7高效液相色譜法.ppt

1、2020/7/30,第二章高效液相色譜法,一、高效液相色譜法 的特點 二、流程及主要部件 三、影響分離的因素 四、高效液相色譜法 的主要分離類型,2020/7/30,液相色譜儀（1）,2020/7/30,液相色譜儀（2）,2020/7/30,液相色譜儀（3）,2020/7/30,液相色譜儀（4）,2020/7/30,液相色譜儀（5）,2020/7/30,一、高效液相色譜法的特點,特點：高壓、高效、高速 高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法。,2020/7/30,1高效液相色譜法與氣相色譜法比較,（1）應用范圍不同 氣相色譜僅能分析在操作溫度下能氣化而不分解的物質。據統(tǒng)計只有大約20

2、%的有機物能用氣相色譜分析；而液相色譜適合分子量較大、難氣化、不易揮發(fā)或對熱敏感的物質、離子型化合物及高聚物的分離分析，大約占有機物的70 80%。 （2）由于液體的擴散性比氣體的小105倍，因此，溶質在液相中的傳質速率慢，而在氣相色譜中氣體的傳質速率要快得多。,2020/7/30,（3）液相色譜能完成難度較高的分離工作,氣相色譜的流動相載氣是色譜惰性的，而在液相色譜中流動相液體也與固定相爭奪樣品分子，為提高選擇性增加了一個因素。 液相色譜固定相類型多，作為分析時選擇余地大；而氣相色譜并不可能的。 液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度，一般有利于色譜分離條件的選擇，而氣相色譜一般都在較高溫度下

3、進行的。,（4）液相色譜中制備樣品簡單，回收樣品也比較容易，而且回收是定量的，適合于大量制備。但液相色譜尚缺乏通用的檢測器，儀器比較復雜，價格昂貴。,2020/7/30,2高效液相色譜法與經典液相色譜法比較,高效液相色譜法比起經典液相色譜法的最大優(yōu)點在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。 例如對氨基酸分離，用經典色譜法需用20多小時才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需lh之內即可完成。 又如用25cm0.46cm的LichrosorbODS(5)的柱，采用梯度洗脫，可在不到0.5h內分離出尿中104個組分.,2020/7/30,小結,綜上所述，高效液相色譜法是吸取了氣相色譜與經典液相

4、色譜的優(yōu)點，具有高柱效、高選擇性、分析速度快、靈敏度高、重復性好、應用范圍廣等優(yōu)點。 目前高效液相色譜法已被廣泛應用于分析對生物學和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質，例如蛋白質、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質的分離和分析。 高效液相色譜法的儀器設備費用昂貴，操作嚴格，這是它的主要缺點。,2020/7/30,二、流程及主要部件,1.流程,高壓輸液系統(tǒng) 進樣系統(tǒng) 分離系統(tǒng) 檢測系統(tǒng) 數據處理系統(tǒng),2020/7/30,Agilent 1100 LC的主要部件,2020/7/30,2.主要部件,(1) 高壓輸液系統(tǒng) 主要部件之一，包括貯液裝置、高壓輸液泵、過濾器、脫氣裝置等 高壓

5、輸液泵壓力：150350105 Pa。 為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液體的流動相高速通過時，將產生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。 基本要求： 應具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn) 定可調、耐腐蝕等特性,2020/7/30,(2) 梯度淋洗裝置,外梯度: 利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。,內梯度: 一臺高壓泵, 通過比例調節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。,2020/7/30,(3) 進樣裝置,流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，也可配備自動進樣裝置。 其結構

6、如圖所示：,2020/7/30,(4) 高效分離系統(tǒng),色譜分離系統(tǒng)包括色譜柱、固定相和流動相。色譜柱是其核心部分，柱體為直型不銹鋼管，內徑16 mm，柱長540 cm。 發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。,2020/7/30,(5) 高效液相色譜檢測器,紫外光度檢測器（UVD）：最小檢測量10-9gmL-1，對流量和溫度的波動不敏感，可用于梯度洗脫。 最常用的檢測器。,2020/7/30,光電二極管陣列檢測器,光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。,2020/7/30,（6） 數據處理系統(tǒng),色譜工作站的功能： 色譜參數的選擇和

7、設定； 自動化操作儀器； 色譜數據的采集和存儲，并作“實時”處理； 對采集和存儲的數據進行后處理； 自動打印，給出一套完整的色譜分析數據和圖譜。 同時也可把一些常用色譜參數、操作程序，及各種定量計算方法存入存儲器中，需用時調出直接使用。,2020/7/30,2020/7/30,1. 固定相及分離柱,氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。 選擇合適的固定相，降低填料粒度可顯著提高柱效，但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術要求非常高的工作，一般很少自行制備。 選擇短柱、細內徑提高分析速度； 研制高效柱填料是一活躍領域。,三、影響分離的因素,2020/7/30,

8、2. 流動相及流動相的極性,（1）可顯著改變組分分離狀況的流動相選擇在液相色譜中顯得特別重要。 液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。 （2）親水性固定液常采用疏水性淋洗液，即淋洗液的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。 （3）若淋洗液的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。,2020/7/30,流動相組成,流動相按組成不同可分為單組分和多組分； 按極性可分為極性、弱極性、非極性； 按使用方式有固定組成淋洗和梯度淋洗。 常用溶劑: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元組合溶劑作

9、為流動相可以靈活調節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調整出峰時間。,2020/7/30,選擇流動相時應注意的幾個問題：,（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。,（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。,（3）試樣在流動相中應有適宜的溶解度，防止產生沉淀并在柱中沉積。,（4）流動相同時還應滿足檢測器的要求。當使用紫外檢測器時，流動相不應有紫外吸收。,2020/7/30,四、 高效液相色譜法的主要分離類型,1. 吸附色譜（液-固吸附色譜） “液-固色譜法”是利用各組分在固定相上吸附能

10、力的不同而將它們分離的方法。以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是510m的硅膠吸附劑。流動相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。 2. 分配色譜（液-液分配色譜） 早期通過在擔體上涂漬一薄層固定液制備固定相, 現多為化學鍵合固定相，即用化學反應的方法通過化學鍵將固定液結合在擔體表面。,2020/7/30,3. 離子交換色譜,固定相為離子交換樹脂，流動相為無機酸或無機堿的水溶液。各種離子根據它們與樹脂上的交換基團的交換能力的不同而得到分離。 可分離分析：核苷酸、碳水化合物、有機酸、蛋白質、酶等,4. 凝膠色譜（空間排阻色譜） 按分子尺寸的差異進行分離的一種液相色譜方法。以凝膠為固

11、定相。凝膠是一種經過交聯(lián)的、具有立體網狀結構和不同孔徑的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質凝膠。,2020/7/30,五、高效液相色譜法的應用,1. 在食品分析中的應用 1)食品營養(yǎng)成分分析：蛋白質、氨基酸、糖類等； 2)食品添加劑分析：防腐劑、著色劑等； 3)食品污染物分析：霉菌毒素等。 2. 在環(huán)境分析中的應用 多環(huán)芳烴（特別是稠環(huán)芳烴）、農藥殘留等。,2020/7/30,五、高效液相色譜法的應用,3. 在生命科學中的應用 1) 低分子量物質，如氨基酸、糖類、維生素等的分離和測定。 2) 高分子量物質，如蛋白質和酶的純化、分離和測定。 4. 在醫(yī)學檢驗中的應用 1）合成藥物：抗生