISP

40、R-Cas系統(tǒng)靶向要求,最主要的要求： PAM（protospacer-adjacent motif）為NGG。,a,79,在人類基因組中，平均每8bp就出現(xiàn)一個NGG PAM。,a,80,a,81,4.2 Cas介導編輯模板替換,2013年1月29日在nature biotechnology上發(fā)表的RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems一文中，作者利用CRISPR-Cas系統(tǒng)用設計好的DNA模板替換的相應基因來達到基因的定向修飾。,a,82,a,83,4.3 Cas介導基因修飾,2013年1月29日在n

41、ature biotechnology上發(fā)表的efficient genome editing in zebra fish using a CRISPR-Cas system一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指導Cas9內(nèi)源性核酸酶對斑馬魚胚胎基因進行修飾。,a,84,a,85,a,86,Cas9,sg-RNA,a,87,2013年2月15日在science上發(fā)表的Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems一文中，作者利用一個包含兩個靶向不同基因的spacers的crRNA實現(xiàn)了同時對兩個基因進行編輯。,4.4 Cas介導雙

42、基因修飾,a,88,a,89,5 CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析,這是一項靶向基因修飾的革新技術(shù)，一項極具有可能獲得諾貝爾獎技術(shù)。,a,90,2013年4月12日在cell stem cell上發(fā)表的Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs一文中，作者利用TALENs和CRISPRs對同一基因進行修飾，效率分別為0%-34%和51%-79%。,a,91,而且從實際應用的角度來說，CRISPRs比TALENs更容易操作，因為每一對TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替換20個核苷酸就行。,a,92,只需合成一個s