第七章基因芯片技術(shù)11.ppt

1、五十年代DNA分子結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制模型的建立， 六十年代基因編碼的確定， 七十年代限定性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和DNA重組技術(shù)的建立， 八十年代PCR的發(fā)明， 九十年代人類基因組計(jì)劃的實(shí)施。,分子生物學(xué)的發(fā)展推動(dòng)了基因的研究,1 基因芯片的誕生,生物科學(xué)正迅速地演變?yōu)橐婚T信息科學(xué)。 我們正由結(jié)構(gòu)基因組時(shí)代邁入功能基因組時(shí)代。隨著這個(gè)功能基因組學(xué)問(wèn)題的提出（后基因組時(shí)代，蛋白組學(xué)），涌現(xiàn)出許多功能強(qiáng)大的研究方法和研究工具，最突出的就是細(xì)胞蛋白質(zhì)二維凝膠電泳（2-D-gel）（及相應(yīng)的質(zhì)譜法測(cè)蛋白分子量）和基因芯片（Genechip）技術(shù),美國(guó)繼開(kāi)展人類基因組計(jì)劃以后，于1998年正式啟動(dòng)基因芯片計(jì)劃，美國(guó)

2、國(guó)立衛(wèi)生部、能源部、商業(yè)部、司法部、國(guó)防部、中央情報(bào)局等均參與了此項(xiàng)目。 同時(shí)斯坦福大學(xué)、麻省理工學(xué)院及部分國(guó)立實(shí)驗(yàn)室如Argonne Oakridge也參與了該項(xiàng)目的研究和開(kāi)發(fā)。 英國(guó)劍橋大學(xué)、歐亞公司正在從事該領(lǐng)域的研究。 世界大型制藥公司尤其對(duì)基因芯片技術(shù)用于基因多態(tài)性、疾病相關(guān)性、基因藥物開(kāi)發(fā)和合成或天然藥物篩選等領(lǐng)域感興趣，都已建立了或正在建立自己的芯片設(shè)備和技術(shù)。 目前全世界有幾百家基因芯片公司，有多種生物芯片問(wèn)世，而且這些芯片的特點(diǎn)較以前密度更高，檢測(cè)方法更精確，特異性更強(qiáng)的特點(diǎn)。而主要仍以少數(shù)幾家公司為主，如Affymetrix、Brax、Hysep等。 國(guó)內(nèi)目前主要如清華大學(xué)

3、（程京）、中科院生命科學(xué)院、上海復(fù)旦大學(xué)、北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、南京東南大學(xué)、西安等四十余家公司，而且可能還有一大批公司相繼成立。,基因芯片是信息時(shí)代的產(chǎn)物,橫跨： 生命科學(xué)、 物理學(xué)、 計(jì)算機(jī)科學(xué)、微電子技術(shù) 光電技術(shù)、 材料科學(xué) 等現(xiàn)代高科技,2. 什么是基因芯片,生物芯片，將大量生物識(shí)別分子按預(yù)先設(shè)置的排列固定于一種載體（如硅片、玻片及高聚物載體等）表面，利用生物分子的特意性親和反應(yīng)，如核酸雜交反應(yīng)，抗原抗體反應(yīng)等來(lái)分子各種生物分子存在的量的一種技術(shù)。 基因芯片（gene chip），又稱DNA微陣列（microarray），是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列所形成的探針陣列，其工作的基

4、本原理是通過(guò)雜交檢測(cè)信息。,生物芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、組織芯片。 而基因芯片中，最成功的是DNA芯片，即將無(wú)數(shù)預(yù)先設(shè)計(jì)好的寡核苷酸或cDNA在芯片上做成點(diǎn)陣，與樣品中同源核酸分子雜交的芯片。,生物芯片的分類,生物芯片的分類,根據(jù)用途還可以把生物芯片分為兩類：信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。,根據(jù)探針的類型和長(zhǎng)度，基因芯片可分為兩類。 其中一類是較長(zhǎng)的DNA探針（100mer）芯片 這類芯片的探針往往是PCR的產(chǎn)物，通過(guò)點(diǎn)樣方法將探針固定在芯片上，主要用于RNA的表達(dá)分析。 另一類是短的寡核苷酸探針芯片 其探針長(zhǎng)度

5、為25 mer左右，一般通過(guò)在片（原位）合成方法得到，這類芯片既可用于RNA的表達(dá)監(jiān)控，也可以用于核酸序列分析。,基因芯片,元件型微陣列芯片 生物電子芯片 凝膠元件微陣列芯片 藥物控釋芯片 通道型微陣列芯片 毛細(xì)管電泳芯片 PCR擴(kuò)增芯片 集成DNA分析芯片 毛細(xì)管電層析芯片 生物傳感芯片 光學(xué)纖維陣列芯片 白光干涉譜傳感芯片,基因芯片的類型,一般基因芯片按其材質(zhì)和功能，基本可分為以下幾類,小鼠基因表達(dá)譜芯片(MGEC)目前國(guó)內(nèi)基因芯片常見(jiàn)品種.(上海博星公司),癌癥相關(guān)基因表達(dá)譜芯片(CRGEC)目前國(guó)內(nèi)基因芯片常見(jiàn)品種.(上海博星公司),人類基因表達(dá)譜芯片(HGEC)目前國(guó)內(nèi)基因芯片常見(jiàn)品

6、種.(上海博星公司),6400點(diǎn)的基因芯片 （面積 12X14 mm),核酸雜交技術(shù) 是基因芯片應(yīng)用的基礎(chǔ)。,3. 基因芯片的原理,基因芯片的基本原理,任何線狀的單鏈DNA或RNA序列均可被分解為一個(gè)序列固定、錯(cuò)落而重疊的寡核苷酸，又稱亞序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5個(gè)8 nt亞序列：,這5個(gè)亞序列依次錯(cuò)開(kāi)一個(gè)堿基而重疊7個(gè)堿基。 亞序列中A、T、C、G 4個(gè)堿基自由組合而形成的所有可能的序列共有65536種。 假如只考慮完全互補(bǔ)的雜交，那么48個(gè)8 nt亞序列探針中，僅有上述5個(gè)能同靶DNA雜交。 可以用人工合成的已知序列的所有可能的n體

7、寡核苷酸探針與一個(gè)未知的熒光標(biāo)記DNA/RNA序列雜交，通過(guò)對(duì)雜交熒光信號(hào)檢測(cè)，檢出所有能與靶DNA雜交的寡核苷酸，從而推出靶DNA中的所有8 nt亞序列，最后由計(jì)算機(jī)對(duì)大量熒光信號(hào)的譜型（pattern）數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，重構(gòu)靶DNA 的互補(bǔ)寡核苷酸序列。,原理 - 通過(guò)雜交檢測(cè)信息,一組寡核苷酸探針,TATGCAATCTAG,CGTTAGAT,ACGTTAGA,ATACGTTAGATC,TACGTTAG,由雜交位置確定的一組,核酸探針序列,GTTAGATC,雜交探針組,TATGCAATCTAG,重組的互補(bǔ)序列,靶序列,TACGTTAG,ACGTTAGA,ATACGTTA,CGTTAGAT,GT

8、TAGATC,ATACGTTA,基因芯片,熒光標(biāo)記的樣品,共聚焦顯微鏡,獲取熒光圖象,雜交結(jié)果分析,探 針 設(shè) 計(jì),雜交,4. 基因芯片設(shè)計(jì),一、基因芯片設(shè)計(jì)的一般性原則 基因芯片設(shè)計(jì)主要包括兩個(gè)方面: 探針的設(shè)計(jì) 指如何選擇芯片上的探針 探針在芯片上的布局 指如何將探針排布在芯片上。,確定芯片所要檢測(cè)的目標(biāo)對(duì)象 查詢生物分子數(shù)據(jù)庫(kù) 取得相應(yīng)的DNA序列數(shù)據(jù) 序列對(duì)比分析 找出特征序列，作為芯片設(shè)計(jì)的參照序列。 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索 得到關(guān)于序列突變的信息及其它信息。,在進(jìn)行探針設(shè)計(jì)和布局時(shí)必須考慮以下幾個(gè)方面： (1)互補(bǔ)性 (2)敏感性和特異性 (3)容錯(cuò)性 (4)可靠性 (5)可控性 (6)可讀性

9、,、DNA變異檢測(cè)型芯片與基因表達(dá)型芯片的設(shè)計(jì),對(duì)于DNA序列變異分析，最基本的要求是能夠檢測(cè)出發(fā)生變異的位置，進(jìn)一步的要求是能夠發(fā)現(xiàn)發(fā)生了什么樣的變化。 從雜交的單堿基錯(cuò)配辨別能力來(lái)看，當(dāng)錯(cuò)配出現(xiàn)在探針中心時(shí)，辨別能力強(qiáng)，而當(dāng)錯(cuò)配出現(xiàn)在探針兩端時(shí)，辨別能力非常弱。所以，在設(shè)計(jì)檢測(cè)DNA序列變異的探針時(shí)，檢測(cè)變化點(diǎn)應(yīng)該對(duì)應(yīng)于探針的中心，以得到最大的分辨率。,、cDNA芯片與寡核苷酸芯片的設(shè)計(jì),cDNA芯片設(shè)計(jì)的關(guān)鍵在于數(shù)據(jù)庫(kù)的建立和數(shù)據(jù)庫(kù)信息的利用以及各種文庫(kù)的建立。 cDNA芯片制備方法一般采用點(diǎn)樣法，多用于基因表達(dá)的監(jiān)控和分析。 寡核苷酸芯片制備一般采用在片合成方法。優(yōu)化是寡核苷酸芯片設(shè)計(jì)

10、的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，包括探針的優(yōu)化和整個(gè)芯片設(shè)計(jì)結(jié)果的優(yōu)化。,、寡核苷酸探針的優(yōu)化設(shè)計(jì),基因芯片布局,雜 交 模 式,探 針 布 局 圖,Target T C C G T T A G C T G A C T G C,AGCT,TG變異,基因芯片使用步驟,芯片制作,把探針固定于載體表面,樣品處理,目標(biāo)分子富集,分子間的雜交,結(jié)果檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析,基因芯片的制作方式,原位合成,直接點(diǎn)樣,原位光蝕刻合成,原位噴印合成,分子印章法,針式點(diǎn)樣,噴墨點(diǎn)樣,光導(dǎo)原位合成法,1、原位光蝕刻合成,寡聚核苷酸原位光蝕刻合成技術(shù)是由Affymetrix公司開(kāi)發(fā)的，采用的技術(shù)原理是在合成堿基單體的5羥基末端連上一個(gè)光敏保護(hù)

11、基。合成的第一步是利用光照射使羥基端脫保護(hù)，然后一個(gè)5端保護(hù)的核苷酸單體連接上去，這個(gè)過(guò)程反復(fù)進(jìn)行直至合成完畢。使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長(zhǎng)。某一含n個(gè)核苷酸的寡聚核苷酸，通過(guò)4n個(gè)化學(xué)步驟能合成出4n個(gè)可能結(jié)構(gòu)。例如：一個(gè)完整的十核苷酸通過(guò)32個(gè)化學(xué)步驟，8個(gè)小時(shí)可能合成65,536個(gè)探針。,目前美國(guó)Affymetrix公司已有同時(shí)檢測(cè)6,500個(gè)已知人類基因的DNA芯片，并且正在制備含500,000-1,000,000個(gè)寡核苷酸探針的人類基因檢測(cè)芯片。該公司每月投入基因芯片研究的經(jīng)費(fèi)約100萬(wàn)美元。該產(chǎn)品不僅可用于基因表達(dá)分析和基因診斷

12、等，而且在大規(guī)模藥物開(kāi)發(fā)方面也具有誘人的前景。 目前，用于分子診斷的DNA芯片不僅已可用于檢測(cè)愛(ài)滋病病毒基因還可用于囊性纖維化（CF）、乳腺癌、卵巢癌等疾病相關(guān)基因的基因診斷。 鑒于光刻設(shè)備技術(shù)復(fù)雜，只能有專業(yè)化公司生產(chǎn)，加之成本高及合成效率不高的問(wèn)題，因此有待進(jìn)行以下研究：對(duì)光刻技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，提高合成效率；開(kāi)發(fā)新的原位合成技術(shù)，如噴印合成技術(shù)，該技術(shù)既能進(jìn)行原位合成又能進(jìn)行非原位合成。,2、光導(dǎo)原位合成法,是在經(jīng)過(guò)處理的載玻片表面鋪上一層連接分子（linker），其羥基上加有光敏保護(hù)基團(tuán)，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（photolithographic mask）保護(hù)不需要合成的部位，而暴

13、露合成部位，在光作用下去除羥基上的保護(hù)基團(tuán)，游離羥基，利用化學(xué)反應(yīng)加上第一個(gè)核苷酸，所加核苷酸種類及在芯片上的部位預(yù)先設(shè)定，所引入的核苷酸帶有光敏保護(hù)基團(tuán)，以便下一步合成。然后按上述方法在其它位點(diǎn)加上另外三種核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而N個(gè)核苷酸長(zhǎng)的芯片需要4N個(gè)步驟。每一個(gè)獨(dú)特序列的探針?lè)Q為一個(gè)“feature”，這樣的芯片便具有4N個(gè)“feature”，包含了全部長(zhǎng)度為N的核苷酸序列。 這種原位直接合成的方法無(wú)須制備處理克隆和PCR產(chǎn)物，但是每輪反應(yīng)所需設(shè)計(jì)的光柵則是主要的經(jīng)費(fèi)消耗。運(yùn)用這種方法制作的芯片密度可高達(dá)106探針/平方厘米，即探針間隔為 510m，但只能制作II型 DNA

14、芯片。,3、原位噴印合成,芯片原位噴印合成原理與噴墨打印類似，不過(guò)芯片噴印頭和墨盒有多個(gè)，墨盒中裝的是四種堿基等液體而不是碳粉。噴印頭可在整個(gè)芯片上移動(dòng)并根據(jù)芯片上不同位點(diǎn)探針的序列需要將特定的堿基噴印在芯片上特定位置。該技術(shù)采用的化學(xué)原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成一致，因此不特殊制備的化學(xué)試劑。,4、點(diǎn)樣法,點(diǎn)樣法是將合成好的探針、cDNA或基因組DNA通過(guò)特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片上。點(diǎn)樣分子可以是核酸也可以是寡核酸。 采用人工點(diǎn)樣的方法將寡核苷酸分子點(diǎn)樣于化學(xué)處理后的載玻片上，經(jīng)一定的化學(xué)方法處理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于載玻片上，制備好的DNA芯片可置于緩沖液中保存。 用多聚賴氨

15、酸包被固相支待物玻片，經(jīng)過(guò)分區(qū)后用計(jì)算機(jī)控制的微陣列點(diǎn)樣機(jī)按照預(yù)先設(shè)計(jì)順序點(diǎn)上核酸分子，點(diǎn)樣量很小，約為5nl。大規(guī)模CDNA芯片多采用這種方法，與其寡核苷酸微芯片相比。DNA芯片的潛在優(yōu)越性是具有更強(qiáng)的親和勢(shì)和特異性雜交，但是需要大量制備，純化，量化，分類PCR產(chǎn)物。,玻璃片基的處理：使玻璃表面獲得羥基、醛基、氨基等活性基團(tuán)。 點(diǎn)樣針沾取探針溶液。 點(diǎn)樣針把探針點(diǎn)到玻片表面，讓探針末端的化學(xué)集團(tuán)與玻片表面的集團(tuán)形成共價(jià)鍵。 針式點(diǎn)樣的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：成本低，操作簡(jiǎn)單，密度高（幾千-幾十萬(wàn)點(diǎn)/cm2)， 轉(zhuǎn)移過(guò)程中探針溶液損失小。 缺點(diǎn)：定量準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性不好,針式點(diǎn)樣,生產(chǎn)商 Bio-Rad

16、性能介紹 分辨率：1.25um(x，y軸)和0.25um(Z軸) ， 重復(fù)性：3um 球面精確性：l0um。一次制成芯片數(shù)：126塊芯片 每塊玻片點(diǎn)樣量82,000個(gè)點(diǎn),2202芯片點(diǎn)樣儀,噴墨點(diǎn)樣的方式類似于噴墨打印機(jī)。將合成用探針溶液放入打印墨盒內(nèi)，由電腦依據(jù)預(yù)定的程序在xyz方向自動(dòng)控制打印噴頭在芯片支持物上移動(dòng)，并根據(jù)芯片不同位點(diǎn)探針序列需要將特定的探針試劑（不足納升）噴印到特定位點(diǎn)。噴印上去的試劑即以固相合成原理與該處支持物發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。,噴墨點(diǎn)樣,分子印章法,根據(jù)陣列合成的要求設(shè)計(jì)并制作表面凹凸不平的分子印章，再按照合成的順序，將寡核苷酸合成試劑涂布在不同的印章上，逐個(gè)依次壓印到芯

17、片特定位點(diǎn)進(jìn)行合成反應(yīng)。合成的后續(xù)反應(yīng)與壓電打印類似。 分子印章法不僅可用于制備原位合成芯片，還可用于DNA微集陣列的制作。,DNA芯片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)包括5個(gè)過(guò)程,生物學(xué)問(wèn)題的提出和芯片設(shè)計(jì)； 樣品制備； 生物雜交反應(yīng)； 結(jié)果探測(cè)； 數(shù)據(jù)處理和建模。,1樣品制備。,一般所需mRNA的量是以一張表達(dá)譜芯片需要3g mRNA計(jì)算的,2 樣本采集過(guò)程關(guān)鍵點(diǎn),氰代磷酸二乙酯(DEPC),離體新鮮組織，切成多個(gè)1cm3小塊，剔除結(jié)締組織和脂肪組織。胃、腸組織應(yīng)剪除外膜；肝、腎、脾應(yīng)剪除門部血管神經(jīng)，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈）。 在RNase-Free 0.9生理

18、鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。 用鋁箔包裹組織，或用5ml凍存管裝載組織(但最好統(tǒng)一采用鋁箔)。用記號(hào)筆在鋁箔或凍存管外表寫明樣品編號(hào)，并貼上標(biāo)簽，迅速投入液氮冷卻。 填寫樣品登記表，寫明樣品名稱、種類、編號(hào)、取樣日期、樣品處理情況等將液氮冷卻的組織放入樣品袋（每個(gè)樣品袋只保存同樣的組織），袋口留一根編號(hào)繩，繩上粘一張標(biāo)簽紙（標(biāo)簽上注明：樣品名稱、編號(hào)、日期），迅速轉(zhuǎn)入便攜式液氮罐 保留1-2張取材部位的病理切片。,以上步驟應(yīng)在冰上進(jìn)行且不超過(guò)15分鐘，超過(guò)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致樣品的RNA降解。 對(duì)腫瘤組織的取材，要求盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，例如對(duì)于手術(shù)切除的整個(gè)或部分前列腺，可能要根據(jù)冰凍

19、切片報(bào)告的結(jié)果來(lái)判定要進(jìn)行研究的取材部位。,待分析基因在與芯片結(jié)合探針雜交之前必需進(jìn)行分離、擴(kuò)增及標(biāo)記。根據(jù)樣品來(lái)源、基因含量及檢測(cè)方法和分析目的不同，采用的基因分離、擴(kuò)增及標(biāo)記方法各異。當(dāng)然，常規(guī)的基因分離、擴(kuò)增及標(biāo)記技術(shù)完全可以采用，但操作繁瑣且費(fèi)時(shí)。 高度集成的微型樣品處理系統(tǒng)如細(xì)胞分離芯片及基因擴(kuò)增芯片等是實(shí)現(xiàn)上述目的的有效手段和發(fā)展方向。 為了獲得基因的雜交信號(hào)必須對(duì)目的基因進(jìn)行標(biāo)記，目前采用的最普遍的熒光標(biāo)記方法與傳統(tǒng)方法如體外轉(zhuǎn)錄、PCR、逆轉(zhuǎn)錄等原理上并無(wú)多大差異，只是采用的熒光素種類更多，這可以滿足不同來(lái)源樣品的平行分析。 用計(jì)算機(jī)控制的高分辨熒光掃描儀可獲得結(jié)合于芯片上目的

20、基因的熒光信號(hào)，通過(guò)計(jì)算機(jī)處理即可給出目的基因的結(jié)構(gòu)或表達(dá)信息。,雜交條件的選擇與研究目的有關(guān)，多態(tài)性分析或者基因測(cè)序時(shí)，每個(gè)核苷酸或突變位點(diǎn)都必須檢測(cè)出來(lái)。 通常設(shè)計(jì)出一套四種寡聚核苷酸，在靶序列上跨越每個(gè)位點(diǎn)，只在中央位點(diǎn)堿基有所不同，根據(jù)每套探針在某一特點(diǎn)位點(diǎn)的雜交嚴(yán)謹(jǐn)程度，即可測(cè)定出該堿基的種類。 如果芯片僅用于檢測(cè)基因表達(dá)，只需設(shè)計(jì)出針對(duì)基因中的特定區(qū)域的幾套寡聚核苷酸即可。 表達(dá)檢測(cè)需要長(zhǎng)的雜交時(shí)間，更高的嚴(yán)謹(jǐn)性，更高的樣品濃度和低溫度，這有利于增加檢測(cè)的特異性和低拷貝基因檢測(cè)的靈敏度。突變檢測(cè)，要鑒別出單堿基錯(cuò)配，需要更高的雜交嚴(yán)謹(jǐn)性和更短的時(shí)間。,雜交信號(hào)的檢測(cè)是DNA芯片技術(shù)

21、中的重要組成部分。 由于DNA芯片本身的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，需要確定雜交信號(hào)在芯片上的位置，尤其是大規(guī)模DNA芯片由于其面積小，密度大，點(diǎn)樣量很少，所以雜交信號(hào)較弱，需要使用光電倍增管或冷卻的電荷偶連照相機(jī)(charged-coupled device camera，CCD)攝像機(jī)等弱光信號(hào)探測(cè)裝置。 此外，大多數(shù)DNA芯片雜交信號(hào)譜型除了分布位點(diǎn)以外還需要確定每一點(diǎn)上的信號(hào)強(qiáng)度，以確定是完全雜交還是不完全雜交，因而探測(cè)方法的靈敏度及線性響應(yīng)也是非常重要的。 雜交信號(hào)探測(cè)系統(tǒng)主要包括雜交信號(hào)產(chǎn)生、信號(hào)收集及傳輸和信號(hào)處理及成像三個(gè)部分組成。,1熒光標(biāo)記雜交信號(hào)的檢測(cè)方法2生物素標(biāo)記方法中的雜交信號(hào)探測(cè)

22、,1熒光標(biāo)記雜交信號(hào)的檢測(cè)方法,（1）激光掃描熒光顯微鏡探測(cè)裝置比較典型。方法是將雜交后的芯片經(jīng)處理后固定在計(jì)算機(jī)控制的二維傳動(dòng)平臺(tái)上，并將一物鏡置于其上方，由氬離子激光器產(chǎn)生激發(fā)光經(jīng)濾波后通過(guò)物鏡聚焦到芯片表面，激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，光斑半徑約為510m。同時(shí)通過(guò)同一物鏡收集熒光信號(hào)經(jīng)另一濾波片濾波后，由冷卻的光電倍增管探測(cè)，經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換板轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)。通過(guò)計(jì)算機(jī)控制傳動(dòng)平臺(tái)XY方向上步進(jìn)平移，DNA芯片被逐點(diǎn)照射，所采集熒光信號(hào)構(gòu)成雜交信號(hào)譜型，送計(jì)算機(jī)分析處理，最后形成20m象素的圖像。這種方法分辨率高、圖像質(zhì)量較好，適用于各種主要類型的DNA芯片及大規(guī)模DNA芯片雜交信號(hào)檢測(cè)，廣泛應(yīng)

23、用于基因表達(dá)、基因診斷等方面研究。,(2)激光掃描共焦顯微鏡,激光掃描共焦顯微鏡與激光掃描熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)非常相似，但是由于采用了共焦技術(shù)因而更具優(yōu)越性。這種方法可以在熒光標(biāo)記分子與DNA芯片雜交的同時(shí)進(jìn)行雜交信號(hào)的探測(cè)，而無(wú)須清洗掉未雜交分子，從而簡(jiǎn)化了操作步驟大大提高了工作效率。通過(guò)計(jì)算機(jī)控制激光束或樣品池的移動(dòng)，便可實(shí)現(xiàn)對(duì)芯片的二維掃描，移動(dòng)步長(zhǎng)與芯片上寡核苷酸的間距匹配，在幾分鐘至幾十分鐘內(nèi)即可獲得熒光標(biāo)記雜交信號(hào)圖譜。其特點(diǎn)是靈敏度和分辨率較高，掃描時(shí)間長(zhǎng)，比較適合研究用?，F(xiàn)在 Affymetrix公司已推出商業(yè)化樣機(jī)，整套系統(tǒng)約 12萬(wàn)美元。,（3）采用了CCD相機(jī)的熒光顯微鏡,這種

24、探測(cè)裝置與以上的掃描方法都是基于熒光顯微鏡，但是以CCD相機(jī)作為信號(hào)接收器而不是光電倍增管，因而無(wú)須掃描傳動(dòng)平臺(tái)。由于采用了CCD相機(jī)，因而大大提高了獲取熒光圖像的速度，曝光時(shí)間可縮短至零點(diǎn)幾秒至十幾秒。其特點(diǎn)是掃描時(shí)間短，靈敏度和分辨率較低，比較適合臨床診斷用,（4）光纖傳感器,將 DNA芯片直接做在光纖維束的切面上（遠(yuǎn)端），光纖維束的另一端（近端）經(jīng)特制的耦合裝置耦合到熒光顯微鏡中。光纖維束由7根單模光纖組成。每根光纖的直徑為200m，兩端均經(jīng)化學(xué)方法拋光清潔。化學(xué)方法合成的寡核苷酸探針共價(jià)結(jié)合于每根光纖的遠(yuǎn)端組成寡核苷酸陣列。將光纖遠(yuǎn)端浸入到熒光標(biāo)記的靶分子溶液中與靶分子雜交，通過(guò)光纖維

25、束傳導(dǎo)來(lái)自熒光顯微鏡的激光（490urn），激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，仍用光纖維束傳導(dǎo)熒光信號(hào)返回到熒光顯微鏡，由CCD相機(jī)接收。 這種方法快速、便捷，可實(shí)時(shí)檢測(cè)DNA微陣列雜交情況而且具有較高的靈敏度，但由于光纖維束所含光纖數(shù)目有限，因而不便于制備大規(guī)模DNA芯片，有一定的應(yīng)用局限性。,2生物素標(biāo)記方法中的雜交信號(hào)探測(cè),以生物素（biotin）標(biāo)記樣品的方法由來(lái)已久，通常都要聯(lián)合使用其它大分子與抗生物素的結(jié)合物（如結(jié)合化學(xué)發(fā)光底物酶、熒光素等），再利用所結(jié)合大分子的特殊性質(zhì)得到最初的雜交信號(hào)，由于所選用的與抗生物素結(jié)合的分子種類繁多，因而檢測(cè)方法也更趨多樣化。特別是如果采用尼龍膜作為固相支持物

26、，直接以熒光標(biāo)記的探針用于DNA芯片雜交將受到很大的限制，因?yàn)樵谀猃埬ど蠠晒鈽?biāo)記信號(hào)信噪比較低。因而使用尼龍膜作為固相支持物的這些研究者大多是采用生物素標(biāo)記的。 目前應(yīng)用較多的是美國(guó)General Scanning公司開(kāi)發(fā)的基因芯片專用檢測(cè)系統(tǒng)(ScanArray 3000)，采用激光共聚焦掃描原理進(jìn)行熒光信號(hào)采集，由計(jì)算機(jī)處理熒光信號(hào)，并對(duì)每個(gè)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度數(shù)字化后進(jìn)行分析。近期又開(kāi)發(fā)出了ScanArray 5000，其掃描精度和功能有較大的提高。,9.結(jié)果的分析,樣品在被測(cè)定前，首先要經(jīng)過(guò)消化，使待測(cè)組織細(xì)胞中的DNA或RNA釋放出來(lái)，在經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增后，以熒光標(biāo)記物標(biāo)記，放入基因芯片自動(dòng)孵

27、育裝置中，由其自動(dòng)控制反應(yīng)的時(shí)間、溫度以及緩沖液的配比等反應(yīng)條件，進(jìn)行雜交。 雜交完成后，要對(duì)基因芯片進(jìn)行“讀片”，即應(yīng)用激光共聚焦熒光掃描顯微鏡，對(duì)基因芯片表面的每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。 檢測(cè)結(jié)合到芯片表面位點(diǎn)的樣品片斷的熒光標(biāo)記，而待測(cè)樣品中未與芯片上探針結(jié)合的熒光標(biāo)記物，則懸浮于溶液中，由于不在聚焦平面上，因而不被檢測(cè)。 樣品與探針的錯(cuò)配是影響雜交反應(yīng)結(jié)果的重要因素，但由于樣品與芯片上的探針正確配對(duì)時(shí)產(chǎn)生的熒光信號(hào)要比錯(cuò)配時(shí)強(qiáng)的多，因此，通過(guò)對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的分析，就可以區(qū)分正確與錯(cuò)誤的配對(duì)。,為了使結(jié)果的檢驗(yàn)更加簡(jiǎn)便和快速，Affymetrix的基因芯片的分析系統(tǒng)中采用了基因陣列掃描儀和專用的基因

28、芯片工作站，對(duì)一幅包含數(shù)萬(wàn)個(gè)探針位點(diǎn)的基因芯片圖樣的分析，僅需要數(shù)分鐘的時(shí)間。這樣在短短的幾十分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)，就可以完成用傳統(tǒng)方法需要數(shù)月才能完成的幾萬(wàn)乃至幾十萬(wàn)次雜交分析試驗(yàn)。,10.基因芯片的應(yīng)用,基因芯片具有 巨大的應(yīng)用前景 1. 基因功能分析研究 2. 檢測(cè)與疾病相關(guān)的基因, 進(jìn)而用于疾病診斷 3. 藥物篩選, 4. 檢測(cè)基因突變 5. 其他(環(huán)境化學(xué)毒物的篩選 體質(zhì)醫(yī)學(xué)的研究 ),基因功能分析研究,將成千上萬(wàn)個(gè)我們克隆到的特異性靶基因固定在一塊芯片上，對(duì)來(lái)源于不同個(gè)體不同組織不同細(xì)胞周期不同發(fā)育階段不同分化階段不同病變不同刺激（包括不同誘導(dǎo)不同治療手段）下細(xì)胞內(nèi)的mRNA或逆轉(zhuǎn)錄所得

29、的cDNA進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)這些基因表達(dá)的個(gè)體特異性組織特異性發(fā)育階段特異性分化階段特異性。進(jìn)行綜合評(píng)定與判斷，極大加快這些基因功能的確立。,檢測(cè)與疾病相關(guān)的基因, 進(jìn)而用于疾病診斷,目前主要涉及： 癌癥、 心血管疾病、 血液病、 遺傳性疾病、 神經(jīng)系統(tǒng)疾病、 部分感染性疾病、 免疫反應(yīng)相關(guān)性疾病 毒物引起的損傷等。,Golub et al, Science , 286 (5439): 531, Oct 15, 1999,用基因芯片研究PMA激活的內(nèi)皮細(xì)胞的早期應(yīng)答基因,藥物篩選,在基因功能研究基礎(chǔ)上，特別是確立了與某些疾病相關(guān)基因的表達(dá)變化情況后，就可針對(duì)疾病發(fā)生機(jī)理進(jìn)行藥物篩選工作。將這些基

30、因特異性片段固定在芯片上，研究病變組織和正常組只在某些藥物刺激下這些基因表達(dá)的變化，可快速判斷藥物作用的效果，并進(jìn)行高通量篩選（high throughout screening），可使新藥開(kāi)發(fā)獲得技術(shù)上的突破。,Evanse and Relling Science , 286 (5439): 487, Oct 15,1999,基因芯片可以幫助 中醫(yī)藥走向世界,研究天然藥物對(duì)人體的作用機(jī)制 篩選對(duì)人體有生物效應(yīng)的單味天然藥物 篩選對(duì)人體有生物效應(yīng)的有效成分 篩選對(duì)人體有生物效應(yīng)的天然藥物配方,1中藥的研究。尤其中藥中眾多成分中有效成分的篩選、有效藥物的篩選、中藥毒理學(xué)過(guò)程均被大大簡(jiǎn)化，將推動(dòng)中藥的迅猛發(fā)展。中藥學(xué)引入基因芯片技術(shù)，將大大推動(dòng)中藥研究的國(guó)際化進(jìn)程，為闡明中藥作用機(jī)理，具有無(wú)可估量的重要意義。,11. 基因芯片的發(fā)展方向,進(jìn)一步提高探針陣列的集成度，如有多家公司的芯片陣列的集成度已達(dá)1.0105左右，這樣基因數(shù)量在1.0105以下的生物體（大多數(shù)生物體）的基因表達(dá)情況只用一塊芯片即可包括。 提高檢測(cè)的靈敏度和特異性。如檢測(cè)系統(tǒng)的優(yōu)化組合和采用高靈敏度的熒光